4.人工染色体载体
第四章 人工染色体载体
第4章 人工染色体载体黏粒载体 酵母人工染色体载体 细菌人工染色体载体 P1噬菌体载体和P1人工染色体载体表4-1 5种常见高容量克隆载体及其基本特性载体黏粒 P1 PAC BAC YAC容量（kb） 复制子30-45 70-100 130-150 120-300 250-400 ColE1 P1 P1 F ARS宿主拷贝数重组DNA导入 宿主的方式转导 转导 电转化 电转化 转化筛选标记— sacB sacB α-互补 ade2克隆DNA 获取方法 碱抽提大肠杆菌 高 大肠杆菌 1 大肠杆菌 1 大肠杆菌 1 酵母菌 1脉冲场电 泳14.1 黏粒载体4.1.1 黏粒的结构特征和用途o 黏粒（cosmid）是质粒的衍生物，是带有cos序 列的质粒。
cos序列是λ噬菌体DNA中将DNA包装 到噬菌体颗粒中所需的DNA序列。
o 黏粒的组成包括质粒复制起点（ColE1）、抗性 标记（ampr）、cos位点，因而能像质粒一样转 化和增殖。
o 它的大小一般5-7kb左右，用来克隆大片段 DNA，克隆的最大DNA片段可达45kb。
4.1.2 黏粒载体的 工作原理图4-1 黏粒载体 克隆 DNA的 一般原 理和步 骤24.1.3 黏粒克隆载体1．黏粒pJB8o 大小为5.4kb，由 ampr，ColE1复制 起点（ori）， cos位点，多克隆 位点组成，可容 纳33-46.5kb外源 DNA片段，主要用 来在细菌中克隆 真核DNA。
2．含双cos位点的黏粒载体o c2RB和 Supercos-1是 含双cos位点的 黏粒载体， c2RB大小为 6.8kb，含两个 cos位点，在 cos位点之间有 Kanr（图4-3）。
o 装载容量3346.5kb图4-3 黏粒载体c2RB图谱3图4-4 Supercos-1克隆 的原理和步骤o Supercos-1 大小为 7.94kb，含 有在真核细 胞中起作用 的来自猿猴 病毒SV40的 复制起点 ori-SV40和 新霉素抗性 基因 （neor）。
4人工染色体载体
五、 cosmid克隆载体（自学P72）
❖ 常用的粘性粒有PHC79、PJB8、MUA-3和 KOSI等，它们大多具有一种或多种限制性 内切酶的单一酶切位点。采用这的 阳性检出率，而且极其适合高等真核基因 的克隆工作。
使用cosmid克隆载体的程序与使用λ噬菌 体克隆载体的程序有所不同 。
作为λ噬菌体克隆载体，线形重组λDNA分 子两端必须各有一个cos末端。而cosmid克隆载 体只有一个cos位点，因此必须先对cosmid克隆 载体进行适当处理，构成具有两个cos位点的二 联体线形DNA分子。
当外源DNA片段组入二联体线形DNA分子， 并且两个cos位点之间的DNA核苷酸序列达到足 够长时，两个cos位点可被A蛋白切割，产生具 有两个cos末端的重组λDNA分子，就能进行有 效的体外包装。
05.04.2021
27六、 构建cosmid应注意哪些问题❖ ①载体分子的自身连接，从而导致效率降低 或者失败。
载体自身只相当于可以插入片段的1/10左右
，因此往往会出现载体同载体自身连接，结
果在一个重组分子内可有几个柯斯质粒载体
连在一起。但用碱性磷酸酶处理，可阻止载
体分子自身连接；
05.04.2021
在成功构建pYAC4克隆载体的基础上，进一 步构建了人类人工染色体(HAC)克隆载体和哺乳 动物人工染色体(MAC)克隆载体。
选择标记--Sup4
❖ Sup4基因编码赭色抑制Trp-tRNA，抑制赭色 表型(成为白色)。
❖ 不含外源DNA片段的pYAC4载体转化酵母菌， 转化子的菌落呈白色。
❖ 带有插入的外源DNA片段的pYAC4重组载体， 其Sup4已经失活，结果转化酵母菌后所产生 的转化子形成赭色菌落。
酵母人工染色体载体
