高效液相色谱仪的定性定量分析未知样品中苯甲酸含量的测定
液相色谱分析混合样品中的苯和甲苯
华南师范大学实验报告课程名称仪器分析实验实验项目液相色谱分析混合样品中的苯和甲苯实验类型□验证□设计□综合实验时间2010 年 3 月31 日实验指导老师实验评分一、实验目的1.掌握高效液相色谱定性和定量分析的原理及方法；2.了解高效液相色谱的构造、原理及操作技术。
二、实验原理高效液相色谱由储液器，泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪等几部分组成。
储液器中的流动相被高压泵打入系统，样品溶液经进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱内。
由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数，在两相中作相对运动是，经过反复多次的吸附－解吸的分配过程，各组分在移动速度上产生较大的差别，被分离成单个组分依次从柱内流出，通过检测器时，样品浓度被转换成电信号传送到记录仪，记录成数据。
液相色谱的定性依据是保留时间的相对性，通常相对误差不能大于5%。
定量参数常常采用峰高、峰面积、相对峰高、相对峰面积等。
定量方法通常采用外标法、内标法和面积归一化法。
外标法为标准物质标准溶液制定标准曲线法；内标法为在标准溶液、样品溶液中加入内标物质，以相对峰高、相对面积对标准物质的浓度制定标准曲线；面积归一化法假定所有出峰物质的吸光系数相同，计算某物质的峰面积占所有峰面积的百分比。
三、仪器与试剂：1.仪器：SCL-10A vp紫外可见双波长检测器；SPD-M10A vp柱温箱；LC-10AT高效液相色谱仪；10μL微量注射器2.试剂：2μL/mL苯标液；2μL/mL甲苯标液；0.2μL/mL、2μL/mL、4μL/mL、10μL/mL的苯与甲苯的混合标准溶液；甲醇溶液；待测试样溶液四、实验内容与步骤：1.选择合适的流动相配比，优化色谱条件设置有关参数：控制流速为1mL/min。
柱温30℃，检测波长354nm。
设置流动相配比（甲醇：水=1：1），用10μL微量注射器注射5μL的10μL/mL苯与甲苯的混合标准溶液进行测定，观察其分离度和出峰时间。
高效液相色谱仪的定性、定量分析(未知样品中苯甲酸含量的测定)
一. 实验目的：
1. 学习高效液相色谱法的测定原理； 2.掌握高效液相色谱仪（HP1100）的定性、定量 分析方法。
二。实验原理： 高效液相色谱法是重要的色谱方法，是在经典液相色谱法 和气相色谱的基础上发展起来的，（经典液相色谱法使用粗粒 多孔固定相，装填在大口径、长玻璃管柱内，流动相仅靠重力 流经色谱柱，溶质在固定相的传质、扩散速度极其缓慢，柱入 口压力低，仅有低的柱效，分析时间长；气相色谱原理类似， 流动相为气体，只能分离小分子量、低沸点的有机化合物，配 合程序升温可分析高沸点的有机化合物。）弥补了经典液相色 谱法和气相色谱的缺点。它使用了多孔微粒固定相，装填在小 口径短的不锈钢柱内，流动相通过高压输液泵进入高压的色谱 柱，溶质在其中的传质、扩散速度大大加快，从而在短时间内 获得高的分离能力。可分析低分子量、低沸点的有机化合物， 更多适用于分析中、高分子量、高沸点及热稳定性差的有机化 合物。
三．仪器和试剂： 1． 高效液相色谱仪，VWD（254nm）检测仪。 2．色谱柱：C18 3．超声波发生器或水泵(用于过滤或排气) 4．注射器：50微升 5．容量瓶：100ml若干 6．移液管：2ml、4ml、8ml 7．流动相：甲醇：乙酸+乙酸氨（PH=3.5）=60：40， 制备前，先调节水(用酸或缓冲盐)的PH=3.5，进入系统 色谱前，用超声波发生器或水泵脱气。
