4 人工染色体载体
第四章 人工染色体载体
第4章 人工染色体载体黏粒载体 酵母人工染色体载体 细菌人工染色体载体 P1噬菌体载体和P1人工染色体载体表4-1 5种常见高容量克隆载体及其基本特性载体黏粒 P1 PAC BAC YAC容量（kb） 复制子30-45 70-100 130-150 120-300 250-400 ColE1 P1 P1 F ARS宿主拷贝数重组DNA导入 宿主的方式转导 转导 电转化 电转化 转化筛选标记— sacB sacB α-互补 ade2克隆DNA 获取方法 碱抽提大肠杆菌 高 大肠杆菌 1 大肠杆菌 1 大肠杆菌 1 酵母菌 1脉冲场电 泳14.1 黏粒载体4.1.1 黏粒的结构特征和用途o 黏粒（cosmid）是质粒的衍生物，是带有cos序 列的质粒。
cos序列是λ噬菌体DNA中将DNA包装 到噬菌体颗粒中所需的DNA序列。
o 黏粒的组成包括质粒复制起点（ColE1）、抗性 标记（ampr）、cos位点，因而能像质粒一样转 化和增殖。
o 它的大小一般5-7kb左右，用来克隆大片段 DNA，克隆的最大DNA片段可达45kb。
4.1.2 黏粒载体的 工作原理图4-1 黏粒载体 克隆 DNA的 一般原 理和步 骤24.1.3 黏粒克隆载体1．黏粒pJB8o 大小为5.4kb，由 ampr，ColE1复制 起点（ori）， cos位点，多克隆 位点组成，可容 纳33-46.5kb外源 DNA片段，主要用 来在细菌中克隆 真核DNA。
2．含双cos位点的黏粒载体o c2RB和 Supercos-1是 含双cos位点的 黏粒载体， c2RB大小为 6.8kb，含两个 cos位点，在 cos位点之间有 Kanr（图4-3）。
o 装载容量3346.5kb图4-3 黏粒载体c2RB图谱3图4-4 Supercos-1克隆 的原理和步骤o Supercos-1 大小为 7.94kb，含 有在真核细 胞中起作用 的来自猿猴 病毒SV40的 复制起点 ori-SV40和 新霉素抗性 基因 （neor）。
酵母人工染色体载体
YAC载体的复制元件是其核心组成成分，其在酵 母中复制的必须元件包括复制起点序列即自主复制序 列、用于有丝分裂和减数分裂功能的着丝粒（CEN） 和两个端粒（TEL）。这些元件能满足自主复制、染 色体在子代细胞间的分离及保持染色体稳定的需要。
7.HIS3EL)、DNA的复制起点 (ARS)和着丝粒(CEN)，以及必要的选择标记(TRP1等)基 因序列克隆到大肠杆菌质粒pBR322中，获得的重组质粒 就是YAC载体。
常用的YAC载体有3种，即pYAC3、pYAC4和pYAC5， 其差别主要是sup4基因上的克隆位点不同，分别为SnaBI、 EcoRI和NotI位点。
工作原理：
用BamH Ι酶切去除载体上的HIS3顺序，再用EcoR Ι 切开克隆位点，形成YAC的左右两臂，与外源大片段 DNA在该切点相连就形成一个大型人工酵母染色体，转 化到酵母细胞后可像染色体一样复制，并随细胞分裂到 子细胞中去，达到克隆大片段DNA的目的。外源DNA 的转载导致抑制基因SUP4插入失活，从而使重组菌形成 红色菌落，而载体自身连接转入到酵母细胞后所形成的 菌落为白色。
酵母人工染色体pYAC4上的基本功能单位有：
1.CEN4顺序，来源于酵母第4号染色 体的着丝粒顺序，它提供酵母着丝 粒正常功能的所有顺式调控信息， 可保证YAC在酵母细胞分裂时向两 极运动；
2.TEL顺序，来源于四膜虫大核中的 rDNA分子的末端，提供端粒形成顺 序，可保证YAC末端不被降解和重 组，且能够稳定地复制；
利用染色体的复制元件来驱动外源DNA片段复制的载体称 为人工染色体载体。其装载外源DNA片段的容量就可以与染色 体的大小媲美。
如酵母人工染色体载体，它将酵母菌染色体上的复制区、 分配区、稳定区与质粒组装在一起，即可构成染色体载体。当 大片段的外源DNA克隆在这些染色体载体上后，便形成重组人 造染色体，它能像天然染色体那样，在受体细胞中稳定的复制 并遗传。
大学基因工程复习归纳重点复习资料
基因工程复习归纳第一章绪论1.基因工程的定义：是指按照人们的愿望，经过严密的设计，将一种或多种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体/宿主）内，使之按照人们的意愿稳定遗传、并表达出新的性状的技术。
