23基因工程载体-人工染色体载体XXXX09
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《基因工程的载体》课件
04
人工染色体载体
人工染色体的概念与特性
人工染色体
指通过基因工程技术构建的染色 体，具有与天然染色体相似的结 构和功能。
特性
具有高容量、可定制、可调控等 特性，能够承载和表达大量的外 源基因，为基因治疗、基因组编 辑等领域提供有力支持。
人工染色体载体的构建
构建方法
通过同源重组、酵母人工染色体技术等方法，将天然染色体或其片段进行改造 和扩增，形成人工染色体载体。
目的基因与质粒载体的连接
将重组质粒导入受体细胞中，通过筛 选和鉴定获得阳性克隆。
质粒载体的选择
根据目的基因的性质和表达要求，选 择合适的质粒载体。
重组质粒的转化
通过限制性内切酶和DNA连接酶将 目的基因插入质粒载体中，形成重组 质粒。
质粒载体的应用
基因克隆与表达
质粒载体是基因克隆和表达的重要工具，可以将目的基因在受体细胞中高效表达。
基因组结构
复制方式
噬菌体的基因组通常较小，易于 操作和改造。
噬菌体通过复制和组装在宿主细 胞内产生子代，能够高效地将外 源基因整合到宿主基因组中。
噬菌体载体的构建
01
02
03
基因克隆技术
利用基因克隆技术将外源 基因插入到噬菌体基因组 中，构建成噬菌体载体。
基因敲除或敲入
通过基因敲除或敲入技术 ，对噬菌体基因组进行改 造，以实现外源基因的表 达或调控。
基因功能研究
人工染色体载体可用于构建基因表达谱和基因敲除细胞系 ，有助于深入研究和了解基因的功能和作用机制。
05
基因工程载体的未来发展
基因工程载体的改进方向
提高载体稳定性
通过优化载体结构，降 低载体在细胞内复制过 程中的突变率，提高基
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《基因工程》课程教学大纲课程类别：专业课课程性质：必修英文名称：Gene Engineering总学时：48 讲授学时：48学分：3先修课程：生物化学、分子生物学、微生物学、细胞生物学适用专业：生物工程、生物技术开课单位：医学院生物化学与分子生物学教研室一、课程简介本课程是生物工程专业必修的专业主干课程，它是生物工程（包括基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程）中最重要的课程之一，它是以分子遗传学理论为基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段而建立起来的一门技术学科。
基因工程就是在生物体外，通过对DNA分子进行人工剪切和拼接，对生物的基因进行改造和重新组合，然后导入受体细胞内进行无性繁殖，使重组基因在受体细胞内表达，产生出人类所需要的基因产物或定向的创造生物的新性状，使之稳定地遗传给子代。
要求学生掌握基因工程中的基础知识和基本理论，掌握基因工程中的基本研究手段和实验方法，了解基因工程中的最新研究进展和动态，能够灵活运用基因工程的基本理论知识和实验方法，对整个生物工程有一个更新的认识，使学生受到基本科学思维和科学实验能力训练，同时使学生学会学习，具有自我开拓可获得知识和利用信息的能力，以达到融知识传授、能力培养和素质提高于一体的教学目的。
二、教学内容及基本要求（一）绪论（2学时）教学内容：基因工程概况；基因工程研究内容；基因工程展望。
教学要求：1.掌握基因工程的概念。
2.了解基因工程的主要研究内容、发展简史。
3.了解当前基因工程研究的总趋势与重点领域。
授课方式：讲授、自学（-）分子克隆工具酶（6学时）教学内容：限制性内切酶；甲基化酶；DNA聚合酶；依赖于DNA的RNA聚合酶；连接酶；T4多核昔酸激酶；碱性磷酸酶；核酸酶。
教学要求：1.掌握限制性核酸内切酶的概念、功能、影响酶活性的因素及操作注意事项、限制性核酸内切酶的星活性概念及产生的原因。
2.掌握同裂酶和同尾酶的概念。
3.掌握DNA连接酶、DNA聚合酶、反转录酶和碱性磷酸酶的功能。
基因工程-载体
质粒的复制过程 质粒的复制主要是通过θ型复制和滚环复制两种方式之一进行的，其中以θ型
复制为主。在θ型复制中，有单向半保留复制和双向半保留复制。
θ型复制
Ori复制起点
滚环复制
在革兰氏阳性细菌中大多数质粒是以滚环方式复制。
复制起点(ori)区的功能 复制起点是一段特定的DNA序列，长约几百碱基对，在其相关的调控元件中 含有由质粒或宿主染色体编码的、参与DNA合成起始调控因子的结合位点。 在大多数质粒中，与复制有关的蛋白质基因位于ori序列附近，因此ori位点周 围的小范围DNA是质粒复制所必需的。 如果质粒DNA的大部分区域被去掉，而只保留质粒的ori序列，而且质粒是环 状的，则质粒仍然能进行复制。 将ori区克隆到一个不能自主复制的环状双链DNA分子上并引入到原核细胞后， 该重组DNA具有自主复制能力。分子克隆中常用的质粒载体就是以这种方法构建 的，同时用这种方法可以确定哪部分DNA是ori区并研究ori区的功能。 ori区域常决定了质粒的许多特性，如质粒的寄主范围和质粒的拷贝数。
