核酸序列分析与DNA计算共88页
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核酸序列分析
思考题
1.第一代DNA测序技术的核心技术 A.Sanger的双脱氧链终止法 B.Maxam和Gilbert的化学降解法 C.荧光标记技术 D.PCR技术 E.DNA自动分析技术
2. Sanger双脱氧链终止法使用的链终止物
A. NTP
B. dNTP
C. ddNTP
D. a-32P-dNTP E. a-35S-dNTP
• 反应体系中包含：模板 DNA,
Taq酶, dNTPs, ddNTPs和测 序引物；
• 反应过程：
变性－复性－延伸－终止
双脱氧链终止法基本原理：
➢利用DNA聚合酶不能
够区分dNTP和ddNTP的
特性，使ddNTP参入到
寡核苷酸链的3’-末端。
因为ddNTP 3’不是-OH，
不能与下一个核苷酸聚
合延伸，从而终止DNA 链的增长。
目前，应用最广泛的应用生物系统公司(applied biosystems ，ABI)3730系列自动测序仪即是基于毛细管 电泳和荧光标记技术的DNA测序仪。
如ABI3730XL测序仪拥有96道毛细管，4种双脱氧核 苷酸的碱基分别用不同的荧光标记，在通过毛细管时不同长 度的DNA片段上的4种荧光基团被激光激发，发出不同颜色 的荧光，被CCD检测系统识别，并直接翻译成DNA序列。
2011：5000美元测定一个人类基因组 2014：上万元测定一个人类基因组
未来目标：1000/100 美元测定一个人类基因组
1、第一代DNA测序技术
第一代DNA测序技术： 传统的双脱氧链终止法、化学降解法以及在它们的基
础上发展来的各种DNA测序技术。
第一代DNA测序技术包括：双脱氧链终止法、化学降 解法、荧光自动测序技术。
核酸序列分析
调节按钮
4. 测序中载体序列的识别与去除
许多数据库中收集了常用的测序载体序列，使用Blast程序对 此类数据库进行相似性分析即可得知目的序列中是否含有载 体序列。如果是，在对测序数据进行进一步分析之前必须将 载体序列去除。此过程虽然很简单，在核酸序列数据库中仍 然有一些序列含有载体序列污染。 NCBI的载体识别程序 /VecScreen/VecScreen.html
复杂的基因结构
外显子 外显子 启动区 5’UTR 内含子 内含子 5’ 转录位点 起始密码子 剪切受体位点 终止密码子 外显子 内含子 3’UTR终止区 3’
剪切给体位点
复杂的基因转录调控方式 内含子 GT----AC规则 ＣpG岛
真核生物基因组ＧＣ含量没有原核生 物差异那么明显.但在人基因５‘端 有ＣpＧ岛，大约有４５，０００这 样的岛，有一半和持家基因有关。
得到的结果
显示转换后的不同序列
序列基本信息 具 体 序 列
2. 限制性酶切分析
限制型酶切分析是分子生物学实验中日常工作之一。
限制酶数据库提供了较全面的限制酶相关信息
地址为：/rebase/rebase.html
大多数分子生物学软件都具有限制性酶切分析功能，
• 非翻译区域（untranslated regions, UTR） –编码区域两端的DNA，有一部分被 转录，但是不被翻译，这一部分称为 非翻译区域
• 5’UTR---基因上游区域的非翻译区域 • 3’UTR---基因下游区域的非翻译区域
• 对于任何给定的核酸序列（单链DNA 或mRNA），根据密码子的起始位置， 可以按照三种方式进行解释。 • 例如，序列ATTCGATCGCAA （1） ATTCGATCGCAA （2） ATTC GATCGCAA （3） ATTCGATCGCAA
第六章 核酸序列分析
微卫星DNA（Microsatellite DNA）又称短串联重复或简单重复序列，
