ELISA的原理及分类
ELISA方法类型及原理
ELISA方法类型及原理ELISA是一种重要的实验技术，用于检测和定量分析蛋白质、抗体、荷尔蒙、生物学分子等。
ELISA的全称是酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay），它通过将目标物（如抗原或抗体）与特定的酶标记物结合，然后利用染色反应来检测、定量或分析目标物。
根据目标物的不同，ELISA可以分为直接ELISA、间接ELISA、竞争ELISA、间接竞争ELISA和反向ELISA等方法。
1.直接ELISA直接ELISA是最简单的一种ELISA方法。
它将目标物直接吸附在固相载体表面，然后加入与目标物特异性结合的酶标记抗体来检测目标物。
具体步骤包括：将目标物溶液加入固相载体中，使目标物吸附在载体表面；加入特异性酶标记抗体，与目标物结合；通过染色反应来检测酶的活性和目标物的定量。
2.间接ELISA间接ELISA是较常用的一种ELISA方法。
它将目标物首先吸附在固相载体表面，然后加入与目标物特异性结合的初级抗体，再加入与初级抗体特异性结合的酶标记二抗来检测目标物。
具体步骤包括：将目标物溶液加入固相载体中，使目标物吸附在载体表面；加入特异性的初级抗体，与目标物结合；加入与初级抗体特异性结合的酶标记二抗；通过染色反应来检测酶的活性和目标物的定量。
3.竞争ELISA竞争ELISA是一种用于定量测定样品中目标物含量的ELISA方法。
它将目标物预先包被在固相载体表面，然后加入与目标物特异性结合的酶标记抗体和待测样品，测定抗体与固相载体表面的目标物竞争的程度来定量目标物的含量。
具体步骤包括：将目标物溶液加入固相载体中，使目标物包被在载体表面；加入特异性酶标记抗体和待测样品；通过染色反应来检测酶的活性和竞争程度来定量目标物的含量。
4.间接竞争ELISA间接竞争ELISA结合了间接ELISA和竞争ELISA的原理。
首先将目标物吸附在固相载体上，然后加入与目标物特异性结合的初级抗体，再加入与初级抗体特异性结合的酶标记二抗和待测样品。
ELISA完整详解
ELISA完整详解(一)原理ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、牽9体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。
由于抗原、抗体的反应在一种固相载体──聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行，每加入一种试剂孵育后，可通过洗涤除去多余的游离反应物，从而保证试验结果的特异性与稳定性。
在实际应用中，通过不同的设计，具体的方法步骤可有多种。
即:用于检测抗体的间接法(图a)、用于检测抗原的双抗体夹心法(图b)以及用于检测小分子抗原或半抗原的抗原竞争法等等。
比较常用的是ELISA双抗体夹心法及ELISA间接法。
(二)操作步骤方法一用于检测未知抗原的双抗体夹心法:1.包被：用0.05M PH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg／ml。
在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。
次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。
(简称洗涤，下同)。
2.加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。
然后洗涤。
(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。
3.加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。