YAC载体的复制元件是其核心组成成分，其在酵 母中复制的必须元件包括复制起点序列即自主复制序 列、用于有丝分裂和减数分裂功能的着丝粒（CEN） 和两个端粒（TEL）。这些元件能满足自主复制、染 色体在子代细胞间的分离及保持染色体稳定的需要。
7.HIS3EL)、DNA的复制起点 (ARS)和着丝粒(CEN)，以及必要的选择标记(TRP1等)基 因序列克隆到大肠杆菌质粒pBR322中，获得的重组质粒 就是YAC载体。
常用的YAC载体有3种，即pYAC3、pYAC4和pYAC5， 其差别主要是sup4基因上的克隆位点不同，分别为SnaBI、 EcoRI和NotI位点。
工作原理：
用BamH Ι酶切去除载体上的HIS3顺序，再用EcoR Ι 切开克隆位点，形成YAC的左右两臂，与外源大片段 DNA在该切点相连就形成一个大型人工酵母染色体，转 化到酵母细胞后可像染色体一样复制，并随细胞分裂到 子细胞中去，达到克隆大片段DNA的目的。外源DNA 的转载导致抑制基因SUP4插入失活，从而使重组菌形成 红色菌落，而载体自身连接转入到酵母细胞后所形成的 菌落为白色。
酵母人工染色体pYAC4上的基本功能单位有：
1.CEN4顺序，来源于酵母第4号染色 体的着丝粒顺序，它提供酵母着丝 粒正常功能的所有顺式调控信息， 可保证YAC在酵母细胞分裂时向两 极运动；
2.TEL顺序，来源于四膜虫大核中的 rDNA分子的末端，提供端粒形成顺 序，可保证YAC末端不被降解和重 组，且能够稳定地复制；
利用染色体的复制元件来驱动外源DNA片段复制的载体称 为人工染色体载体。其装载外源DNA片段的容量就可以与染色 体的大小媲美。
如酵母人工染色体载体，它将酵母菌染色体上的复制区、 分配区、稳定区与质粒组装在一起，即可构成染色体载体。当 大片段的外源DNA克隆在这些染色体载体上后，便形成重组人 造染色体，它能像天然染色体那样，在受体细胞中稳定的复制 并遗传。
基因工程名词解释
基因工程名词解释1、基因工程：对不同的遗传物质在体外进行剪切、组合和拼接，使遗传物质重新组合，然后通过载体转入微生物、植物和动物细胞内，进行无性繁殖，并使所需的基因在细胞中表达，产生人类所需的产物或新生物类型。
2、重组DNA技术：是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后再转入另一个生物体（受体）内，按照人们的意愿稳定遗传并表达新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术。
3、基因xx：经无性繁殖获得基因许多相同拷贝的过程。
通常是将单个基因导入宿主细胞中复制而成。
（包括把来自不同生物的基因同有自主复制能力的载体DNA在体外人工连接，构建成新的重组的DNA，然后送入受体生物中去表达。
从而产生遗传物质和状态的转移和重新组合。
）4、限制性内切核酸酶：一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸水解酶。
5、修饰酶：体内有些酶可在其他酶的作用下，将酶的结构进行共价修饰，使该酶活性发生改变，这种调节称为共价修饰调节(covalentmodificationregulation)，这类酶称为修饰酶(prosessing enzyme)。
6、同裂酶：识别相同序列的限制酶称同裂酶，但它们的切割位点可能不同。
（同序同切酶、同序异切酶、“同功多位”等）7、同尾酶：切割不同的DNA片段但产生相同的粘性末端的一类限制性内切酶。
8、位点偏爱：某些限制酶对同一底物中的有些位点表现出偏爱性切割，即对不同位置的同一个识别序列表现出不同切割效率。
9、星星活性：极端非标准反应条件下，限制酶能够切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称星星活性。
10、甲基化酶：原核生物甲基化酶是作为限制与修饰系统中的一员，用于保护宿主DNA不被相应的限制酶所切割。
