小鼠RMND5A的原核表达、纯化及多克隆抗体制备

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牛γ干扰素基因的表达及其多克隆抗体的制备

牛γ干扰素基因的表达及其多克隆抗体的制备宋佰芬;刘哲;曹宏伟;马金柱;徐闯;崔玉东;朱战波;黄玉兰【摘要】为了获得牛γ干扰素表达产物及其多克隆抗体,利用分子生物学软件分析GenBank公布的牛γ干扰素的氨基酸序列,针对这一基因序列设计了一对特异性引物,并从牛脾脏淋巴细胞提取基因组总RNA,采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术扩增出IFN-γ基因,与pMD18-T载体连接后进行酶切、PCR扩增以及序列测定和分析,并将其连接到pQE-30原核表达载体中,命名为pQE30-IFN-γ,转化到大肠埃希菌x-LI Blue感受态细胞,1.0 mmol/L IPTG 37℃诱导表达,经纯化后免疫接种小鼠,用ELISA测定小鼠血清中抗体效价.结果表明,RT-PCR扩增到510 bp的片段,重组蛋白大小为22 ku,与预期大小相符.Western blot分析结果表明,重组蛋白能与His-tag的单克隆抗体反应,说明该蛋白具有良好的免疫活性.用ELISA测定小鼠血清的抗体效价均在1:32 000以上,说明该蛋白免疫效果较好,为下一步研究干扰素的功能奠定了基础.【期刊名称】《动物医学进展》【年(卷),期】2011(032)005【总页数】5页(P36-40)【关键词】γ干扰素基因;克隆;表达;牛【作者】宋佰芬;刘哲;曹宏伟;马金柱;徐闯;崔玉东;朱战波;黄玉兰【作者单位】黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院,黑龙江,大庆,163319;黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院,黑龙江,大庆,163319;黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院,黑龙江,大庆,163319;黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院,黑龙江,大庆,163319;黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院,黑龙江,大庆,163319;黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院,黑龙江,大庆,163319;黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院,黑龙江,大庆,163319;黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院,黑龙江,大庆,163319【正文语种】中文【中图分类】Q786干扰素(interferon,IFN)是在特定的诱生剂作用下,由细胞分泌的具有一定的抗病毒、抗肿瘤和调节免疫功能等活性的糖蛋白[1]。