微卫星筛选流程筛选
从有关数据库（GenBank, EMBL 等）或文章中查询 构建基因组 筛选SSR位点 使用近缘种的引物
获得引物
PCR扩增
（基于PCR与限制性酶切技术结合的DNA标记） ④AFLP（amplified fragments length polymorphism）标记：扩增
1:3~4)。
少一个-OH
双脱氧核苷三磷酸
互补链合成过程
如果在DNA的合成反应中，除了加入 4种正常的脱氧核
苷三磷酸（dNTP）外，再加入一种少量的2’,3’-ddNTP，那 么多核苷酸链的延伸将与偶然发生但却十分特异的链终止展 开竞争，所以反应产物是一系列的长短不一的核苷酸链。
在 4 组 独 立 的 DNA 合 成 反 应 中 ， 分 别 加 入 4 种 不 同 的
段，测序获得SNP位点信息，适于调查未知SNP位点和连续分
布（1kb以内）的SNP位点信息。 • 直接测序法进行SNP分析
•
PCR-限制性酶切：如果某个SNP位点恰好是限制性酶切位点，
则通过PCR酶切再结合电泳分析不失为一种简单经济的区分方 法，适于单个的SNP位点分析。
PCR-SSCP：
单链构象多态性检测（Single-Strand Conformation Polymorphism，SSCP）是一种基于DNA构象差别来检测
二、DNA序列测定
即核酸DNA分子一级结构的测定，是现代分子生物学一项 重要的技术。 1963年，Sanger和Thompson等人第一次完成胰岛素51个 氨基酸的序列测定。70年代后期，Sanger和Maxam----Gilbert 等人又建立了核酸序列测定的方法，Sanger双脱氧末端终止法 和Maxam----Gilbert化学裂解法将核酸序列测定技术推进到 “直读”阶段，使核酸序列测定变得远比蛋白质氨基酸序列测 定容易，这样人们可以通过核酸序列和遗传密码推导出蛋白质 氨基酸的序列。
DNA序列分析 doc
DNA序列分析引言DNA（脱氧核糖核酸）是生物体内负责遗传信息传递的分子，其中包含有机体基因的序列。
DNA序列分析是通过对DNA序列进行计算和统计分析，来揭示其中的信息和模式的过程。
DNA序列分析在生物学、遗传学、进化学以及疾病研究等领域中有着重要的应用和意义。
本文将介绍DNA序列分析的几个主要方面，包括DNA序列的基本概念、序列比对、序列重复性分析以及序列模式识别等内容。
DNA序列的基本概念DNA序列是由由四种碱基（腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和鳞状嘧啶）构成的字符串，它们的顺序决定了生物体中的遗传信息。
DNA序列可以通过实验方法（如测序技术）或计算方法（如基因组学和转录组学）获取。
序列比对序列比对是比较两个或多个DNA序列之间的相似性和差异性的过程。
序列比对可以帮助我们理解DNA序列之间的相关性，发现基因的保守区域和变异位点，以及预测蛋白质结构和功能。
常用的序列比对算法包括全局比对算法和局部比对算法。
全局比对算法（如Needleman-Wunsch算法）适用于较为相似的序列，而局部比对算法（如Smith-Waterman算法）则适用于相似性较低的序列。
序列重复性分析序列重复性是指DNA序列中出现的重复模式。
序列重复性分析可以帮助我们识别基因组中的重复区域、转座子和重复序列。
重复序列在基因演化、基因组结构和疾病研究等方面起着重要的作用。
常用的序列重复性分析方法包括重复序列的寻找和分类、序列间重复比较以及重复序列的起源和进化分析等。
序列模式识别序列模式识别是通过寻找DNA序列中特定的模式或模板，来揭示序列中隐藏的信息。