11、DNA聚合酶：以DNA为复制模板，从将DNA由5'端点开始复制到3'端的酶。
DNA聚合酶的主要活性是催化DNA的合成（在具备模板、引物、dNTP等的情况下）及其相辅的活性。
第四章 人工染色体载体
yeast
一、YAC载体的复制元件和标记基因
1.复制必须成分
➢ 复制起点ori，自主复制序列ARS (autonomously replicating sequence)
➢ 着丝粒（CEN） 使染色体(chromosome)在分裂过程中能正确分配 到子细胞中有丝分裂(mitosis)中与纺锤丝 (spindle fiber)联系的那段DNA
4.感染E. coli：线状的重组DNA被注入细胞并通过cos 位点的环化，形成黏粒载体，象质粒(plasmid)一样 复制
在“染色体步查(chromosome walking)”过程 中染色体步查：chromosome walking 采用一段分离自某一重组体一端的非重复 DNA片段作为探针以鉴定含有相邻序列的重 组克隆。
mcs COS
BamHI酶切 CIP去磷酸
连接
包装 感染 铺平板 筛选 阳性克隆
大小：6.8 kb 可容纳35～45 kb的外源DNA片段
组成：含两个cos位点、抗性标记（ampr kanr）、 ori （ColE1复制起点）和4个多克隆位点(MCS)。
三、黏粒克隆载体
1.pJB8
简单黏粒
组成：抗性标记（ampr ）、 ori （ColE1复制起点） 、
cos位点和4个多克隆位点
大小：5.4kb 可容纳33-46.5kb外源DNA片段
➢对载体进行去磷酸化(dephosphorylation)处理， 否则易形成多联载体 ➢定向克隆(directed clone)
2. 混菌保存
混合单菌落，15%甘油，-70 C
生长平衡问题
3. 体内包装
人工染色体克隆载体
人工染色体克隆载体：是一种“穿梭”载体，含有质立载体所必备的第一受体内原质立复制起始位点，还含有第二受体染色体DNA着丝点、端粒和复制起始点的序列，以及合速的选择标记基因。
固体发酵：某些微生物升长需水很上少，可利用疏松而含有必需营养物的固体培养基进行发酵生产。
蛋白质工程：基因工程的基础上，结合蛋白质结晶学计算机辅助设计和蛋白质化学等多学科的基础知识，通过对基因的人工定向改造等手段，从而达到对蛋白质进行修饰改造拼接以生产能满足人类需要的新型蛋白质技术。
DNA疫苗：是利用可隆于载体上的抗原基因直接注射机体，被细胞摄取并在细胞内表达相应的抗原，通过不同途径诱导机体的特异免疫应答。
人工种子：它是一种含有植物胚状体或芽营养成分激素以及其他成分的人工胶囊。
发酵工程：利用微生物生长速度快生长条件简单以及代谢过程特殊等特点，再合适条件下，通过现代化工程技术手段，由微生物的某中特定功能生产出人类所需的产品。
生物传感器：是用生物活性物质做敏感器件，配以适当的换能器所构成的分析工具。
载体：把能够承载外源基因，并将其带人受体细胞得以稳定维持的DNA分子。
胚胎移植：是由产生胚胎的供体和养育胚胎的受体分工合作共同繁殖后代。
基因治疗：是利用遗传学的原理治疗人类的疾病。
细胞融合：两个或多个细胞相互接触后，其细胞膜发生分子重排，导致细胞合并染色体等遗传物质重组的过程。
花药培养：经过适当的诱导，花粉囊中的花粉可能去分化而发育成单倍体胚或愈伤组织，最终生产花粉植株。
原生质的融合概念：从同一个种或不同种分离得到的原生质体在适当的条件下融合得到细胞核物质和细胞质物质的混和。
固定化酶：指经物理或化学的方法处理,使酶变成不易随水流失即运动受限制,而又能发挥催化作用的酶制剂.基因克隆；是指在分子(DNA)水平上开展研究工作以获得大量的相同基因及其表达产物。
⊙生物技术有基因工程细胞工程酶工程发酵工程蛋白质工程基因工程包括目的基因分离与可隆载体重组转人受体细胞筛选和鉴定可隆子。
大肠杆菌的λ-噬菌体
•功能区：裂解相关S和R，复制相关O和P
3、感染周期（溶菌循环）