四．实验步骤：（ESTD法） 1． 标准储备液的配置：准确量取0.144克苯甲酸钠试剂 ， 用 纯 水 或 去 离 子 水 溶 解 ， 定 容 到 100 毫 升 ， 浓 度 为 1.44mg/ml. 分别取此标准液5 ml，2.5 ml，1 ml, 0.5 ml稀 释为10 ml，则浓度分别为0.72 mg/ml，0.36 mg/ml，0.144 mg/ml，0.072 mg/ml。 2． 打开计算机，开仪器，稳定后，打开桌面的ONLINE 工作站。 设定方法：设置泵的流速为1ml/min，柱温为室温（ 40度左右），停止时间为4min，流动相比例（甲醇：水 =60；40），当流动相通过色谱柱约5-10min，记录仪上基 线稳定后，开始进样。 3． 进样：进样阀放在装载的位置上，用注射器取25微升 浓度最低的标准样（比进样阀上的定量环多5-10微升以上 ），注入进样阀中。
化妆品中苯甲酸及其盐的检测方法高效液相色谱法
附件11：化妆品中苯甲酸及其盐的检测方法高效液相色谱法1 范围本方法规定了采用高效液相色谱法测定化妆品中防腐剂苯甲酸（CAS：65-85-0）及其钠盐（以苯甲酸计）含量的方法。
本方法适用于膏霜、乳、液、粉类化妆品中苯甲酸及其钠盐的测定。
暂无实验数据表明本方法适用于蜡质类化妆品中苯甲酸及其钠盐含量的测定。
2 方法提要试样经酸化后，用乙醇和水的混合溶液，经水浴、超声提取，采用高效液相色谱仪分离，紫外检测器检测，根据保留时间定性，峰面积定量，以标准曲线法计算含量。
本方法的检出限为0.000225μg，定量下限为0.00075μg。
若取1.0g样品，本方法对苯甲酸的检出浓度为0.0001%；最低定量浓度为0.0004%。
必要时，采用气相色谱-质谱（GC/MS）确证。
3 试剂和材料除另有规定外，所用试剂均为分析纯,水为超纯水。
3.1 无水乙醇。
3.2 磷酸二氢钠。
3.3 磷酸。
3.4 硫酸。
3.5 硫酸〔c(1/2H2SO4) =2 mol/L〕：取6mL硫酸（3.4）缓缓注入100mL水中，冷却摇匀。
3.6 乙醇-水混合液：取90mL无水乙醇和10mL水混合摇匀。
3.7 磷酸二氢钠缓冲溶液（0.02mol/L，pH=2.2）：称取3.12g磷酸二氢钠，加水溶解并稀释至1000mL，用磷酸调pH值至2.2。
3.8 甲醇,色谱纯。
3.9 苯甲酸，纯度≥99.5%。
3.10 苯甲酸标准储备液［ （苯甲酸）=1.0g/L］：精密称取苯甲酸0.1000g于100mL 容量瓶中，用乙醇-水混合液（3.6）溶解并稀释至刻度，即得浓度为1.0mg/mL的苯甲酸标准储备溶液。
该储备液应在0℃～4℃冰箱冷藏保存。
3.11 系列浓度苯甲酸标准溶液：分别精密量取一定体积的苯甲酸标准储备溶液（3.10）于10mL量瓶中，以乙醇-水混合液（3.6）稀释并定容至刻度，得系列浓度为0.05mg/mL 、0.10mg/mL、0.20mg/ mL、0.30g/mL、0.40mg/mL、0.50mg/mL的标准溶液。
高效液相色谱法测定饮料中的苯甲酸
Cs为标准品浓度，mg/ml；
Ai为样品峰面积；
As为标准品峰面积。
二、高效液相色谱仪的组成
高效液相色谱仪由贮液罐、高压输液泵、进样装置、色谱柱、检测器、记录仪和数据处理器。
三、仪器与试剂
1、仪器
LC-2010高效液相色谱仪；色谱柱VP-ODS（4.6mm×15cm）；超声处理器；微量注射器。
6、实验结束时，先后用水和甲醇冲洗干净色谱柱，按要求关好仪器。
五、结果与处理
1、指出苯甲酸在样品色谱图中的位置。
根据苯甲酸样品在色谱图上的保留值，对的苯甲酸进行定性分析。