2.基因工程概念的发展：遗传工程→DNA重组技术→分子/基因克隆（Molecular/Gene→基因工程→基因操作。
应用领域以“基因工程”、“DNA重组”为主基因工程基因工程的历史性事件1973：Boyer和Cohen建立DNA重组技术1978：Genetech公司在大肠杆菌中表达出胰岛素1982：世界上第一个基因工程药物重组人胰岛素上市1988：PCR技术诞生1989：我国第一个基因工程药物rhIFNα1b上市2003: 世界上第一个基因治疗药物重组腺病毒-p53上市3.基因工程的三大关键元件基因（供体）：外源基因、目的基因载体：能将外源基因带入受体细胞，并能稳定遗传的DNA分子（克隆载体、表达载体）。
宿主（受体）：，能摄取外源DNA、并能使其稳定维持的细胞（组织、器官或个体）。
4.基因工程的基本步骤（切、接、转、增、检（大肠杆菌是中心角色）（1）目的基因的获取：从复杂的生物基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片断。
（2）重组体的制备：将目的基因的DNA片断插入到能自我复制并带有选择性标记（抗菌素抗性）的载体分子上。
（3）重组体的转化：将重组体（载体）转入适当的受体细胞中。
（4）克隆鉴定：挑选转化成功的细胞克隆（含有目的基因）。
（5）目的基因表达：使导入寄主细胞的目的基因表达出我们所需要的基因产物。
第二章 DNA重组克隆的单元操作一、用于核酸操作的工具酶1.限制性核酸内切酶(主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来DNA的入侵)。
限制性核酸内切酶的功能与类型其中II型限制性核酸内切酶：切割位点专一，适于DNA重组，是DNA重组中最常用工具酶。
第四章 人工染色体载体
yeast
一、YAC载体的复制元件和标记基因
1.复制必须成分
➢ 复制起点ori，自主复制序列ARS (autonomously replicating sequence)
➢ 着丝粒（CEN） 使染色体(chromosome)在分裂过程中能正确分配 到子细胞中有丝分裂(mitosis)中与纺锤丝 (spindle fiber)联系的那段DNA
4.感染E. coli：线状的重组DNA被注入细胞并通过cos 位点的环化，形成黏粒载体，象质粒(plasmid)一样 复制
在“染色体步查(chromosome walking)”过程 中染色体步查：chromosome walking 采用一段分离自某一重组体一端的非重复 DNA片段作为探针以鉴定含有相邻序列的重 组克隆。
mcs COS
BamHI酶切 CIP去磷酸
连接
包装 感染 铺平板 筛选 阳性克隆
大小：6.8 kb 可容纳35～45 kb的外源DNA片段
组成：含两个cos位点、抗性标记（ampr kanr）、 ori （ColE1复制起点）和4个多克隆位点(MCS)。
三、黏粒克隆载体
1.pJB8
简单黏粒
组成：抗性标记（ampr ）、 ori （ColE1复制起点） 、
cos位点和4个多克隆位点
大小：5.4kb 可容纳33-46.5kb外源DNA片段
➢对载体进行去磷酸化(dephosphorylation)处理， 否则易形成多联载体 ➢定向克隆(directed clone)
2. 混菌保存
混合单菌落，15%甘油，-70 C
生长平衡问题
3. 体内包装
人工染色体克隆载体
人工染色体克隆载体：是一种“穿梭”载体，含有质立载体所必备的第一受体内原质立复制起始位点，还含有第二受体染色体DNA着丝点、端粒和复制起始点的序列，以及合速的选择标记基因。
固体发酵：某些微生物升长需水很上少，可利用疏松而含有必需营养物的固体培养基进行发酵生产。
蛋白质工程：基因工程的基础上，结合蛋白质结晶学计算机辅助设计和蛋白质化学等多学科的基础知识，通过对基因的人工定向改造等手段，从而达到对蛋白质进行修饰改造拼接以生产能满足人类需要的新型蛋白质技术。
DNA疫苗：是利用可隆于载体上的抗原基因直接注射机体，被细胞摄取并在细胞内表达相应的抗原，通过不同途径诱导机体的特异免疫应答。
人工种子：它是一种含有植物胚状体或芽营养成分激素以及其他成分的人工胶囊。
发酵工程：利用微生物生长速度快生长条件简单以及代谢过程特殊等特点，再合适条件下，通过现代化工程技术手段，由微生物的某中特定功能生产出人类所需的产品。
生物传感器：是用生物活性物质做敏感器件，配以适当的换能器所构成的分析工具。