•λDNA复制早期：一个ori ，双向复制 •晚期：滚环复制--多个λDNA分子形成线状多联体
尾巴上的微丝可以把噬菌 体的DNA注入细菌内。
噬菌体或病毒的DNA能被开发
成为基因工程的有用载体，因为：
1.高效率的感染性能使外源基
因高效导入受体细胞；
2.自主复制繁殖性能使外源基
因在受体细胞中高效扩增。
大肠杆菌的λ-噬菌体
（一） λ-噬菌体的生物学特性 1、由外壳包装蛋白和λ-DNA组成 2、 λ-DNA的物理图谱
必须携带标记基因
经改造后只具有一个可供外源DNA插入的克隆位点,长度 为37kb，为包装的下限，它本身也能被包装，允许插入 片段最大为14kb.
取代型载体（substitution vector）
具有成对的克隆位点,空载的载体DNA只26kb，不能被包 装，无法进入受体细胞中去,不需要标记基因.
应用：
（1）功能相近的基因在基因组中聚集在一起 目前已经被确定的基因至少61种，一半为必需 基因
（2）线状双链DNA，两端各有一个12bp的互补单链 （粘性末端，cohesive-end site），称λcos site ，粘性末端粘连接变成环状DNA。
λco基因大致分为3个区：
cI基因：编码阻遏蛋白，是感染了λ噬菌体的寄主细胞进 入溶源化的必要条件。cI基因失活或缺失的λ噬菌体无法 使寄主细胞发生溶源化效应。
DNA重组技术一般需要噬菌体处于溶源状态。
λ噬菌体DNA的整合与删除：
人工染色体载体名词解释
人工染色体载体名词解释
人工染色体载体是一种带有特定功能的DNA分子，用于在实验室中携带和传递外源基因或其他遗传物质。
它是通过基因工程技术构建的，通常由一段核酸序列组成，包括宿主微生物所需的基本元素，如起始子、启动子、终止子以及复制和稳定性元件。
人工染色体载体可以在细胞中自主复制和传递，并能够稳定地继承和表达携带的外源基因。
不同类型的人工染色体载体具有不同的设计目的和特点，可以用于基因治疗、基因组编辑、产生转基因动物、研究基因组功能等领域。
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YAC具有自主复制
序列、克隆位点以及可在
细菌和酵母菌中选择的标 记基因。此外，YAC还具
pYAC4
EcoRI CEN4
URA3
有酵母菌染色体的一些特
点。可以接受100-1000kb 的外源DNA片段。
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写而成的，其原意是
指带cos位点的质粒。
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l fragment
10
考斯质粒（cosmid）= 质粒+ cos序列。
它是用正常的质粒同λ
Apr
PstI
BamHI
Tcr SalI
噬菌体的cos位点构成。
pHC79
cos序列是l噬菌体DNA
ori
6400 bp
中将DNA包装到噬菌体 颗粒中所需的DNA序列。
配区、稳定区与质粒组装在一起，即可构成染色
体载体。当大片段的外源DNA克隆在这些染色体 载体上后，便形成重组人造染色体，它能像天然 染色体那样，在受体细胞中稳定的复制并遗传。
细菌人造染色体（BAC）
酵母人造染色体（YAC）
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2014-3-22
第二节 酵母人工染色体载体
酵母人工染色体(yeast artificial chromosome，YAC)
当外源DNA片段组入二联体线形DNA分子，
并且两个cos位点之间的DNA核苷酸序列达到足
够长时，两个cos位点可被A蛋白切割，产生具 有两个cos末端的重组λDNA分子，就能进行有 效的体外包装。
使用cosmid克隆载体的基本程序是：
先用一种限制性核酸内切酶切割cosmid克隆载体
DNA连接酶
具有两个cos位点的二联体线形DNA分子