理想质粒载体必须具备的基本条件：
1、具有复制起点（ORI） 2、具有抗菌素抗性基因：是筛选的标志。理想的载体应该有两种抗菌素抗性 基因。 3、若干限制性内切酶的单一位点：用来插入外源DNA片断。且插入后不影响 复制功能。 4、具有较小的分子量和较高的拷贝数。
质粒的选择标记及其工作原理：
抗菌素抗性
pBR322的缺点
保留了转移蛋白（mob）的作用位点。能够被pColK质粒编码的mob蛋白识别， 如果再有F质粒的参与，就有可能转移！
pBR322的改良
删除mob识别位点 如pAT153，pBR322的改造衍生质粒，除去了mob识别位点，同时增加质粒的
人工染色体载体PPT课件
筛选第一受体的克隆子，一般采用抗菌素 抗性选择标记；
筛选第二受体的克隆子，常用与受体互补 的营养缺陷型。
人工染色体克隆载体的特点： 能容纳长达1000 kb甚至3000 kb的外源
DNA片段。
人工酵母染色体克隆载体的构建
YAC(酵母人工染色体)克隆载体是最早构建 成功的人工染色体克隆载体。
将酵母染色体DNA的端粒(TEL)、DNA复制 起点 (ARS)和着丝粒(CEN)以及必要的选择标记 (HISA4和TRPl)基因序列克隆到大肠杆菌质粒 pBR322中，构建成YCA克隆载体。
二、YAC载体的工作原理
ARS1
TRP1
EcoRI
CEN4
EcoRI
EcoRI EcoRI
Apr
pYAC4
URA3 BamHI
ori
TEL BamHI TEL
重组酵母染色体
连 接
转化酵母菌
03.01.2024
37
（红色，赤红色）
此克隆载体的sup4(抑制基因：抑制赭色 表型 )基因上，组装了供插入外源DNA片段 的克隆位。
③一个自主复制序列(ARS1)；
④两个来自嗜热四膜虫
(Tetrahymenna thermophilp)的末
端重复序列(TEL)，以保持重组
•03.01.2Y02A4 C为线状结构；
•39
⑤在两个末端序列中间，有 一段填充序列(HIS3)，以 便pYAC4在细菌细胞中稳 定扩增；
⑥Amp抗性及细菌质粒复制 原点；
常用的YAC克隆载体有3种：
pYAC3、pYAC4和pYAC5。
差别： 在sup4基因上的克隆位点不同，分别是
SnaBI、EcoRI和NotI。
第4章人工染色体载体
西南大学生物技术专业 基因工程
3
二、粘粒载体的工作原理
粘粒载体的主要工作原理类似l噬菌体 载体。在外源片段与载体连接时，粘粒载体 相当于l噬菌体载体的左右臂， cos位点通过 粘段退火后，再于外源片段相间连接成多联 体。当多联体与l噬菌体包装的蛋白质混合时 l噬菌体A基因蛋白的末端酶功能将切割成两 个cos位点，并将两个同方cos位点之间的片 段包装到l噬菌体颗粒中去。
第四章 人工染色体载体
第一节 第二节 第三节 第四节
粘粒载体 酵母人工染色体载体 细菌人工染色体载体 P1噬菌体载体和P1人工染色体载体
本课件是在网络资源基西础南大上学改生物进技而术成专业，基在因此工程对有关人士特致感谢！ 1
常规载体在工作时都是在不影响质粒或 噬菌体复制功能的基础上装载外源DNA片段的， 同时保持质粒或噬菌体的基本特性。这样一 来，这些载体所装载的容量就受到限制。利 用染色体的复制元件来驱动外源DNA片段的载 体称为人工染色体载体，其装载外源DNA片段 的容量可以与 多个外源片段串联进入载体中 原料DNA片段短于200kb时，制备的目的DNA中相当一部分
的末端的一端不带酶切位点
总DNA纯度影响目的DNA的制备 西南大学生物技术专业 基因工程
12
第节 细菌人工染色体载体
细菌人工染色体载体（bacterial artificial chromosome，BAC）：就是基于大肠杆菌的F 质粒构建的高容量低拷贝质粒载体。
F质粒：是一个约100kb的质粒，编码60多种参 与复制、分配和结合过程的蛋白质。
西南大学生物技术专业 基因工程
片段的装载导致抑制基因sup4插入失活，从而使重组菌形成
红色菌落；而载体自身连接转入到酵母细胞后所形成的菌落 为白色。
4.人工染色体载体
是一类酵母穿梭载体。 ARS1 TRP1 Apr ori TEL BamHI TEL
38
YAC具有自主复制
序列、克隆位点以及可在
细菌和酵母菌中选择的标 记基因。此外，YAC还具
pYAC4
EcoRI CEN4
URA3
有酵母菌染色体的一些特
点。可以接受100-1000kb 的外源DNA片段。
2014-3-22
写而成的，其原意是
指带cos位点的质粒。
2014-3-22
l fragment
10
考斯质粒（cosmid）= 质粒+ cos序列。
它是用正常的质粒同λ
Apr
PstI
BamHI