2、苯甲酸分离情况的分析。
根据苯甲酸的峰形对苯甲酸的分离情况进行分析，探讨合适的苯甲酸液相色谱分离条件。
3、根据苯甲酸样品和饮料样品中苯甲酸的峰面积，计算饮料样品中苯甲酸的含量。
4、饮料为什么需要进行超声处理，原因何在？
5、实验之前的流动相应该如何处理，为什么？
八、教学后记
六、注意事项
1、若样品和标准溶液需保存，应置于冰箱中。
2、为获得良好的结果，标准和样品的进样量要严格保持一致。
3、实验完毕后，应依次用水和甲醇冲洗干净色谱柱。
七、思考题
1、根据苯甲酸的结构式，苯甲酸能用离子色谱法分析吗？为什么？
2、如何对苯甲酸进行定性和定量分析，方法有哪些？
3、流动相不同比例的改变对分离结果有什么影响？原因何在？
检测器是检测采集被分离分析物质的重要因素。一个理想的液相色谱检测器应具备以下特征：灵敏度高；对所检测的物质具有快速的响应，并且响应对流动相流量和温度变化不敏感；不引起柱外谱带扩展；线性范围宽，适用的范围广。对于紫外检测器而言，应要求被分离分析的物质在紫外检测波长范围内有吸收，同时要求流动相在紫外区无吸收。由于苯甲酸的在230nm波长处有紫外吸收，同时甲醇和水所组成的混合流动相在该波长处无吸收，因此紫外检测器选择在230nm波长进行检测。
高效液相色谱法的应用
在药品分析鉴定的作用
3 在西药鉴别中的应用 在HPLC法中,保留时间与组分的结构和性质有关,是定性的参数,可用于药物的鉴别.如中 国药典收载的药物头孢羟氨苄的鉴别项下规定:在含量测定项下记录的色谱图中,供试品 主峰的保留时间应与对照品主峰的保留时间一致.头抱拉定,头孢噻酚钠等头孢类药物以 及地西泮注射液,曲安奈德注射液等多种药物均采用HPLC法进行鉴别. 4.在体内药物分析中的应用 HPLC由于测定迅速准确，流动相选择范围广，灵敏度高(10-12 g／mL以上)，填充柱种 类多，且可供选择的检测器也多。所以是实验室研究中一种很好的体内分析方法。在 国内外都很受重视．大多数药物都有紫外吸收，所以最常用的检测器是紫外检测器。 多数药物及内源性物质极性均较大，利用其极性差，可以采用RP-HPLC色谱柱，可获 得良好分离效果。
在药品分析鉴定的作用
1.天然药物分析 天然药物的来源有动物、植物和矿物之分，其中以植物类为主。由于天然药物的化学成 分复杂，其有效成分，可能有一个，也可以有多个，这对于控制药品质量，建立质量标 准来说比较困难，HPLC可通过对天然药物的有效成分进行式，可以判定药材的质量高低。 2..天然药物及复方成药分析 复方制剂、杂质或辅料干扰因素多的品种多采用高效液相色谱法。增免扶正片系由当 归、党参、黄芪（图3）等十几味天然药物精制而成，具有益气生津、活血养血、滋 补肝肾、健脾开胃之功效，主要用于抗缺氧、抗疲劳、抗衰老，长期服用可扶正祛邪 ，提高机体免疫功能，健身强体，益寿延年。该药对心、肝、脾、肾虚、纳差、心脑 血管疾病、神经衰弱、慢性肝炎、脂肪肝等都有较好的防治作用。 由于化学药品的开发费用昂贵，而且毒副作用大，近年来人们已把目光转向自然、民 族传统医药、草药、植物药等天然药物，据世界卫生组织统计，当前全世界60多亿人 口中80％的人使用过天然医药。在全世界药品市场中，天然物质制成的药品已占30％ ，国际上植物药市场份额已达300亿美元，且每年以20％ 以上的速度增长。HPLC分析 必定能为我国传统中医药实现现代化，走向世界提供强有力的技术支持。
高效液相色谱法测定苯甲酸的不确定度分析报告