37℃孵育0.5～1小时，洗涤。
4.加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。
5.终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。
6.结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。
也可测O·D值：在ELISA检测仪上，于4 50nm(若以ABTS显色，则410nm)处，以空白对照孔调零后测各孔O·D 值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。
方法二用于检测未知抗体的间接法：用包被缓冲液将已知抗原稀释至1～10μg／ml，每孔加0.1ml，4℃过夜。
ELISA六种方法类型及原理
ELISA六种方法类型及原理ELISA（酶标检测）是用于检测免疫学反应的一种技术，全称为酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked immunosorbent assays, ELISA），该技术是测定抗体及抗原的特异性相互作用的一种常用的检测方法。
ELISA通过酶联试验来灵敏地检测特异性抗体或抗原的含量。
ELISA检测方法有很多种。
常用的ELISA检测方法有以下六种：一、双抗体沉淀反应ELISA（DAP-ELISA）双抗体沉淀反应ELISA是一种比较简单的ELISA方法，该方法的原理是，在受体表面点涂两种类型的抗体，例如兔抗人IgG，而免疫反应物则是人IgG，受体与免疫反应物结合后，形成抗体-抗原复合物，其上自发形成特异性沉淀。
随着浓度的增加，抗原越多，沉淀凝固物也越多，膜上形成沉淀下降，沉淀量可以通过酶标仪测定，或者免疫发光法检测，大体上，兔抗人IgG及抗原分别点涂及酶标探针可能以1:1:2的比例，也就是在100 L的反应液中加入到受体和兔抗人IgG各10 L，抗原20 L的条件下进行反应。
二、夹心ELISA（Sandwich ELISA）夹心ELISA是一种常见的ELISA检测方法，它利用特殊的标记抗体完成免疫反应，以达到检测目的。
以IgG为例，在受体表面点涂一种特异性抗体,如兔抗人IgG，受体与人IgG结合形成复合物，在这一抗原复合物上再添加第二种特异性抗体，如抗兔IgG，第二种抗体结合复合物，并将复合物结合在受体表面，形成抗原“夹心环”，该免疫反应体系可以通过酶标仪来检测指示物的夹心量，计算受体中抗原的含量。
三、竞争ELISA（Competitive ELISA）竞争ELISA提高ELISA检测的灵敏度，竞争式ELISA也属ELISA技术范畴，该技术通过特异性抗体与抗原间竞争性结合而形成的结果来检测特异性抗原的浓度。
竞争ELISA的原理是：将偶氮羟化物体表膜点涂含有特异性抗原区域的抗体，若添加一定量的抗原（相同的特异性抗原）至反应液，则可形成抗原-抗体复合物，受体与抗原的竞争性结合，而非特异性的抗体-抗原复合物。
elisa的基本原理方法类型及应用
Elisa的基本原理、方法类型及应用概述Elisa（酶联免疫吸附试验）是一种常用于生物化学和生物医学研究领域的实验技术。
它利用酶标记的抗原或抗体与待测物相互作用并生成可读出的信号，从而达到检测和定量分析的目的。
本文将介绍Elisa的基本原理、方法类型及应用。
基本原理Elisa的基本原理是通过特异性抗原与抗体间的结合反应来检测和定量分析待测物。
其基本步骤如下：1.固定：将抗原或抗体固定在固相载体（如微孔板、膜等）上，形成固定相；2.实验样本加入：加入待测物样本到固相载体中，使待测物与固定的抗体或抗原发生特异性结合；3.洗涤：通过洗涤步骤去除非特异性结合的物质；4.酶标记的抗体或抗原结合：加入酶标记的抗体或抗原，使其与待测物发生反应；5.洗涤：再次洗涤以去除未结合的酶标记的抗体或抗原；6.底物添加：加入底物，通过酶催化反应生成可检测的信号；7.信号检测：利用光度计、荧光计等仪器测量所产生的信号。