载体：把能够承载外源基因，并将其带人受体细胞得以稳定维持的DNA分子。
胚胎移植：是由产生胚胎的供体和养育胚胎的受体分工合作共同繁殖后代。
基因治疗：是利用遗传学的原理治疗人类的疾病。
细胞融合：两个或多个细胞相互接触后，其细胞膜发生分子重排，导致细胞合并染色体等遗传物质重组的过程。
花药培养：经过适当的诱导，花粉囊中的花粉可能去分化而发育成单倍体胚或愈伤组织，最终生产花粉植株。
原生质的融合概念：从同一个种或不同种分离得到的原生质体在适当的条件下融合得到细胞核物质和细胞质物质的混和。
固定化酶：指经物理或化学的方法处理,使酶变成不易随水流失即运动受限制,而又能发挥催化作用的酶制剂.基因克隆；是指在分子(DNA)水平上开展研究工作以获得大量的相同基因及其表达产物。
⊙生物技术有基因工程细胞工程酶工程发酵工程蛋白质工程基因工程包括目的基因分离与可隆载体重组转人受体细胞筛选和鉴定可隆子。
基因工程载体人工染色体载体
I
A
A
GTCACGTG
II 78-86bp
III
T TGTTTCTGNTTTCCGAAA
基因工程载体人工染色体载体
（2）端粒（TEL） 两个端粒序列Tel。 酵母端粒保守序列是(G4T2)n 重复序列。
（3）复制起点（ORI）
约100bp的自主复制序列（ARS）。 （真核生物中只有酵母菌有ARS）
基因工程载体人工染色体载体
• T-DNA区域内的所有基因与转移无关，所 以 将 致 瘤 基 因 全 部 缺 失 即 卸 甲 (disarmed) 后，将细菌抗生素的抗性基因或其它序列 插入到这个区域，形成的T-DNA仍可将RB 至LB内的序列转移并整合到植物基因组。
• Vir区的毒性基因是T-DNA转移所必需的， 毒 性 基 因 可 以 顺 式 及 反 式 两 种 方 式 控 制 TDNA转移。
基因工程载体人工染色体载体
Triparental mating
• An E.coli strain A carrying a helper plasmid able to mobilize the intermediate vector in trans
• The E.coli strain B carrying the recombinant intermediate vector
基因工程载体人工染色体载体
基因工程载体人工染色体载体
Structure of a bacterial artificial chromosome (BAC), used for cloning large fragments of donor DNA. CMR is a selectable marker for chloramphenicol resistance. oriS, repE, parA, and parB are F genes for replication and regulation of copy number. cosN is the cos site from l phage. HindIII and BamHI are cloning sites at which foreign DNA is inserted. The two promoters are for transcribing the inserted fragment. The NotI sites are used for cutting out the inserted fragment.
大肠杆菌的λ-噬菌体
•功能区：裂解相关S和R，复制相关O和P
3、感染周期（溶菌循环）
•λDNA复制早期：一个ori ，双向复制 •晚期：滚环复制--多个λDNA分子形成线状多联体
尾巴上的微丝可以把噬菌 体的DNA注入细菌内。
噬菌体或病毒的DNA能被开发
成为基因工程的有用载体，因为：
1.高效率的感染性能使外源基
因高效导入受体细胞；
2.自主复制繁殖性能使外源基
因在受体细胞中高效扩增。
大肠杆菌的λ-噬菌体
（一） λ-噬菌体的生物学特性 1、由外壳包装蛋白和λ-DNA组成 2、 λ-DNA的物理图谱
必须携带标记基因
经改造后只具有一个可供外源DNA插入的克隆位点,长度 为37kb，为包装的下限，它本身也能被包装，允许插入 片段最大为14kb.
取代型载体（substitution vector）
具有成对的克隆位点,空载的载体DNA只26kb，不能被包 装，无法进入受体细胞中去,不需要标记基因.