多克隆抗体的制备方法

多克隆抗体的制备方法多克隆抗体是由多个不同的免疫细胞（多克隆）产生的抗体混合物，可以识别并结合到目标生物标志物上。

多克隆抗体在科学研究、临床诊断和治疗中具有重要的应用价值。

制备多克隆抗体需要经过一系列复杂的实验流程，下面将详细介绍多克隆抗体的制备方法。

一、抗原的选择在制备多克隆抗体时，首先需要选择一个合适的抗原。

抗原通常是目标生物标志物的蛋白质或多肽片段。

选择抗原的关键因素包括其表达水平、稳定性和纯度。

抗原的选择直接影响到最终多克隆抗体的亲和力和特异性。

二、免疫小动物免疫小动物通常是用于制备多克隆抗体的主要实验动物，例如小鼠、兔子、大鼠等。

在免疫前需要确保小动物健康，并对其进行相应的预处理，如注射驱虫药物、进行适当的接种。

还需要根据具体实验要求决定预免疫、免疫计划以及免疫方案的制定。

三、免疫过程免疫过程是制备多克隆抗体的核心环节。

首先需将抗原与适当的佐剂混合，增强免疫原性，然后用于免疫小动物。

在免疫过程中需要控制免疫剂量和免疫间隔时间，以及监测动物的免疫应答情况。

免疫后还需要定期采集血清样本，监测抗体滴度的动态变化。

四、细胞融合与筛选经过一段时间的免疫后，需要从免疫动物的脾脏或骨髓中收集免疫细胞，然后与肿瘤细胞进行融合，得到杂交瘤细胞。

随后采用限稀稀释法将杂交瘤细胞进行单克隆化分，筛选出高亲和力的多克隆抗体细胞株。

五、生产与纯化经过筛选的多克隆抗体细胞株需要进行扩大培养，生产足够数量的多克隆抗体。

之后通过蛋白质纯化技术，如亲和层析、离子交换层析等手段，从细胞培养上清液中纯化出多克隆抗体。

六、性质鉴定与应用纯化后的多克隆抗体需进行性质鉴定，包括亲和力、特异性、稳定性等方面的测试。

最后经过滤菌毒处理后，多克隆抗体可应用于科学研究、临床诊断、生物药物研发等领域。

多克隆抗体的制备是一个复杂的过程，需要科学合理地选择抗原、合理设计免疫方案、熟练掌握细胞融合和筛选技术，以及对多克隆抗体进行严格的生产和性质鉴定。

Nanog基因的原核表达、蛋白纯化及抗体制备的开题报告

Nanog基因的原核表达、蛋白纯化及抗体制备的开题报告
一、研究背景
Nanog是一种关键的转录因子，最早发现于小鼠胚胎干细胞中，并在多种类型的细胞
中表达。

Nanog对于维持胚胎干细胞的自我复制和未分化状态至关重要，并且在晚期
胚胎发育中也有重要的作用。

其功能缺陷会导致胚胎发育停滞，而高表达则可能促进
肿瘤的发生。

因此，了解Nanog的生物学功能，对于解析胚胎发育、干细胞生物学以及诊断和治疗肿瘤具有重要意义。

二、研究目的
本研究主要目的是通过原核表达、蛋白纯化及抗体制备等技术，获得高效纯化的Nanog蛋白和高特异性的Nanog抗体，为了解Nanog的生物学功能、发掘新的作用靶点以及构建Nanog的作用网络提供有力的实验工具。

三、研究内容及方法
1. Nanog基因的原核表达
将人类Nanog基因克隆入原核表达载体pET-28a，构建重组质粒；通过化学转化等方
法将重组质粒导入大肠杆菌（E.coli）细胞内，利用IPTG诱导表达。

2. Nang蛋白的纯化
以Ni2+-NTA亲和层析纯化为主，包括裂解菌细胞、提取目标蛋白、层析纯化、洗脱
靶蛋白、再生反应等步骤。

3. Nanog抗体的制备
将Nanog蛋白注射入小鼠体内，诱导其产生相应的抗体；待抗体滴度达到一定水平后，收集小鼠血清，进行免疫球蛋白纯化、测定抗体滴度等步骤，最终获得高纯度的Nanog抗体。

四、预期结果
通过本研究的实验操作，预计能够获得高效纯化的Nanog蛋白和高特异性的Nanog抗体。

这将为深入研究Nanog的生物学功能、构建Nanog的作用网络提供有力的实验手段，并有望为临床医学提供新的诊断和治疗思路。

多克隆抗体制备的基本过程

多克隆抗体制备的基本过程
多克隆抗体制备的基本过程包括以下步骤：
1. 免疫原的选择：选择合适的免疫原，可以是蛋白质、多肽、细胞表面抗原等。

2. 免疫动物的选择：选择适合的免疫动物，常见的包括小鼠、兔子等。

3. 免疫动物的免疫：将免疫原注射到免疫动物体内，刺激其免疫系统产生特异性抗体。

4. 收集免疫动物的血清：在免疫动物免疫一段时间后，收集其血清，其中含有特异性抗体。

5. 分离特异性抗体：通过多种方法如沉淀、层析等技术，将特异性抗体从血清中分离出来。

6. 筛选特异性抗体：对分离出的抗体进行筛选，通常采用ELISA、免疫组化等方法，筛选出特异性较好的抗体。

7. 克隆特异性抗体：将特异性较好的抗体细胞与骨髓瘤细胞（如SP2/0）融合，形成杂交瘤细胞。

8. 杂交瘤细胞的筛选：通过培养基中添加抗代谢毒物质如氨甲酰青霉素（HAT），筛选出只含杂交瘤细胞的细胞。

9. 单克隆抗体的扩增：将筛选出的单克隆细胞进行培养和扩增，得到大量的单克隆抗体。

10. 纯化和鉴定：对单克隆抗体进行纯化和鉴定，确保其纯度和特异性。

11. 应用：获得的多克隆抗体可以应用于免疫组化、免疫沉淀、免疫印迹、免疫荧光等实验和应用中。

需要注意的是，多克隆抗体制备的过程可能因具体实验目的、免疫动物的选择等因素而有所差异。

以上是一般的基本步骤，具体实验过程中还需根据实际情况进行调整和优化。

蛋白的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备方法参考

蛋白的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备方法参考一、蛋白的原核表达实验目的蛋白的原核质粒的构建。