方法类型Elisa通常可以分为以下几种类型：1.间接Elisa：该方法是最常用的Elisa类型之一。
它通过在固相载体上固定抗原，然后加入待测物和酶标记的抗体，最后通过添加底物产生颜色反应来测定待测物的浓度。
2.直接Elisa：该方法直接在固相载体上固定酶标记的抗原，待测物与固定的抗原发生反应后，通过添加底物测定待测物的浓度。
与间接Elisa相比，直接Elisa节省了一个环节，因此更简单和快速。
3.竞争性Elisa：该方法适用于待测物是小分子的情况。
竞争性Elisa将待测物与酶标记的抗原竞争与固定抗原结合，通过测定底物的酶活性来测定待测物的浓度。
4.逆转Elisa：该方法常用于检测体内特定抗体的浓度。
逆转Elisa是将固定抗体或抗原加入实验样本中，之后加入酶标记的待测物，最后通过添加底物的酶活性来测定抗体的浓度。
应用Elisa在医学、生物学和生化学研究中广泛应用。
以下是Elisa的几个主要应用领域：1.临床诊断：Elisa可以用于检测和诊断人体内的疾病和感染。
elisa基本原理
elisa基本原理
ELISA（酶联免疫吸附试验）是一种常用的实验技术，用于检测特定抗原或抗体的存在和浓度。
它的基本原理如下：
1. 固相吸附：首先，在试验板上吸附抗原或抗体。
通常使用多孔板（如96孔板），将要检测的抗原或抗体溶液加入到孔中，然后孔中的溶液经过吸附和固定，使抗原或抗体附着在孔壁上。
2. 样品处理：将待测样品加入到试验板中，与固定的抗原或抗体发生特异性的结合反应。
如果样品中存在目标抗原或抗体，它们将与固定在试验板上的抗体或抗原结合形成复合物。
3. 洗涤：通过洗涤步骤，将未结合的物质洗掉，以去除非特异性的成分，使只有特异性结合的复合物留在孔中。
4. 酶标记：加入酶标记的抗体或抗原，它们与目标抗原或抗体发生特异性的结合。
5. 洗涤：再次进行洗涤步骤，去除未结合的酶标记物。
6. 反应物添加：加入适当的底物，使酶标记物催化反应，产生可测量的信号。
常用的底物是染色剂，其颜色与酶标记物的酶活性成正比。
7. 反应停止：加入反应停止剂，停止底物的反应，防止颜色进一步发展。
8. 信号测量：使用光谱仪或酶标仪等设备测量反应产生的信号强度。
信号强度与目标抗原或抗体的浓度成正比。
通过比较待测样品与已知浓度标准曲线的信号强度，可以确定待测样品中目标抗原或抗体的浓度。
ELISA技术在生物医学研究、诊断和药物开发等领域广泛应用，可以检测多种疾病标志物和生物分子。
ELISA方法类型及原理
2.1 双抗体夹心法测抗原
酶标抗体
血清样品 或参比品
底物
特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体； 特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体； 标本中的抗原与固相载体上的抗体结合成固相抗原复合物； 标本中的抗原与固相载体上的抗体结合成固相抗原复合物； 加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合， 加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合， 酶量与标本中受检物质的量成正相关； 酶量与标本中受检物质的量成正相关；
2.2 双抗原夹心法测抗体
用特异性抗原进行包被和制备酶结合物。此法中受 用特异性抗原进行包被和制备酶结合物。 检标本不需稀释，可直接用于测定， 检标本不需稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对 高于间接法。乙肝标志物中抗HBsAg的检测常采用本法 高于间接法。乙肝标志物中抗HBsAg的检测常采用本法 HBsAg 。本法关键在于酶标抗原的制备，应根据抗原结构的不 本法关键在于酶标抗原的制备， 寻找合适的标记方法。 同，寻找合适的标记方法。