应用：
（1）功能相近的基因在基因组中聚集在一起 目前已经被确定的基因至少61种，一半为必需 基因
（2）线状双链DNA，两端各有一个12bp的互补单链 （粘性末端，cohesive-end site），称λcos site ，粘性末端粘连接变成环状DNA。
λco基因大致分为3个区：
cI基因：编码阻遏蛋白，是感染了λ噬菌体的寄主细胞进 入溶源化的必要条件。cI基因失活或缺失的λ噬菌体无法 使寄主细胞发生溶源化效应。
DNA重组技术一般需要噬菌体处于溶源状态。
λ噬菌体DNA的整合与删除：
第4章人工染色体载体
西南大学生物技术专业 基因工程
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二、粘粒载体的工作原理
粘粒载体的主要工作原理类似l噬菌体 载体。在外源片段与载体连接时，粘粒载体 相当于l噬菌体载体的左右臂， cos位点通过 粘段退火后，再于外源片段相间连接成多联 体。当多联体与l噬菌体包装的蛋白质混合时 l噬菌体A基因蛋白的末端酶功能将切割成两 个cos位点，并将两个同方cos位点之间的片 段包装到l噬菌体颗粒中去。
第四章 人工染色体载体
第一节 第二节 第三节 第四节
粘粒载体 酵母人工染色体载体 细菌人工染色体载体 P1噬菌体载体和P1人工染色体载体
本课件是在网络资源基西础南大上学改生物进技而术成专业，基在因此工程对有关人士特致感谢！ 1
常规载体在工作时都是在不影响质粒或 噬菌体复制功能的基础上装载外源DNA片段的， 同时保持质粒或噬菌体的基本特性。这样一 来，这些载体所装载的容量就受到限制。利 用染色体的复制元件来驱动外源DNA片段的载 体称为人工染色体载体，其装载外源DNA片段 的容量可以与 多个外源片段串联进入载体中 原料DNA片段短于200kb时，制备的目的DNA中相当一部分
的末端的一端不带酶切位点
总DNA纯度影响目的DNA的制备 西南大学生物技术专业 基因工程
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第节 细菌人工染色体载体
细菌人工染色体载体（bacterial artificial chromosome，BAC）：就是基于大肠杆菌的F 质粒构建的高容量低拷贝质粒载体。
F质粒：是一个约100kb的质粒，编码60多种参 与复制、分配和结合过程的蛋白质。
西南大学生物技术专业 基因工程
片段的装载导致抑制基因sup4插入失活，从而使重组菌形成
红色菌落；而载体自身连接转入到酵母细胞后所形成的菌落 为白色。
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l fragmen
有2个cos位点。
一、黏粒的结构特征和用途
能像l-DNA那样进行体外包装，并高效转染受
体细胞；
能像质粒那样在受体细胞中自主复制； 重组操作简便，筛选容易； 装载量大（45 kb）且克隆片段具有一定的大小 范围； 不能体内包装，不裂解受体细胞。
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二、 构建cosmid克隆载体的策略
够长时，两个cos位点可被A蛋白切割，产生具 有两个cos末端的重组λDNA分子，就能进行有 效的体外包装。
使用cosmid克隆载体的基本程序是：
先用一种限制性核酸内切酶切割cosmid克隆载体
DNA连接酶
具有两个cos位点的二联体线形DNA分子
限制性核酸内切酶
切割二联体线形DNA分子和部分切割待克隆的外源DNA片段
三、 cosmid克隆载体的特征
包括以下4个方面 ①构建的cosmid克隆载体是一种环形双链
DNA分子，—般在5--7kb。
②cosmid克隆载体具有质粒的性质。
cosmid克隆载体具有质粒的复制子，在大肠
杆菌细胞内按质粒复制的方式进行复制，具有转
化大肠杆菌的功能，并且在氨苄青霉素作用下，
同样也会获得扩增。
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人工染色体载体:
利用染色体的复制元件来驱动外源DNA片段复 制的载体称为人工染色体载体。
模拟染色体的复制方式，因此都能装载大片 段的DNA片段。
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目前常用的人造染色体载体包括：
细菌人工染色体载体（BAC） 酵母人工染色体载体（YAC） 黏粒载体（ cosmid ） P1人工染色体载体（PAC）
菌体容许包装的量计算，能承载的外源DNA片段
最大可达44.5 kb(即51 kb～6.5 kb)，最小的也有 29.9kb(即36.4kb～6.5kb)，所以用这样的cosmid 克隆载体能克隆40kb左右的外源DNA片段。
四、cosmid克隆载体的工作原理
cosmid克隆载体具有质粒克隆载体的性
根据λ噬菌体克隆载体和质粒克隆载体两者
的这些性质，取长去短，设计由质粒和含有cos位