Tcr SalI
噬菌体的cos位点构成。
pHC79
cos序列是l噬菌体DNA
ori
6400 bp
中将DNA包装到噬菌体 颗粒中所需的DNA序列。
配区、稳定区与质粒组装在一起，即可构成染色
体载体。当大片段的外源DNA克隆在这些染色体 载体上后，便形成重组人造染色体，它能像天然 染色体那样，在受体细胞中稳定的复制并遗传。
细菌人造染色体（BAC）
酵母人造染色体（YAC）
37
2014-3-22
第二节 酵母人工染色体载体
酵母人工染色体(yeast artificial chromosome，YAC)
当外源DNA片段组入二联体线形DNA分子，
并且两个cos位点之间的DNA核苷酸序列达到足
够长时，两个cos位点可被A蛋白切割，产生具 有两个cos末端的重组λDNA分子，就能进行有 效的体外包装。
使用cosmid克隆载体的基本程序是：
先用一种限制性核酸内切酶切割cosmid克隆载体
38
YAC具有自主复制
序列、克隆位点以及可在
细菌和酵母菌中选择的标 记基因。此外，YAC还具
pYAC4
EcoRI CEN4
URA3
有酵母菌染色体的一些特
点。可以接受100-1000kb 的外源DNA片段。
2014-3-22
写而成的，其原意是
指带cos位点的质粒。
2014-3-22
l fragment
10
考斯质粒（cosmid）= 质粒+ cos序列。
它是用正常的质粒同λ
Apr
PstI
BamHI
Tcr SalI
噬菌体的cos位点构成。
pHC79
cos序列是l噬菌体DNA
ori
6400 bp
中将DNA包装到噬菌体 颗粒中所需的DNA序列。
配区、稳定区与质粒组装在一起，即可构成染色
体载体。当大片段的外源DNA克隆在这些染色体 载体上后，便形成重组人造染色体，它能像天然 染色体那样，在受体细胞中稳定的复制并遗传。
细菌人造染色体（BAC）
酵母人造染色体（YAC）
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2014-3-22
第二节 酵母人工染色体载体
酵母人工染色体(yeast artificial chromosome，YAC)
当外源DNA片段组入二联体线形DNA分子，
并且两个cos位点之间的DNA核苷酸序列达到足
够长时，两个cos位点可被A蛋白切割，产生具 有两个cos末端的重组λDNA分子，就能进行有 效的体外包装。
使用cosmid克隆载体的基本程序是：
先用一种限制性核酸内切酶切割cosmid克隆载体
基因工程载体-人工染色体载体
基因工程载体-人工染色 体载体
介绍基因工程载体的概念和定义，探讨人工染色体载体在基因工程领域的作 用与意义。
基因工程载体的种类和分类
质粒
常见、易构建和操控的载体，用于携带目标基因并在细胞中复制和表达。
噬菌体
寄生于细菌的病毒，通过感染细菌转导目标基因。
人工染色体
模拟自然染色体结构的人工合成 DNA 分子，能够携带更多和更复杂的基因。
大容量
能够携带更多和更复杂的基因， 提供更多的表达空间。
稳定性
较高的稳定性，减少基因丢失或 变异的风险。
人工染色体载体在基因工程领域的应用
1
基因治疗
将基因修复或替代病人体内缺陷基因，治疗遗传性疾病。
2
合成生物学
构建复杂的合成生物学系统，如合成生物学传感器和人工代谢途径。
3
功能基因组学
研究基因在生物体内的功能与相互作用，揭示基因底物和调控网络。
人工染色体载体的挑战和未来发展方 向
1 复杂性
设计、构建和操作复杂的人工染色体载体仍然存在挑战。
2 稳定性
提高人工染色体的稳定性，减少丢失和变异的可能性。
3 功能扩展
进一步扩展人工染色体的功能，提升表达效率和适用范围。基因工程源自体的选择和设计原则1 目标基因
根据所需表达的基因选择适合的载体，考虑载体的容量和复制机制。
2 宿主细胞
选择合适的宿主细胞，考虑宿主细胞特性和表达效率。
3 载体稳定性
选择稳定的载体，避免丢失或变异，以确保基因的持续表达。
人工染色体载体的结构和特点
复杂结构
包含多个功能模块，模拟自然染 色体的结构。
介绍基因工程载体的概念和定义，探讨人工染色体载体在基因工程领域的作 用与意义。
基因工程载体的种类和分类
质粒
常见、易构建和操控的载体，用于携带目标基因并在细胞中复制和表达。
噬菌体
寄生于细菌的病毒，通过感染细菌转导目标基因。
人工染色体
模拟自然染色体结构的人工合成 DNA 分子，能够携带更多和更复杂的基因。
大容量
能够携带更多和更复杂的基因， 提供更多的表达空间。
稳定性
较高的稳定性，减少基因丢失或 变异的风险。
人工染色体载体在基因工程领域的应用
1
基因治疗
将基因修复或替代病人体内缺陷基因，治疗遗传性疾病。
2
合成生物学
构建复杂的合成生物学系统，如合成生物学传感器和人工代谢途径。
3
功能基因组学
研究基因在生物体内的功能与相互作用，揭示基因底物和调控网络。
人工染色体载体的挑战和未来发展方 向