④构建的cosmid克隆载体较小，因此能承载比较 大的外源DNA片段。 如果cosmid克隆载体的大小为6.5 kb，按入噬
菌体容许包装的量计算，能承载的外源DNA片段
最大可达44.5 kb(即51 kb～6.5 kb)，最小的也有
29.9kb(即36.4kb～6.5kb)，所以用这样的cosmid
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将细菌接合因子或酵母菌染色体上的复制区、
分配区、稳定区与质粒组装在一起，即可构成染
色体载体。当大片段的外源DNA克隆在这些染
色体载体上后，便形成重组人造染色体，它能像
天然染色体那样，在受体细胞中稳定的复制并遗
传。
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3
利用染色体的复制元件来驱动外源DNA片
段复制的载体称为人工染色体载的自身连接，从而导致效率降低
或者失败。
载体自身只相当于可以插入片段的1/10左右，
因此往往会出现载体同载体自身连接，结果
在一个重组分子内可有几个柯斯质粒载体连 在一起。但用碱性磷酸酶处理，可阻止载体 分子自身连接；
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②大小不等的外源片段相互连接后插入同一个载体分子。 结果使在基因组内本来不是相邻的片段错乱地连接成一
个片段，会影响实验结果的分析，后来专门选出30～
45kb的外源DNA插入载体DNA，此时，每个载体只可能 插入一个外源片段，因为如果二个片段，则将超过包装 成噬菌体颗粒的限度；
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34
③细菌的菌落体积远大于菌落很费时间。
有感染力的颗粒。
由于cos质粒和噬菌粒不再携带包装蛋白基因，因此重组 DNA分子在细胞内不能形成噬菌体颗粒。
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第一节
黏粒（cosmid）载体
PstI BamHI Tcr SalI
一类人工构建的含有λ-
DNA cos序列和质粒复制
子的特殊类型的载体。
Apr
1978年Collins和Hohn发 明构建 1.8 kb的λ-DNA片段 + pBR322片段
13
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二、 构建cosmid克隆载体的策略
根据λ噬菌体克隆载体和质粒克隆载体两者
的这些性质，取长去短，设计由质粒和含有cos位
点的这种λDNA片段组装成一类新的克隆载体， 即cosmid克隆载体。
由λDNA片段和pBR322 质粒DNA联合组成的。
cosmid 载 体 ---- pHC79
pYAC4
URA3
ori TEL BamHI TEL
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以及合适的选择标记基因。
一、YAC载体的复制元件和标志基因
YAC载体应含有下列元件：
酵母染色体的端粒序列 酵母染色体的复制子 ARS1 EcoRI CEN4
TRP1
Apr ori
pYAC4
酵母染色体的着丝粒序列
酵母系统的选择标记
URA3
大肠杆菌的复制子标记
pBR322质粒(p43)
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用λ噬菌体基因组的cro—rⅡ的BglⅡ限制
片段，取代pBR322质粒DNA的位于1 459～1
666bp之间的Sau3A片段，产生出具有BglⅡ单
切割位点的重组体分子。 然后通过这个位点，将带有cos序列、长度 为1.78kb的λDNA之BglⅡ片段插入进去，于是 得到了pHC79柯斯质粒.