终止液
固相载体上的酶量就代表特异性抗体的量。 固相载体上的酶量就代表特异性抗体的量。
底物
传染病的诊断。 传染病的诊断。间接法的优点是只要变换包被抗原 就可利用同一酶标抗抗体 同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法 就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法 。
例如：猪繁殖与呼吸综合征病毒ELISA抗体检测试剂盒 例如：猪繁殖与呼吸综合征病毒ELISA抗体检测试剂盒 ELISA
1.2
免疫测定在临床检验中的应用
由于各种抗原成份，包括小分子的半抗原， 由于各种抗原成份，包括小分子的半抗原，均
可用以制备特异性的抗血清或单克隆抗体， 可用以制备特异性的抗血清或单克隆抗体，利用此 抗体作为试剂就可检测标本中相应的抗原，因此免 抗体作为试剂就可检测标本中相应的抗原， 疫测定的应用范围极广。 疫测定的应用范围极广。
ELISA的原理和基本类型
ELISA的原理和基本类型ELISA（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）是一种常用的免疫测定技术，通过测定抗原或抗体与其相应配体之间的特异性反应来检测目标物质的存在和浓度。
这项技术具有高灵敏度、高特异性和高通量性的优势，已广泛应用于医学、生物学、环境科学和食品安全等领域的研究和临床诊断中。
1.直接ELISA：直接ELISA是最简单的ELISA形式之一、在直接ELISA中，适量的抗原被吸附在固相（如微孔板）上后，样本中的抗体与其结合。
接着，通过与该抗体特异性结合的酶标记抗体检测目标物质的存在与否。
最后，加入底物使酶催化发生彩色反应，根据颜色的强度来确定抗原浓度。
2.间接ELISA：间接ELISA是最常用的ELISA形式之一、在间接ELISA中，抗原被吸附在固相上，然后与试样中的抗体结合。
随后，加入与试样中抗体结合的酶标记抗体，再加入底物以进行酶催化的彩色反应。
该方法的优势在于，只需要极少量目标抗原即可进行检测。
3.竞争ELISA：竞争ELISA用于测定抗体或抗原浓度，是一种定量分析的方法。
在竞争ELISA中，抗原或抗体与固相相结合的抗体或抗原发生竞争结合，测定竞争反应的结果来确定目标物质的浓度。
4.夹心ELISA：夹心ELISA又被称为“双抗体夹心ELISA”。
该方法可用于检测样品中特异的抗原或抗体。
在夹心ELISA中，首先将一种抗体吸附在固相上，样品中的抗原与之结合。
然后加入酶标记的第二抗体与抗原再次结合。
最后，加底物使酶发生催化反应，并测量酶催化发生的信号。
总而言之，ELISA是一种高灵敏度、高特异性的免疫测定技术，可以通过测定抗原和抗体之间的特异性反应来快速、准确地检测目标物质的存在和浓度。
在不同类型的ELISA中，抗原或抗体通过固相吸附、结合特异性的酶标记抗体、进行酶催化反应的彩色反应来实现检测。
ELISA技术在医学、生物学和环境科学等领域的研究和诊断中发挥了重要作用。
elisa常见实验方法
elisa常见实验方法摘要：1.ELISA实验原理简介2.ELISA实验步骤概述3.常见ELISA实验方法分类4.各类ELISA实验方法的优缺点及应用场景5.提高ELISA实验效果的方法6.ELISA实验中常见问题及解决策略正文：ELISA（酶联免疫吸附实验）是一种常用于生物医学领域，用于检测蛋白质、抗原和抗体等生物分子的方法。
ELISA实验通过特异性抗体与待检测物结合，再通过酶标记的二抗检测结合物，从而实现对目标分子的定量分析。