点的这种λDNA片段组装成一类新的克隆载体， 即cosmid克隆载体。
由λDNA片段和pBR322 质粒DNA联合组成的。
cosmid 载 体 ---- pHC79
pBR322质粒(p43)
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黏粒它的大小一般 5-7kb 左
右，用来克隆大片段 DNA。 克隆的最大 DNA 片段可达
Apr PstI BamHI Tcr SalI
45kb。
①质粒复制起点（colE1） 象
pHC79 6400 bp ori cos
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质粒一样转化和增殖。
②抗性标记Ampr 。 ③ cos位点。有的粘粒载体含
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cosmid克隆载体通常也具抗菌素抗性基因， 作为重组体分子表型选择标记。其中有一些还带
上基因插入失活的克隆位点。
③具有λ噬菌体的特性。在此克隆载体上含有一
个cos位点。
cosmid克隆载体在克隆了合适长度的外源 DNA，并在体外包装成噬菌体颗粒之后，可以
高效地转导对λ噬菌体敏感的大肠杆菌寄主细胞。
用λ噬菌体基因组的cro—rⅡ的BglⅡ限制
片段，取代pBR322质粒DNA的位于1 459～1
666bp之间的Sau3A片段，产生出具有BglⅡ单
切割位点的重组体分子。 然后通过这个位点，将带有cos序列、长度 为1.78kb的λDNA之BglⅡ片段插入进去，于是
得到了pHC79柯斯质粒.
λDNA片段除了cos 位点之外，在其两侧还 具有与噬菌体包装有关 的DNA短序列； 质粒DNA部 分则是一个完整的 复制子。 克隆能力为31～ 45kb，而且能够被包 装成为具有感染性能 的噬菌体颗粒。
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第一节
黏粒（cosmid）载体
Apr PstI BamHI
1978年J.Collins和
B.Hohn等人发明
构建1.8 kb的l-DNA
片段 + pBR322片段
ori pHC79 6400 bp
Tcr SalI
装载范围为31 - 45
kb。
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cos
l fragment
进入寄主细胞之后的cosmid克隆载体DNA
分子，便按照λ噬菌体DNA同样的方式环化起
来。 但由于cosmid克隆载体并不含有λ噬菌体的全 部必要基因，因此它不能通过溶菌周期，无 法形成子代噬菌体颗粒。 外源片段克隆在黏粒载体中是以大肠杆菌菌 落的形式表现出来的，而不是噬菌斑。
④构建的cosmid克隆载体较小，因此能承载比较 大的外源DNA片段。 如果cosmid克隆载体的大小为6.5 kb，按入噬
DNA连接酶
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第一节
黏粒克隆载体
黏粒（cosmid）载体
Apr
（柯斯质粒载体）
实际上是质粒的衍 生物，是由英文 “ cos site-carrying plasmid”缩写而成
PstI
BamHI
Tcr SalI
pHC79 6400 bp ori cos
的，其原意是指带
cos位点的质粒。
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l fragment
ห้องสมุดไป่ตู้
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考斯质粒（cosmid）= 质粒+ cos序列。
它是用正常的质粒同λ
Apr
PstI
BamHI
Tcr SalI
噬菌体的cos位点构成。
cos序列是l噬菌体
ori
pHC79 6400 bp
DNA 中将DNA包装到噬 菌体颗粒中所需的DNA
序列。
cos
l fragment
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一、黏粒的结构特征和用途
作为λ噬菌体克隆载体，线形重组λDNA分 子两端必须各有一个cos末端。而cosmid克隆载 体只有一个cos位点，因此必须先对cosmid克隆 载体进行适当处理，构成具有两个cos位点的二 联体线形DNA分子。
当外源DNA片段组入二联体线形DNA分子，
并且两个cos位点之间的DNA核苷酸序列达到足
质，可以按一般质粒克隆载体进行操作，转
化受体细胞，可在受体细胞内进行自行复制。
实际上，使用cosmid克隆载体主要利用它 的λ噬菌体克隆载体性质。
因为cosmid克隆载体含有cos位点，可
承载大的DNA片段，进行体外包装后能高
效率转导受体细胞 。
使用cosmid克隆载体的程序与使用λ噬菌 体克隆载体的程序有所不同 。