食品（金标特级生抽）中苯甲酸含量测量不确定度评定报告报告编NT-BQ-2010-02编制：日期：年月日批准：日期：年月日济宁耐特食品有限公司品管部实验室食品（金标特级生抽）中苯甲酸含量测定测量不确定度评定报告一、概述1 •样品编号：100771 ;环境条件：温度20C ;相对湿度40%2. 检测仪器设备：2.1高效液相色谱仪Waters e2695设备编号SB-05-082,定量重复性0.7%;2.2分析天平XS105,设备编号SB-05-087,精细量程0~41g,最小分度值0.00001g, 0~50g 示值误差为±）.00001g；2.3 A级刻度吸管，1mL，允差为±0.007mL;2.4 A级容量瓶，100 mL，允差为±0.1mL;2.5 A级容量瓶，50mL ,允差为±）.05mL3. 检测试剂：3.1苯甲酸标准品：购自中国药品生物制品检定所；3.2乙酸铵（分析纯）、色谱级甲醇、超纯水。
4. 检测依据：GB/T5009.29-2003《食品中山梨酸、苯甲酸的测定》5. 检测人员：相丽新6. 检测时间：2010年12月02日二、检测原理依据GB/T5009.29-2003,样品经前处理后，进高效液相色谱仪，经反相色谱分离后，根据保留时间和峰面积进行定性和定量。
三、测量步骤3.1苯甲酸标准使用液的配制3.1.1标准贮备液将苯甲酸标准品从冰箱中取出放置到室温，准确称取50.0mg,置于100mL容量瓶中，用色谱甲醇溶解并定容，摇匀，冷藏于冰箱，作为标准品贮备液。
3.1.2 10ug/mL苯甲酸标准使用液将苯甲酸标准贮备液从冰箱中取出放置至室温，准确吸取1.00mL,至50mL容量瓶中，用50%甲醇水溶液定容，混匀后备用。
3.2样品前处理移取1mL金标特级生抽酱油于去皮烧杯中准确称量，先后加入超纯水，2%氢氧化钠溶液、10%硫酸铜溶液5mL,絮凝沉淀去除蛋白等杂质后，用超纯水定容至50mL，摇匀, 取适量样品于10000r/min的条件下高速离心3min，上清液经0.45um滤膜过滤后，作为待检测样品，同时做空白对照。
高效液相色谱法测定仙草及其加工产品中苯甲酸含量
高效液相色谱法测定仙草及其加工产品中苯甲酸含量何日安;陈祺;李和炳;刘建发;曹杰【摘要】应用三种不同溶剂对仙草及相关产品中苯甲酸进行提取,结果表明超纯水作为样品中苯甲酸提取溶剂较好;采用高效液相色谱仪、二极管阵列检测器检测对仙草及其加工产品中苯甲酸进行检测,结果表明方法检出限为1.25 mg/kg,样品加标回收率在86～112％间,相对标准偏差在1.53～4.35％间;通过对仙草干草和市场上销售的7个以仙草为主原料的产品进行苯甲酸检测,除一个未检出外,其余均含有一定量苯甲酸.【期刊名称】《广州化学》【年(卷),期】2015(040)001【总页数】4页(P68-71)【关键词】高效液相色谱;仙草;苯甲酸【作者】何日安;陈祺;李和炳;刘建发;曹杰【作者单位】钦州出入境检验检疫局,广西钦州535000;钦州出入境检验检疫局,广西钦州535000;钦州出入境检验检疫局,广西钦州535000;钦州出入境检验检疫局,广西钦州535000;钦州出入境检验检疫局,广西钦州535000【正文语种】中文【中图分类】O625.511;O657.72仙草（mesona chinensis benth），又名凉粉草、仙人草，为唇形科凉粉草，属一年生草本植物[1]。
在国内主要产于广东、福建、广西、江西、云南等省份。
国家卫生和计划委员会在2010年3月发布[2010年]第3号公告，允许仙草作为普通食品生产经营[2]，仙草被列入了中国食同源植物目录。
仙草作为重要的药用和食用植物资源，含有丰富的营养成分。
仙草全草干样含有约70% 碳水化合物，少量蛋白质、脂肪、色素等，还含有较多的矿物质元素，是一种重要的药食两用的植物资源[3]。
在本草中记载仙草的药用功效广泛，具有治疗肾脏病、糖尿病、关节肌肉疼痛、淋病，清暑、解热利水、消渴、降血压，抗衰老、抗癌等功能[4]，是天然、安全、保健、营养食品较理想的原料。