以下是ELISA常见实验方法的详细介绍。
1.ELISA实验原理简介ELISA实验基于抗原抗体反应原理，将抗原或抗体固定在固相载体上，待检测样品中的目标分子与固定在载体上的抗体结合，再加入酶标记的二抗，与结合在载体上的抗原或抗体发生反应。
最后，通过底物显色反应，根据颜色的深浅判断待测物含量。
2.ELISA实验步骤概述ELISA实验一般分为以下四个步骤：（1）抗原或抗体固定：将抗原或抗体吸附在固相载体（如酶标板）上；（2）样品处理：对待测样品进行适当处理，使其与实验体系相适应；（3）加样：将处理后的样品和酶标记的二抗加入酶标板，incubate；（4）底物显色：加入底物，酶标记的二抗与抗原或抗体结合后，底物被酶催化显色；（5）读数：用酶标仪测定显色程度，换算成待测物浓度。
3.常见ELISA实验方法分类根据实验过程中抗原抗体结合的方式，ELISA实验可分为以下几类：（1）双抗原夹心法：待测物为抗原，实验中使用两种针对抗原不同表位的抗体；（2）竞争法：待测物为抗体，与固定抗原竞争结合酶标抗体；（3）间接法：待测物为抗体，通过酶标记的二抗检测；（4）免疫共沉淀法：利用抗原抗体结合后形成的免疫复合物与底物结合。
4.各类ELISA实验方法的优缺点及应用场景（1）双抗原夹心法：优点为特异性高、灵敏度高，适用于抗原含量较低的检测；缺点为操作复杂，易出现交叉反应。
（2）竞争法：优点为操作简便，适用于抗体含量较低的检测；缺点为特异性相对较低，易受其他物质干扰。
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抗原分类
1.用于免疫测定方法建立的抗原----ELISA方法 1) 纯化抗原：如HBsAg
从体液，组织或病原体培养物等中采用物理化学方法：超速离心， 过滤层析，电泳分离等分离获得。
注：纯化抗原的纯度对相应的免疫测定方法的特异性有较大的影响 2) 合成抗原（多肽片段） 如HCV
缺乏完整的立体构型决定簇，导致抗体的漏检。 3) 基因工程抗原 HBcAg, HBeAg 和HCV
免疫球蛋白：免疫应答的产物￫抗体 最常见的类风湿因子（RF），可于变性的IgG发生特异的
结合，在ELISA引起非特异性反应。
抗体—分类
IgG
IgA
IgD
IgM
IgA
IgE
在感染或疫苗接种以后，最先出现的抗体是IgM；血内含量低、半衰期短、出现早、消 失快、组织穿透力弱，故其保护作用实际上常不如IgG。
ELISA的原理及分类
50年代的免疫荧光（IFA）和60年代的放射免疫(RIA)分析 技术之后，在70年代初期又建立了用酶来标记抗原或抗体 的分析技术。
由于酶的高效生物催化作用，一个酶分子在数分钟内可以 催化几十几百个底物分子发生反应，产生了放大作用，使 得原来极其微乎其微的抗原或抗体在数分钟后就可被识别 出来，这种技术被称为酶联免疫吸附试验法。
➢ 但是这种特异性也不是绝对的。 ➢ 交叉反应(cross reaction) 当两种不同的抗原物质具有部分相同或
类似结构的抗原决定簇，则可与彼此相应的抗体反应，从而在抗原抗 体反应中可出现交叉反应。
例如：绒毛膜促性腺激素（hCG）和黄体生成激素（LH）均由α和 β两个亚单位组成，其结构的不同处在β亚单位，而两者的α亚单位 是同类的。用hCG免疫动物所得的抗血清中含有抗α-hCG和抗βhCG两种抗体，抗α-hCG抗体将与LH中的α酶位发生交叉反应。在 临床检验中，如用抗hCG抗血清作为妊娠诊断试剂检定尿液中hCG， 只能用于hCG浓度较高的试验，否则妇女生理性排泄入尿液中的微量 LH 将 与 之 发 生 交 叉 反 应 。 因 此 在 作 为 早 孕 诊 断 （ 敏 感 度 应 达 到 50mIu/mlhCG）的实际中必须应用只对hCG特异的抗β-hCG，以 避免与其它激素的交叉反应的发生。