适用范围蛋白原核表达。

实验原理参考实验室工具书《分子克隆实验指南》《抗体制备与使用实验指南》实验试剂病毒RNA的提取（Trizol法）相关试剂，反转录相关试剂（M-MLV Buffer、10M dNTPs、DEPC水、随机引物、RNA酶抑制剂、反转录酶M-MLV），GenStar高保真酶，T4连接酶，菌液PCR相关试剂，Western blot试剂盒实验设备和材料DH5a感受态细胞、BL21感受态细胞操作步骤（一）病毒RNA的提取（Trizol法）参照分子克隆的方法进行，（1）将250 μL液体样品加入1.5 mL Ep 管中，再加入750 μL冰预冷的TRIZOL。

（2）将样品剧烈混合后，在室温静置5 min。

（3）加入200 μL氯仿，颠倒Ep管混和两次，并剧烈振荡混和，使液体充分混匀呈乳白状（无分相现象）后，再室温静置5 min。

（4）在4℃条件下，以12000×g 离心15 min。

（5）将上层水相转移到一个新的Ep 管中，加入等体积的异丙醇并上下颠倒混匀，然后在室温静置至少 10min。

（6）在4℃条件下，以12000×g 离心15 min 后，小心并尽可能地去除全部上清液。

（7）用1 mL 75% DEPC 乙醇洗涤RNA 沉淀和管壁，4℃ 12000×g离心5 min后小心弃去乙醇。

（8）将RNA沉淀进行干燥（不能完全干燥）处理后，用 10μL 无 DEPC 水（无RNA酶的水）将RNA溶解并于-20℃保存。

（二）反转录反应体系（20 μL）：按下列顺序加样M-MLV Buffer 4 μL10M dNTPs 1 μLDEPC 水 3 μL随机引物 1 μL RNA酶抑制剂 0.5 μL反转录酶 M-MLV 1 μL提取的 RNA 9.5 μL总体积20 μL反应条件：42℃水浴 1~1.5 h（三）引物设计与合成依据新城疫毒株全基因序列，运用Oligo或者Primer Premier5.0软件设计上下游引物，设计引物是注意选择常用的酶切位点以及保护性碱基的添加引物使用前用灭菌超纯水配成相应浓度，-20℃保存备用。

多克隆抗体制备课件

• 乳化: 一般抗型变原态与反免应,疫并佐使其剂增体强积。比1:1混合。首次免疫采用完全佐剂，加强免疫采用不完全佐剂。
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免疫方式
• 注射途径: 免疫注射的途径也很重要。一般采用多点注射，一只动物注射总数约为8～ 10点，包括足掌及肘窝淋巴结周围，背部两侧、颌下、耳后等处皮内或皮下，皮内易引起细胞免疫反应，对提高抗体效价有利
多克隆抗体制备
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多克隆抗体的制备方法
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动物选择
一、选择制备多克隆抗体(抗血清)的动物种类应考虑的要点: •需要制备的抗血清的质量; •供给蛋白质抗原的动物与免疫动物之间的种系关系; •免疫动物产生的抗体特性（针对不同性质的免疫原选用相应的动物）。二、动物的年龄、性别和数量对抗体制备的影响
血液采集
采血量
少量
采血部位
尾静脉，耳静脉，眼底静脉
中量
耳中央动脉，颈动/静脉，心脏
大量
股动脉，颈动脉，心脏，摘眼球
血清的分离：采取4℃静置过夜，3000-4000 转离心10-15min钟。
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多克隆抗体纯化
•蛋白A亲和层析 •蛋白A可与多种哺乳动物的IgG重链的Fc片段相结合也可与某些IgM和IgA相结合 •抗原亲和纯化 •多抗的亲和层析是基于抗原与抗体结合的一种层析方式。基本思路是将抗原固定在一种基质上, 然后与抗血清孵育以捕获相应的抗体, 然后从基质上洗掉非特异性结合的抗体, 最后再将抗体洗脱下来
.鸡Biblioteka 鸡的种系距哺乳动物较远,用以制备抗哺乳动物蛋白质的抗体具有独特的优点。
鸡的IgG常称IgY,其特点是不会激活哺乳动物的补体成分C1,也不会与细菌蛋白A或蛋白质G、哺乳动物的 Fc受体或类风湿因子等发生反应。在极端条件下,鸡 IgY的稳定性不如家兔IgG,不过,鸡的IgY在鸡蛋内可保持稳定达数月之久,纯品IgY在中性缓冲液和冷藏条件下则可保存数年之久。用鸡IgY已经制备出Fc和单价的Fab或Fab′等片段。鸡可将大量IgY输送入鸡蛋黄中, 从鸡蛋中收获抗体可避免采用损伤性的收集手段。