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构建黏粒和噬菌粒的原因和思路
λ-噬菌体载体和M13-噬菌体载体的装载量最大分别为25
kb和1.5kb，装载量无法满足现代基因工程的需要。
在包装上限固定的条件下，大幅度缩短噬菌体DNA的长
度，就能同步增加载体的装载能力。将噬菌体DNA与包
装有关的序列与质粒组装在一起，既能最大限度地缩短 载体的长度，又能保证重组DNA分子在体外仍被包装成
③具有λ噬菌体的特性。在此克隆载体上含有一
个cos位点。
cosmid克隆载体在克隆了合适长度的外源 DNA，并在体外包装成噬菌体颗粒之后，可以 高效地转导对λ噬菌体敏感的大肠杆菌寄主细胞。
进入寄主细胞之后的cosmid克隆载体DNA
分子，便按照λ噬菌体DNA同样的方式环化起
来。 但由于cosmid克隆载体并不含有λ噬菌体的全 部必要基因，因此它不能通过溶菌周期，无 法形成子代噬菌体颗粒。 外源片段克隆在黏粒载体中是以大肠杆菌菌 落的形式表现出来的，而不是噬菌斑。
②cosmid克隆载体具有质粒的性质。
cosmid行复制，具有转
化大肠杆菌的功能，并且在氨苄青霉素作用下， 同样也会获得扩增。 cosmid克隆载体通常也具抗菌素抗性基因， 作为重组体分子表型选择标记。其中有一些还带 上基因插入失活的克隆位点。
12
②抗性标记Ampr 。
③ cos位点。有的粘粒载体含
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l fragmen
有2个cos位点。
一、黏粒的结构特征和用途
能像l-DNA那样进行体外包装，并高效转染受
体细胞；
能像质粒那样在受体细胞中自主复制； 重组操作简便，筛选容易； 装载量大（45 kb）且克隆片段具有一定的大小 范围； 不能体内包装，不裂解受体细胞。
l fragment
cos
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一、黏粒的结构特征和用途
黏粒它的大小一般 5-7kb 左
右，用来克隆大片段 DNA，
装载范围为31 – 45，克隆的 最大 DNA 片段可达45kb。
Apr
PstI
BamHI
Tcr SalI
①质粒复制起点（colE1） 象
质粒一样转化和增殖。
pHC79 6400 bp ori cos
第二节 酵母人工染色体载体
这种人工染色体克隆载 ARS1 TRP1
体实际上是一种“穿梭”克
隆载体，含有质粒克隆载体 所必备的第一受体(大肠杆 菌)源质粒复制起始位点 (ori)，还含有第二受体(如 酵母菌)染色体DNA着丝点、 端粒和复制起始位点的序列，
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EcoRI CEN4
Apr
用于酵母菌转化子筛选的标记基因主要有营养缺 陷型互补基因和显性基因两大类
营养缺陷型互补基因 主要有氨基酸和核苷酸生物合成基因， 如：LEU、TRP、HIS、LYS、URA、ADE 但对于多倍体酵母来说，筛选营养缺陷型的受体 非常困难
承载大的DNA片段，进行体外包装后能高
效率转导受体细胞 。
使用cosmid克隆载体的程序与使用λ噬菌 体克隆载体的程序有所不同 。
作为λ噬菌体克隆载体，线形重组λDNA分 子两端必须各有一个cos末端。而cosmid克隆载 体只有一个cos位点，因此必须先对cosmid克隆 载体进行适当处理，构成具有两个cos位点的二 联体线形DNA分子。
限制性核酸内切酶
切割二联体线形DNA分子和部分切割待克隆的外源DNA片段
DNA连接酶
成为可用于体外包装的样品
不管是(a)程序还是(b)程序，最后获得的重组 线形DNA分子必须保留质粒的复制起始位点(ori) 和选择标记基因，保证重组的线形DNA分子导 入受体细胞后，cos末端自行连接环化，按质粒 的性质进行自主复制，并且有效地表达选择标 记基因的产物，供筛选阳性克隆子。
抗性选择标记；
筛选第二受体的克隆子，常用与受体互补
的营养缺陷型。
人工染色体克隆载体的特点： 能容纳长达1000 kb甚至3000 kb的外源 DNA片段。
克隆位点 插入失活选择： SUP4酶失活的酵 母菌落呈红色； 不失活的菌落是白 色。 14
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位于 SUP4 基因内部。
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用于转化子筛选的标记基因
λDNA片段除了cos位点 之外，在其两侧还具有 与噬菌体包装有关的 DNA短序列； 质粒DNA部分则是 一个完整的复制子。