1 复杂性
设计、构建和操作复杂的人工染色体载体仍然存在挑战。
2 稳定性
提高人工染色体的稳定性，减少丢失和变异的可能性。
3 功能扩展
进一步扩展人工染色体的功能，提升表达效率和适用范围。基因工程源自体的选择和设计原则1 目标基因
根据所需表达的基因选择适合的载体，考虑载体的容量和复制机制。
2 宿主细胞
选择合适的宿主细胞，考虑宿主细胞特性和表达效率。
3 载体稳定性
选择稳定的载体，避免丢失或变异，以确保基因的持续表达。
人工染色体载体的结构和特点
复杂结构
包含多个功能模块，模拟自然染 色体的结构。
人工染色体载体
人工染色体载体
自由之风L
定义
• 人工染色体(artificial chromosome)指人工构 建的含有天然染色体基本 功能单位的载体系统 • 天然染色体的基本功能单 位：复制起始点着丝粒和 端粒
定义
• 实际上是一种“穿梭”克 隆载体：含有质粒克隆载 体所必备的第一受体（大 肠杆菌）源质粒复制起始 位点（ori），还含有第二 受体（如酵母菌）染色体 DNA着丝点、端粒和复制 起始位点的序列，以及合 适的选择标记基因。
不足
• YAC只以单抄本方式繁殖，所以不适用于以生产为目的的 基因工程 • 有些克隆不稳定 • YAC克隆不容易与酵母自身染色体相分离
哺乳动物人工染色体
• 哺乳动物人工染色体指从 哺乳动物细胞中分离出复 制起始区、端粒以及着丝 粒构建而成的克隆载体。 • 可以克隆大于1000kb的 外源DNA片段
优势
• • • • 有丝分裂和减数分裂对DNA片段大小的定量分析 研究哺乳动物细胞中染色体功能 对复杂的基因做功能分析 用于体细胞基因治疗
基因治疗
• 基因治疗（gene therapy）是指将外源正 常基因导入靶细胞，以纠 正或补偿因基因缺陷和异 常引起的疾病，以达到治 疗目的
方式主要有两种：1、修正和置换 2、增强和失活
MAC应用于基因治疗的优缺点
• MAC可以在宿主细胞中自主复制，不会插入患者基因组而 引起插入突变 • 容量大，可同时导入多个基因从而修正患者本身的缺陷 • 基因在人体中表达效率不高，人类的着丝粒和复制起始点 复杂且分离困难
人类人工染色体
• 人类人工染色体是一种小 型染色体，可作为载体搭 载一些基因，并作为人类 细胞中额外的染色体（第 47个），使这些基因表现 于人类体内。此种人工染 色体可载有约600到1000 万的碱基对。
自由之风L
定义
• 人工染色体(artificial chromosome)指人工构 建的含有天然染色体基本 功能单位的载体系统 • 天然染色体的基本功能单 位：复制起始点着丝粒和 端粒
定义
• 实际上是一种“穿梭”克 隆载体：含有质粒克隆载 体所必备的第一受体（大 肠杆菌）源质粒复制起始 位点（ori），还含有第二 受体（如酵母菌）染色体 DNA着丝点、端粒和复制 起始位点的序列，以及合 适的选择标记基因。
不足
• YAC只以单抄本方式繁殖，所以不适用于以生产为目的的 基因工程 • 有些克隆不稳定 • YAC克隆不容易与酵母自身染色体相分离
哺乳动物人工染色体
• 哺乳动物人工染色体指从 哺乳动物细胞中分离出复 制起始区、端粒以及着丝 粒构建而成的克隆载体。 • 可以克隆大于1000kb的 外源DNA片段
优势
• • • • 有丝分裂和减数分裂对DNA片段大小的定量分析 研究哺乳动物细胞中染色体功能 对复杂的基因做功能分析 用于体细胞基因治疗
基因治疗
• 基因治疗（gene therapy）是指将外源正 常基因导入靶细胞，以纠 正或补偿因基因缺陷和异 常引起的疾病，以达到治 疗目的
方式主要有两种：1、修正和置换 2、增强和失活
MAC应用于基因治疗的优缺点
• MAC可以在宿主细胞中自主复制，不会插入患者基因组而 引起插入突变 • 容量大，可同时导入多个基因从而修正患者本身的缺陷 • 基因在人体中表达效率不高，人类的着丝粒和复制起始点 复杂且分离困难
人类人工染色体
• 人类人工染色体是一种小 型染色体，可作为载体搭 载一些基因，并作为人类 细胞中额外的染色体（第 47个），使这些基因表现 于人类体内。此种人工染 色体可载有约600到1000 万的碱基对。
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• A.tumefaciens carrying the disarmed Ti plasmid
3. Binary vector
• T-DNA does not need to be physically attached to the rest of the Ti plasmid
• Use separate plasmids to supply the disarmed T-DNA and the virulence functions
植物Ti质粒载体