基因片段Myo5a原核表达、纯化及多克隆抗体制备

基因片段Myo5a原核表达、纯化及多克隆抗体制备①游荷花唐锐敏②（山西医科大学汾阳学院免疫学与免疫学检验教研室，汾阳 032200）中图分类号R730.2 文献标志码 A 文章编号1000-484X（2023）10-2227-05［摘要］目的：制备了PGEX-4T-3/Myo5a原核表达载体，并表达与纯化融合蛋白，制备其多克隆抗体。

方法：通过PCR 扩增Myo5a末端一个基因小片段，Bam HⅠ和XhoⅠ双酶切后，连接到原核载体pGEX-4T-3，制备原核表达载体PGEX-4T-3/Myo5a。

鉴定后，在BL21菌中诱导表达蛋白并对重组蛋白进行纯化，重组蛋白PGEX-4T-3/Myo5a采用聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹进行鉴定。

采用融合蛋白免疫家兔，制备其抗血清，测定抗血清效价和特异性。

结果：经鉴定后原核表达载体PGEX-4T-3/Myo5a制备成功，表达的重组蛋白相对分子量约为30 kD。

免疫家兔后抗血清滴度为1∶128 000，免疫印迹和间接免疫荧光证明其特异性。

结论：实验成功制备了PGEX-4T-3/Myo5a原核表达载体，融合蛋白具备了较高的免疫反应性，并得到了其多克隆抗体，为进一步探讨Myo5a的生物学意义做了铺垫。

［关键词］PGEX-4T-3/Myo5a；原核表达；蛋白表达与纯化；多克隆抗体Prokaryotic expression of Myo5a gene fragment， purification and preparation of polyclonal antibodyYOU Hehua， TANG Ruimin. Department of Immunology and Laboratory Immunology， Fenyang College of Shanxi Medical University， Fenyang 032200， China［Abstract］Objective：The prokaryotic expression vector pGEX-4T-3 /Myo5a was prepared， the fusion protein was expressed and purified， and polyclonal antibody was prepared. Methods：One small fragment of Myo5a was amplified by PCR. After Bam HⅠ and XhoⅠdouble digestion， the fragments were inserted into prokaryotic expression vector pGEX-4T-3 to construct one prokaryotic expression vectors pGEX-4T-3/Myo5a. After correct identification，BL21 prokaryotic expression bacteria were transferred to IPTG induction. The recombinant protein pGEX-4T-3/Myo5a was purified and the recombinant protein was identified by SDS-PAGE electro‑phoresis and Western blot. The rabbit was immunized with fusion protein， whose antiserum was prepared and its titer and specificity were determined. Results：After identification， the prokaryotic expression vector pGEX-4T-3/Myo5a was prepared correctly， and the relative molecular weight of the expressed recombinant protein was about 30 kD. After immunizing rabbits，the antiserum titer was 1∶ 128 000， and the specificity was proved by Western blot and indirect immunofluorescence. Conclusion：The PGEX-4T-3/Myo5a prokaryotic expression vector is successfully prepared， the fusion protein had high immune reactivity， and its polyclonal antibody is obtain， which paved the way for further exploration of the biological significance of Myo5a.［Key words］PGEX-4T-3/Myo5a；Prokaryotic expression；Protein expression and purification；Polyclonal antibodyMyosin是肌球蛋白，又称肌凝蛋白，是真核细胞里的一类ATP依赖型分子马达［1］。