其加工利用价值也非常广泛，例如龟苓膏、仙草露、食用凉粉果胶等以仙草粉为主料，加多宝等凉茶饮料和其它一些牌子酸奶等饮料配表中也见含有仙草粉，对仙草粉的研究应用已成为热点。
高效液相色谱法测定酱油中苯甲酸的含量
高效液相色谱法测定酱油中苯甲酸的含量摘要：本文采用高效液相色谱法测定酱油中防腐剂苯甲酸的含量。
根据苯甲酸的性质选择分离分离色谱柱为 C18(4.6mm×250mm,粒径5μm)柱，流动相为乙酸铵-甲醇（91：9），流速1mL/min，柱温30℃。
当波长为230 nm时测得苯甲酸标准溶液的浓度与峰面积的线性关系良好，线性回归方程为y=3063.46746x＋0.4971，r2 = 0.9998。
一般实验要求加标回收率为90％-110％，苯甲酸检出限量为1g/kg。
实验测得加标回收率为96％-98％，三个样品的苯甲酸含量分别为0.39g/kg、0.50g/kg、0.81g/kg，均符合食品安全国家标准。
本实验方法简单快捷，准确度，灵敏度也均达到国家相关分析要求，适用于测定酱油中苯甲酸的测定。
关键词：高效液相色谱；酱油；防腐剂；苯甲酸为了减少防腐剂对人类带来的负面影响，对防腐剂进行一定的分析研究是很有必要的。
针对同一防腐剂的检测，不同的检测技术其特异性和快速性等也各有不同。
国家食品检测标准GB/T5009.29-2003《食品中山梨酸、苯甲酸的测定》介绍了三种检测苯甲酸的方法，分别是气相色谱法、高效液相色谱法和薄层色谱法。
此外据网上报道，可用于检测酱油中苯甲酸含量的方法还有紫外分光光度法、毛细管电泳法等。
因高效液相色谱法精确度高、简单、快速，是现阶段测定苯甲酸含量的首选。
现重点介绍高效液相色谱法测定酱油中的苯甲酸。
实验主要试剂及设备：甲醇（GR）；乙酸铵（GR）；苯甲酸钠标准品（GR）；乙酸锌（AR）；亚铁氰化钾（AR）；氨水（≥99.0％）。
高效液相色谱仪（LC-20ADRF）；电子分析天平（BSM--120.4）；超声波清洗仪（SG5200HDT）；高速离心机（TGL-16G-A）。
色谱条件：以C18柱（4.6mm×250mm,粒径5μm）为色谱柱；以A相1.54mg/mL乙酸铵溶液+B相甲醇溶液（91:9）为流动相；柱温：30℃；进样量：10μL；流速：1.0 mL/min；检测波长为230nm；检测器为紫外吸收检测器。
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一. 实验目的：
1. 学习高效液相色谱法的测定原理； 2.掌握高效液相色谱仪（HP1100）的定性、定量 分析方法。
二。实验原理： 高效液相色谱法是重要的色谱方法，是在经典液相色谱法 和气相色谱的基础上发展起来的，（经典液相色谱法使用粗粒 多孔固定相，装填在大口径、长玻璃管柱内，流动相仅靠重力 流经色谱柱，溶质在固定相的传质、扩散速度极其缓慢，柱入 口压力低，仅有低的柱效，分析时间长；气相色谱原理类似， 流动相为气体，只能分离小分子量、低沸点的有机化合物，配 合程序升温可分析高沸点的有机化合物。）弥补了经典液相色 谱法和气相色谱的缺点。它使用了多孔微粒固定相，装填在小 口径短的不锈钢柱内，流动相通过高压输液泵进入高压的色谱 柱，溶质在其中的传质、扩散速度大大加快，从而在短时间内 获得高的分离能力。可分析低分子量、低沸点的有机化合物， 更多适用于分析中、高分子量、高沸点及热稳定性差的有机化 合物。