（1）T-DNA区（transferred-DNA regions） T-DNA是农杆菌侵染植物细胞时，从Ti质粒 上导入植物细胞的一段DNA。
➢T-DNA两端各有一段25bp的重复序列(LB, RB)。 T-DNA携带的致瘤基因是一些与激素合成有关的基 因，由于激素合成基因使细胞处于不停的分裂状态， 形成冠瘿瘤，不能进行细胞分化。 ➢Ti质粒改造后才能应用于植物的基因工程。 保留 T-DNA两端的末端序列，然后用外源DNA插入或直 接取代野生型T-DNA的部分基因，使转化的植物细 胞不具有成瘤能力。
Pnos Kan
Tnos
PcaMV GUS Tnos
pBI12（1 13kb）
Kanr
pAL4404 170kb
Vir
▪ The small plasmid can be used to inserted foreign gene ▪ When the two plasmids present together in the same
1） Disarmed Ti vectors
• 去除T-DNA中 的肿瘤基因
• 在T-DNA中插 入用于转化植 株筛选的遗传 标记基因
pBR322
AmpR 25 bp 重复区
Opine 合成
25 bp 重复区
pGV3850
Vir
Intermediate vectors
• A small portion of T-DNA was subcloned in a conventional E.coli plasmid vector (i.e. pBR322) for easy manipulation, producing intermediate vectors
第三节 其他载体
2012.09
其他载体
• 一、人工染色体 • 二、植物基因工程载体 • 三、动物基因工程载体
一、人工染色体
人基因组十分庞大，约（ yeast artificial chromosome,YAC）载体 应运而生。YAC含有酵母染色体端粒（ telesome）、着丝点(centromere)及复 制起点等功能序列，可插入长度达200500kb的外源DNA，导入酵母细胞可以 随细胞分裂周期复制繁殖供作克隆，成 为人基因组研究计划的重要
➢在有关的植物细胞酶体系的催化作用下，合 成互补链形成双链形式的T-DNA分子。 在一 系列酶的参与下整合进植物基因组。这种整合 是一种非正常重组。
2、Ti质粒载体
• Disarmed Ti vectors（非致瘤载体） • Cointegrate vectors（共整合载体） • Binary vectors（双元载体）
Ri质粒
T区与Ti质粒的T-DNA十分相似： ✓①T区的左右边界序列。左右边界上含有 25bp的重复序列。 ✓②TL-DNA区。该区中含有与毛状根形成有
关的rolA、B、C、D基因群。
✓③TR-DNA区。该区中含有与农杆碱合成有 关的基因（ags）和生长素合成有关的基因
（tms1、 tms2）。ags基因在转化的初期起
YAC载体
正常酵母人工染色体含有： * 四膜虫端粒（tel) * 酵母自主复制序列（ ARS) * 酵母着丝点 (CEN) * 酵母的选择标记 (TRP1、 URA1)
The functional elements of a yeast chromosome
the capacity to clone large exogenous DNA fragments (up to 2 Mb) has made YACs a vital tool in physical mapping
Triparental mating
• An E.coli strain A carrying a helper plasmid able to mobilize the intermediate vector in trans
• The E.coli strain B carrying the recombinant intermediate vector
（3）Con区(regions encoding conjugations)
该区段上存在着与细菌间接合转移的有关基因（tra），
调控Ti质粒在农杆菌之间的转移。
（4）Ori区(origin of replication)
该区段基因调控Ti质粒的自我复制，故称之为复制起始 区。
T-DNA转移的机制
➢Ti质粒分子受到信号分子的激活作用之后， virD基因编码的一种核酸内切酶，先在TDNA的RB序列中的第3和第4碱基之间切开一 个单链缺口，随后在T-DNA同一条链的LB序 列中切出第二个单链缺口。 ➢T-DNA便以单链形式释放出来，并在RB序 列的引导下定向地转移到寄主植物细胞。
• Intermediate vectors are incapable of replication in A.tumefaciens and also lack conjugation functions.