人类新基因RMND5A的克隆及功能研究

ＴＡＮＧｎ－ａｎ，ＬＩＧｕａＷｅｘｉｎ，ＤＥＮＧｕＹｎ，ＹＵＡＮＷｕ－ｈｕ，ＬｚｏＩ一ｉｇ，ＷＡＮＧｕ — ｕｑｎＹｅｑｎ，
ＺＨＵＣｕｎｂｎ．ｈａ－ｉｇ
Ｘｉ－ｈｎｕｓａ
（ｈｅｔｒｏｅｒＤｖｌｍｎ，ＫｙＬｂｏａｏａＥｕａｏｉｉｒＣｌｇｆｉｃｅｃ，ｕａｏｍａＴｅＣｎｅｒＨａｔｅｅｐｅｔｅａｆｔｎｄｃｔｎＭｎｓｙ，ｏｌｅｏｆＳｉｅＨｎｎＮｒｌｆｏＮｉｌｉｔｅＬｅｎ
控过程．
关键词
ＲＤＡ；隆；ＭＮ５克表达；ＰＭＡＫＱ１８２文献标识码Ａ ‘ 文章编号１０－５７２０）１０８－５００２３（０８Ｏ－５００
中图分类号
ＣｌｎｎｎｕｃｉｎｌａｙｉｆａＮｏｅｍａｎｏｉｇａｄＦｎｔａｏＡｎｌｓｓｏｖｌＨｕｎＧｅｅＲＭＮＤ５Ａ
ＵｉｅｉＣａｇｈ１０１，ｈａｎｖｒｔｓｙ，ｈｎｓａ４０８Ｃｉ）ｎ
ＡｂｓｒｃＷｅｃｏｅｖｌｈｍａｅｅｗｈｃｏｔｉｓＬｉｈｔａｔｌｎｄａｎｏｅｕｎｇｎｉｈｃｎａｎｓ／ＣＴＬＨｍａｎａｄｎｍｅｄｏｉｎａｄＲＭＮＤ５ａｐＡｓａ。ｐｏｅｙＨＵＧＯｏｎｃａｕｅｃｍｍｉｅ．Ｔｈｓｇｎｓｌｃｔｄｉｈｏｓｍｅ２ｐｌ．２．Ｉｓｃｒｖｄｂｎｍｅｌｔｒｏｔｅｔｉｅｅｉｏａｅｎｃｒｍｏｏ１ｔＤＮＡｓｏ３９ｂｐｉｆ３２ａｏｉｇａｐｌｐｐｉｅｃｎａｎｎ９１ａｎｃｄｔｓｄｏｉｎｄｃｄｎｏｙｅｅｄｏｔｉｉｇ３ｍｉｏａｉｓｗｉｈａＬｉＨｍａｎ，ａＣＴＬＨｍａｎａｄａＣＲＡｏｉｒｍｄｏｉｎｄｍａｎｆｏＮ—ｔｔｒｎ１ｏＣ—ｅｍｉａ．Ｔｈｓｇｎｓｅｐｅｓｄｉｓｆｔｅｔｓｕｓｏｕｎｅｉｅｅｉｘｒｓｅｎｍｏｔｏｈｉｓｅｆｈｍａｍｂｒｏ，ｅｐｅｉｌｙｈｇｅｎｔｅｈａｔｙｓｓｃａｌｉｈｒｉｅｒ，ｈｌｅｎｉｎｙ．ＴｅｐｏｅｎｗａｘｒｓｅｄｕｓｄｔｍｍｕｚｂｉｓｔｂａｎｔｅｐｌｃｏａｎｉｏｙａａｎｔｉｒａｄｋｄｅｈｒｔｉｓｅｐｅｓｄａｅｏｉｖｎｎｉｅＲａｂｔｏｏｔｉｏｙｌｎｌａｔｄｇｉｓｈｂＲＭＮＤ５Ａ．ＯｖｒｘｒｓｉｎｏｅｅｐｅｓｏｆＲＭＮＤ５ｉＡｎＣＯＳ７ｃｌｓｍａｅｒａｌｎｉｉｅｔａｃｉｔｏｃｉｉｅｆＥＬＫ一ｅｌｙｒｍａｋｂｙｉｈｂｔｔｒｎｓｒｐｉｎａｔｖｔｓｏｈｉ１ａｄＡＰ一ａｒｗｎｓｒａｅｆｃｏｓｏｎ１ｔｔａｅｄｏｈｔｅｍｆｔｒｆＭＡＰｐａｈｙ．Ｉｏｌｉｎ，ＲＭＮＤ５ｍａｎｖｌｅｎｒｇｌｔｏｅＫｔｗａｎｃｎｃｕｓｏＡｙｂｅｉｏｖｄｉｅｕａｎｉ