四．实验步骤：（ESTD法） 1． 标准储备液的配置：准确量取0.144克苯甲酸钠试剂 ， 用 纯 水 或 去 离 子 水 溶 解 ， 定 容 到 100 毫 升 ， 浓 度 为 1.44mg/ml. 分别取此标准液5 ml，2.5 ml，1 ml, 0.5 ml稀 释为10 ml，则浓度分别为0.72 mg/ml，0.36 mg/ml，0.144 mg/ml，0.072 mg/ml。 2． 打开计算机，开仪器，稳定后，打开桌面的ONLINE 工作站。 设定方法：设置泵的流速为1ml/min，柱温为室温（ 40 度左右），停止时间为 4min ，流动相比例（甲醇：水 =60；40），当流动相通过色谱柱约5-10min，记录仪上基 线稳定后，开始进样。 3． 进样：进样阀放在装载的位置上，用注射器取25微升 浓度最低的标准样（比进样阀上的定量环多5-10微升以上 ），注入进样阀中。
（2）定量分析（EST 已配置浓度不同的苯甲酸标准溶液也进入色谱系统，绘制 浓度——峰面积的标准曲线。如流速和泵的压力在整个实 验过程中是恒定的，测定它们在色谱图上的保留时间 （ T0或保留距离）和峰面积A后，可直接用 T0 定性，用峰 面积作为定量测定的参数，注入未知样品后，得知未知样 品的峰面积，查标准曲线，求出未知样中的苯甲酸的含量 。
六．数据分析 1. 根据标准样品色谱图中的保留时间，找到并标出饮 料色谱图中的苯甲酸的色谱峰位置。 2．根据图11，12，13，14，15的浓度和峰面积，作苯 甲酸的标准曲线， 在标准曲线，求得未知中苯甲酸的浓 度。
七．问题讨论 1．用框架图画出HP1100液相色谱仪的构造流程。 2．用正相色谱柱可以进行苯甲酸的定性和定量分析吗？溶剂 怎么选取？ 3．在本实验中，用峰高h为定量基础的校正曲线能否得到苯 甲酸的精确结果？
4．进样阀从装载转向进样位，同时按进样按扭，工作站 开始记录并出图11。 5．苯甲酸的色谱峰出完后，按照4-5步骤连续操作四次， 获得从最低浓度到最高浓度的标准试液的五张色谱图，分 别为 11 ， 12 ， 13 ， 14 ， 15 （ 15 为流动相进样，设浓度为 0 mg/ml）。 6 ．按照 4-5 步骤取 25 微升的未知样品，进样，出谱图 W1 。
（1）定性分析： 液相色谱法可以分离有机化合物，在分配色谱中，组分在 色谱柱上的保留程度取决于它们在固定相和流动相中的分配系 数 K： K=（组分在固定相中的浓度）/（组分在流动相中的浓度） 显然，K值越大，组分在固定相上的停留时间越长，容易 理解：溶质流经色谱柱时，K值越大停留的时间也越长，K值 越小，停留的时间也越短，由于组分在固定相的K不同，就会 出现差速迁移，从而达到分离的目的。 一般情况下，当外界条件及方法确定，溶质流经色谱柱时 ，不同分配系数的物质流出色谱柱的时间不一致，在检测器上 得到响应，表现为出峰时间不一致，同一组分（K值固定）， 保留时间 To 一致，根据这个特性，可以分离不同的有机化合 物。
由于80%的有机化合物都可以用高效液相色谱法分析 ，目前已经广泛应用于生物工程、制药工业、食品工业、 环境检测、石油化工等行业。 根据使用的固定相及流动相的极性不同，分为正相 液相色谱和反相液相色谱：固定相为极性，流动相为非极 性的液相色谱色谱称为正相液相色谱（固定相为硅胶和氧 化镁，流动相为正己烷，醚等）；固定相为非极性，流动 相为极性的液相色谱色谱称为反相液相色谱（固定相为碳 粒和氧化铝，流动相为水、醇等）。
三．仪器和试剂： 1． 高效液相色谱仪，VWD（254nm）检测仪。 2．色谱柱：C18 3．超声波发生器或水泵(用于过滤或排气) 4．注射器：50微升 5．容量瓶：100ml若干 6．移液管：2ml、4ml、8ml 7．流动相：甲醇：乙酸 +乙酸氨（PH=3.5）=60：40， 制备前，先调节水(用酸或缓冲盐 )的PH=3.5，进入系统 色谱前，用超声波发生器或水泵脱气。