• Transfer of them was achieved using a triparental mating.
1、酵母人工染色体 （yeast artificial chromosome, YAC)
酵母人工染色体（yeast artificial chromosome，YAC）
◆酵母人工染色体是另一类酵母穿梭载体。 具有自主复制序列、克隆位点以及可在细菌 和酵母菌中选择的标记基因。
◆ YAC可以接受100-1000 kb的外源DNA片段， 这一特点使YAC成为人类基因组计划及图位 克隆分离基因的重要工具，并促进了发展人 类人工染色体(human artificial chromosome， HAC)的研究。
着重要的作用，是不定根产生的关键
CaMV克隆载体
• 含1个约8kb的环状双链DNA分子； • 用于十字花科和少数非十字花科的植物基
（1）双元载体系统（binary vector） 具有两个质粒——穿梭质粒和Ti质粒。 （2）共整合载体（integrated vector） 共整合载体系统包括在T-DNA上的激素合成 区经过突变后的Ti质粒和中间载体两部分。
Ri质粒
➢发根农杆菌存在另一种质粒，Ri质粒。 ➢Ri质粒也可完成外源基因向植物的转移工作。 发根农杆菌侵染后植物细胞产生许多不定根， 这种不定根生长迅速，不断分枝成毛状，故称 之为毛状根，也称为发状根，分别简称为毛根 或发根，Ri质粒为根诱导质粒。 ➢Ri质粒的结构与Ti质粒的结构很相似，可以 分为T区、vir区、ori区和其它区域等几个部 分。
YAC的组成结构
（1）着丝粒区（CEN）
酵母染色体着丝粒区的保守序列: 由三个区组成
I
A
A
GTCACGTG
II 78-86bp
III
T TGTTTCTGNTTTCCGAAA
（2）端粒（TEL） 两个端粒序列Tel。 酵母端粒保守序列是(G4T2)n 重复序列。
（3）复制起点（ORI）
约100bp的自主复制序列（ARS）。 （真核生物中只有酵母菌有ARS）
• T-DNA区域内的所有基因与转移无关，所 以将致瘤基因全部缺失即卸甲(disarmed) 后，将细菌抗生素的抗性基因或其它序列 插入到这个区域，形成的T-DNA仍可将RB 至LB内的序列转移并整合到植物基因组。
• Vir区的毒性基因是T-DNA转移所必需的， 毒性基因可以顺式及反式两种方式控制TDNA转移。
3、PAC载体
二、植物载体
Plant cloning vectors
• Ti质粒:侵染广泛的双子叶植物 • T-DNA或T-区(T-region)：约20kb，包含专化冠瘿碱生
化合成和冠瘿瘤生长的基因，随机地整合到植物染色体上。 • 结构特点：两端具有25个碱基对的顺向重复序列，但重复
不是完全的。25个碱基对的序列称为T-DNA的边界序列 (T-DNA border sequence)。去除右边界序列，将使TDNA失去转移和整合的功能；左边界的缺失，对致瘤性 无明显影响。 • 毒性区域即vir(virulence)区域:引起T-DNA转移的区域。 长度约35kb，和T-DNA处于不同位置
◆ BAC载体是基于细菌的性因子(F因子)质粒的 一些特点构建的。F因子在细菌接合时转移1Mb 的细菌染色体片段。将F因子经基因工程改良构 成的BAC载体，可用于克隆100 kb以上的DNA 片段。 ◆带有外源片段的BAC载体在细菌细胞中通常 仅单个拷贝，这一特点有利于保持DNA大分子， 在细胞内稳定复制而不发生重组。BAC载体本 身分子量小，具有氯霉素抗性选择基因及多克 隆位点。
（4）克隆位点
位于 SUP4 基因内部。
插入失活选择：
SUP4酶失活的酵 母菌落呈红色； 不失活的菌落是白 色。
14
2、细菌人工染色体（Bacterial artificial chromosome,BAC）
细菌人工染色体（bacterial artificial chromosome，BAC）
（2）Vir区（virolence region）
Vir区段上的基因与T-DNA从细菌转移到植物细胞的遗 传过程有关，区段上的基因能够使农杆菌表现出毒性， 故称之为毒性区。Vir区段总长度大约35kb，由7个互
3. Binary vector
• T-DNA does not need to be physically attached to the rest of the Ti plasmid
• Use separate plasmids to supply the disarmed T-DNA and the virulence functions
植物Ti质粒载体
（1）T-DNA区（transferred-DNA regions） T-DNA是农杆菌侵染植物细胞时，从Ti质粒 上导入植物细胞的一段DNA。