现已成功地应用于多种病原微生物所引起的传染病、寄生 虫病及非传染病等方面的免疫诊断。
ELISA的基本原理
酶联免疫吸附试验 （Enzyme-linked immunosorbent assay ,ELISA） 概念：以酶作为标记指示物、以抗原抗体免疫反
应为基础的固相吸附测定方法。
三个方面：固相支持物 包被的抗原或抗体 酶标记的抗体或抗原和酶反应底物
•大于Ab或者TCR的抗原结合部位 •无机物不能成为抗原； •分子量太小（如对氨基苯甲酸，DNP）的有机物不能成为抗原； •蛋白质是最主要、最常见的抗原； •多糖、脂肪、核苷酸等有机大分子能被B细胞和 gd-T 细胞所识别。
3. 最大特性：免疫应答的特异性
某一特定抗原只能刺激机体产生针对该特定抗原的细胞和体液免疫应答； 某一特定抗原只能与其相应的特异抗体或致敏淋巴细胞产生结合反应。
抗体1 抗体2 抗体3
例如：乙肝病毒中的HBsAg诱导机体的免疫应答产生只针对病毒表面 抗原成分的抗体，HBeAg和HBcAg也可诱导机体产生相应的抗体， 虽然这两种也来源于同一病毒，但表面抗原仅与其相应的抗体结合， 而不与另外两种抗体反应。
抗原抗体反应的这种特异性使免疫测定能在非常复杂的蛋白质化合物 （例如血清）中测定某一特定的物质，而不需先分离待检物。
1. 抗原(antigen，Ag)
一个完整的抗原应包括两方面的免疫性能： ①免疫原性(immunogenicity):诱导宿主产生免疫应答的能力，具有这种能
力的物质称为免疫原(immunogen)； ②免疫反应性(immunoreactivity):抗原与抗体或致敏淋巴细胞发生特异性
结合的能力。
2. 抗原的基本理化特性 ——
缺点：结合的单一性，产生假阴性
➢混合单克隆抗体 ： 杂交瘤技术 ➢双特异性单克隆抗体或多抗： 杂交瘤技术 ➢基因工程抗体 ：基因工程技术
测定中常用标记物，色原低物和终止液
标记物 1. 辣根过氧化物酶（HRP）：国内试剂盒 2. 碱性磷酸酶（ALP）ALP为一种含锌的金属酶。 注：在ELISA中洗涤缓冲液一般均为磷酸盐缓冲液生理盐 水（PBS），含有相对高浓度的磷离子，对ALP有很强的 抑制作用，洗板残留的PBS，足以抑制一半的酶活性。因 此如标记的是ALP，则洗涤缓冲液不能用PBS液。 国外全自动免疫分析仪多使用ALP 3. Β-半乳糖苷酶： 热稳定性差，少用。
4.抗原抗体的结合:
实质上只发生在抗原的抗原决定簇与抗体的抗原结合位点之间。 由抗原决定簇和抗体分子超变区之间空间结构的互补性决定的。 抗体分子N端可变区形成3nm×1.5nm×0.7nm的槽沟，只有与其空间结构互 补的抗原决定簇才能如楔状嵌入。
由于两者在化学结构和空间构型上呈互补关系，所以抗原抗体反应具有高 度的特异性。
HRP的色原底物--反应形式：氧化还原底物的氧化作用。
—OPD（邻苯二胺） 1. 原理：在HRP的作用下，由过氧化氢（H2O2）氧化而聚合成2，2‘-二 氨基偶氮苯（DAB）显色在 pH5.0左右时，DAB在波长450nm处有广范 围的最大吸收。 2. 由于不稳定性，在试剂盒中，OPD均以片剂或粉剂供应，临用前溶解。 3. 缺点：对机体具有致突变作用。
在抗原的反复刺激下，可通过Ig基因的类转换而转向IgG合成
IgG是再次免疫应答的主要抗体；合成速度快、分解慢、半衰期长。可作保护性抗体。
制备抗体的发展技术：
➢多克隆抗体 ：免疫动物后从血清中所得。
抗原通常都有许多的抗原决定簇，所得抗体为针对这些所 有抗原决定簇的抗体混合物。
❖ 抗体的亲和力和特异性相对低于单克隆抗体。 ➢单克隆抗体 ： 杂交瘤技术
早期： 多为病原体的部分抗原，导致敏感性上缺陷。 融合蛋白：对抗原的生物学和免疫学特性能最大程度的保留，工业 化大量 生产，没有提纯抗原存在的传染危险性。
2.干扰免疫测定的抗原 多为物/植物和微生物细胞表面上 的共同抗原，广泛的交叉性，故影响免疫测定的特异性。