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小鼠ＲＤ的原核表达、化及多克隆抗体制备ＭＮ５Ａ纯
朱泽安，范雄伟，邓云，莫小阳，万永奇，李永青，袁婺洲，江志钢吴秀山，王跃群
（南师范大学蛋白质化学及发育生物学教育部重点实验室，心脏发育研究中心，湖南长沙４０８）湖１０１
融合蛋白。通过尿素洗涤包涵体并切胶回收纯化融合蛋白，免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体，ｓｒｌｔＷｅｔｎｂ检ｅｏ
测抗体活性。结果说明，获得了ＲＤＡ原核表达重组融合蛋白及高效价的特异性兔抗ＲＤＡ多克隆抗ＭＮ５ＭＮ５
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第１９卷第２ｊ９ｊ
２１００年４月
激
光
生
物
学
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Ｖｏ．１．１９Ｎｏ２Ａｐｒ２０．０１
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ｐａｍｉ，ｗｓｉｄｃｄｗｔＩＴ（ｓｐｏｙｈｏＢＤ—ａｃｓｅ．ＴｅｆｓｎｐｏｉａｕｉｅｙＵＥｎｅａｌｓｄａｕｅｉＰＧｉｒｐｈｉ—— ｇｌｔｉ）ｈｉｒｔｎｗｓｒｄｂＲＡａｄｓｐ — ｎｈｏａｏｄｕｏｅｐｆｉ
摘要：ＭＤＡ通过ＭＰＲＮ５ＡＫ信号途径参与了对细胞生命活动的调控过程。通过ＰＲ扩增ＲＤＡ基因，ＣＭＮ５并
将其克隆至表达载体ｐＥ４一上，化至大肠杆菌Ｂ２（Ｅ），通过ＩＴＧＸ－Ｔ１转Ｌ１Ｄ３中再ＰＧ进行诱导表达ＧＴＲＤＡＳ — ＭＮ５
体，ＲＤＡ进一步的功能研究奠定了基础。为ＭＮ５
关键词：ＭＤＡＲＮ５Ｑ８
文献标识码：Ａ
文章编号：０７１６２１）２２３０１０－４（０００￣７－７５
ＰｒｋａｙｔｃＥｘｅｓｏｏｒｏｉｐｒｓｉｎ，ＰｕｒｆｃｔｏｏｏｅＲＭＮＤ５ｉｉａｉｎｆＭｕｓＡ
４ — ａｄｔｎｆｍｅｔＥｃｅｉｉｏｉＩＴｌｎａｓｒｄｉｏｓｈｒｈａｃｌＢ２１（Ｅ．ＴｅＢ＿１（ＥｒｏｎｃＤ３）ｈＩ２Ｄ３）ｓａｎｏｔｎｎＭＮ５ｅｏｉａｔｔｉ，ｃｎａｉｇＲＤＡｒｃｍｂｎｎｒｉ
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