➢T-DNA两端各有一段25bp的重复序列(LB, RB)。 T-DNA携带的致瘤基因是一些与激素合成有关的基 因，由于激素合成基因使细胞处于不停的分裂状态， 形成冠瘿瘤，不能进行细胞分化。 ➢Ti质粒改造后才能应用于植物的基因工程。 保留 T-DNA两端的末端序列，然后用外源DNA插入或直 接取代野生型T-DNA的部分基因，使转化的植物细 胞不具有成瘤能力。
Pnos Kan
Tnos
PcaMV GUS Tnos
pBI12（1 13kb）
Kanr
pAL4404 170kb
Vir
▪ The small plasmid can be used to inserted foreign gene ▪ When the two plasmids present together in the same
1） Disarmed Ti vectors
• 去除T-DNA中 的肿瘤基因
• 在T-DNA中插 入用于转化植 株筛选的遗传 标记基因
pBR322
AmpR 25 bp 重复区
Opine 合成
25 bp 重复区
pGV3850
Vir
Intermediate vectors
• A small portion of T-DNA was subcloned in a conventional E.coli plasmid vector (i.e. pBR322) for easy manipulation, producing intermediate vectors
第三节 其他载体
2012.09
其他载体
• 一、人工染色体 • 二、植物基因工程载体 • 三、动物基因工程载体
一、人工染色体
人基因组十分庞大，约（ yeast artificial chromosome,YAC）载体 应运而生。YAC含有酵母染色体端粒（ telesome）、着丝点(centromere)及复 制起点等功能序列，可插入长度达200500kb的外源DNA，导入酵母细胞可以 随细胞分裂周期复制繁殖供作克隆，成 为人基因组研究计划的重要
➢在有关的植物细胞酶体系的催化作用下，合 成互补链形成双链形式的T-DNA分子。 在一 系列酶的参与下整合进植物基因组。这种整合 是一种非正常重组。
2、Ti质粒载体
• Disarmed Ti vectors（非致瘤载体） • Cointegrate vectors（共整合载体） • Binary vectors（双元载体）
Ri质粒
T区与Ti质粒的T-DNA十分相似： ✓①T区的左右边界序列。左右边界上含有 25bp的重复序列。 ✓②TL-DNA区。该区中含有与毛状根形成有
关的rolA、B、C、D基因群。
✓③TR-DNA区。该区中含有与农杆碱合成有 关的基因（ags）和生长素合成有关的基因
（tms1、 tms2）。ags基因在转化的初期起
YAC载体
正常酵母人工染色体含有： * 四膜虫端粒（tel) * 酵母自主复制序列（ ARS) * 酵母着丝点 (CEN) * 酵母的选择标记 (TRP1、 URA1)
The functional elements of a yeast chromosome
the capacity to clone large exogenous DNA fragments (up to 2 Mb) has made YACs a vital tool in physical mapping
Triparental mating
• An E.coli strain A carrying a helper plasmid able to mobilize the intermediate vector in trans
• The E.coli strain B carrying the recombinant intermediate vector
（3）Con区(regions encoding conjugations)
该区段上存在着与细菌间接合转移的有关基因（tra），
调控Ti质粒在农杆菌之间的转移。
（4）Ori区(origin of replication)
该区段基因调控Ti质粒的自我复制，故称之为复制起始 区。
T-DNA转移的机制
➢Ti质粒分子受到信号分子的激活作用之后， virD基因编码的一种核酸内切酶，先在TDNA的RB序列中的第3和第4碱基之间切开一 个单链缺口，随后在T-DNA同一条链的LB序 列中切出第二个单链缺口。 ➢T-DNA便以单链形式释放出来，并在RB序 列的引导下定向地转移到寄主植物细胞。
• Intermediate vectors are incapable of replication in A.tumefaciens and also lack conjugation functions.
• Transfer of them was achieved using a triparental mating.
1、酵母人工染色体 （yeast artificial chromosome, YAC)
酵母人工染色体（yeast artificial chromosome，YAC）
◆酵母人工染色体是另一类酵母穿梭载体。 具有自主复制序列、克隆位点以及可在细菌 和酵母菌中选择的标记基因。
◆ YAC可以接受100-1000 kb的外源DNA片段， 这一特点使YAC成为人类基因组计划及图位 克隆分离基因的重要工具，并促进了发展人 类人工染色体(human artificial chromosome， HAC)的研究。
着重要的作用，是不定根产生的关键
CaMV克隆载体
• 含1个约8kb的环状双链DNA分子； • 用于十字花科和少数非十字花科的植物基
（1）双元载体系统（binary vector） 具有两个质粒——穿梭质粒和Ti质粒。 （2）共整合载体（integrated vector） 共整合载体系统包括在T-DNA上的激素合成 区经过突变后的Ti质粒和中间载体两部分。
Ri质粒
➢发根农杆菌存在另一种质粒，Ri质粒。 ➢Ri质粒也可完成外源基因向植物的转移工作。 发根农杆菌侵染后植物细胞产生许多不定根， 这种不定根生长迅速，不断分枝成毛状，故称 之为毛状根，也称为发状根，分别简称为毛根 或发根，Ri质粒为根诱导质粒。 ➢Ri质粒的结构与Ti质粒的结构很相似，可以 分为T区、vir区、ori区和其它区域等几个部 分。
YAC的组成结构
（1）着丝粒区（CEN）
酵母染色体着丝粒区的保守序列: 由三个区组成
I
A
A
GTCACGTG
II 78-86bp
III
T TGTTTCTGNTTTCCGAAA
（2）端粒（TEL） 两个端粒序列Tel。 酵母端粒保守序列是(G4T2)n 重复序列。
（3）复制起点（ORI）
约100bp的自主复制序列（ARS）。 （真核生物中只有酵母菌有ARS）
• T-DNA区域内的所有基因与转移无关，所 以将致瘤基因全部缺失即卸甲(disarmed) 后，将细菌抗生素的抗性基因或其它序列 插入到这个区域，形成的T-DNA仍可将RB 至LB内的序列转移并整合到植物基因组。
• Vir区的毒性基因是T-DNA转移所必需的， 毒性基因可以顺式及反式两种方式控制TDNA转移。
3、PAC载体
二、植物载体
Plant cloning vectors
• Ti质粒:侵染广泛的双子叶植物 • T-DNA或T-区(T-region)：约20kb，包含专化冠瘿碱生
化合成和冠瘿瘤生长的基因，随机地整合到植物染色体上。 • 结构特点：两端具有25个碱基对的顺向重复序列，但重复
不是完全的。25个碱基对的序列称为T-DNA的边界序列 (T-DNA border sequence)。去除右边界序列，将使TDNA失去转移和整合的功能；左边界的缺失，对致瘤性 无明显影响。 • 毒性区域即vir(virulence)区域:引起T-DNA转移的区域。 长度约35kb，和T-DNA处于不同位置
◆ BAC载体是基于细菌的性因子(F因子)质粒的 一些特点构建的。F因子在细菌接合时转移1Mb 的细菌染色体片段。将F因子经基因工程改良构 成的BAC载体，可用于克隆100 kb以上的DNA 片段。 ◆带有外源片段的BAC载体在细菌细胞中通常 仅单个拷贝，这一特点有利于保持DNA大分子， 在细胞内稳定复制而不发生重组。BAC载体本 身分子量小，具有氯霉素抗性选择基因及多克 隆位点。
（4）克隆位点
位于 SUP4 基因内部。
插入失活选择：
SUP4酶失活的酵 母菌落呈红色； 不失活的菌落是白 色。
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2、细菌人工染色体（Bacterial artificial chromosome,BAC）
细菌人工染色体（bacterial artificial chromosome，BAC）
（2）Vir区（virolence region）
Vir区段上的基因与T-DNA从细菌转移到植物细胞的遗 传过程有关，区段上的基因能够使农杆菌表现出毒性， 故称之为毒性区。Vir区段总长度大约35kb，由7个互