序列模式识别可以帮助我们发现DNA序列中存在的转录因子结合位点、启动子序列以及编码区域等。
常用的序列模式识别方法包括正则表达式、隐马尔可夫模型和机器学习算法等。
结论DNA序列分析是生物科学中重要的研究领域，通过对DNA 序列的计算和统计分析，可以帮助我们深入理解基因组的结构和功能，揭示生物体间的亲缘关系，以及研究基因组变异和疾病相关的遗传因素。
核酸序列分析
概念： 概念： 电泳 electrophoresis 带电的物质在电场中的趋向运动。 带电的物质在电场中的趋向运动。 凝胶电泳 Gel electrophoresis 以琼脂糖和聚丙酰胺为支持介质 的电泳技术。 的电泳技术。
琼脂糖凝胶电泳
在PH3.5时，碱基上的氨基基团解离， PH3.5时 碱基上的氨基基团解离， 而三个磷酸基团只有一个解离， 而三个磷酸基团只有一个解离，整个核 酸分子带正电荷。 酸分子带正电荷。 PH值为8.0-8.3时 碱基几乎不解离， 值为8.0 在PH值为8.0-8.3时，碱基几乎不解离， 磷酸全部解离，核酸分子带负电荷。 磷酸全部解离，核酸分子带负电荷。若 将由PH8.0 PH8.0电泳缓冲液制成的凝胶置于电 将由PH8.0电泳缓冲液制成的凝胶置于电 场中， 场中，核酸分子由于带负电会向正极泳 动。
Maxam-Gibert
，
化学修饰法测定 DNA序列的原理
，
5 -GATCACTACTG-3
，
5 -GATCACTACTG-3
，
G
G+A
C+T
C
G
G+A
T+C
C
DNA测序自动化和大规模测序
双脱氧法和化学修饰法的缺点： 双脱氧法和化学修饰法的缺点： 放射性 操作步骤烦琐 效率低 读片过程慢
激光测序法 通过ddNTP 随机竞争终止新合成DNA DNA的互 通过ddNTP 随机竞争终止新合成DNA的互 补链。 补链。 引物标记系统： 引物标记系统： 四种不同的荧光染料标 记引物。 记引物。 终止标记系统： 终止标记系统：4种不同的荧光染料标记 四种双脱氧核糖核酸
：
大片段DNA 大片段DNA 序列测定的策略
鸟枪法 互套式缺失法 引物延伸法
琼脂糖凝胶电泳
在PH3.5时，碱基上的氨基基团解离， PH3.5时 碱基上的氨基基团解离， 而三个磷酸基团只有一个解离， 而三个磷酸基团只有一个解离，整个核 酸分子带正电荷。 酸分子带正电荷。 PH值为8.0-8.3时 碱基几乎不解离， 值为8.0 在PH值为8.0-8.3时，碱基几乎不解离， 磷酸全部解离，核酸分子带负电荷。 磷酸全部解离，核酸分子带负电荷。若 将由PH8.0 PH8.0电泳缓冲液制成的凝胶置于电 将由PH8.0电泳缓冲液制成的凝胶置于电 场中， 场中，核酸分子由于带负电会向正极泳 动。
Maxam-Gibert
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化学修饰法测定 DNA序列的原理
，
5 -GATCACTACTG-3
，
5 -GATCACTACTG-3
，
G
G+A
C+T
C
G
G+A
T+C
C
DNA测序自动化和大规模测序
双脱氧法和化学修饰法的缺点： 双脱氧法和化学修饰法的缺点： 放射性 操作步骤烦琐 效率低 读片过程慢
激光测序法 通过ddNTP 随机竞争终止新合成DNA DNA的互 通过ddNTP 随机竞争终止新合成DNA的互 补链。 补链。 引物标记系统： 引物标记系统： 四种不同的荧光染料标 记引物。 记引物。 终止标记系统： 终止标记系统：4种不同的荧光染料标记 四种双脱氧核糖核酸
：
大片段DNA 大片段DNA 序列测定的策略
鸟枪法 互套式缺失法 引物延伸法
核酸序列的基本分析
功能域和蛋白质互作预测
总结词
识别蛋白质中的功能域以及预测蛋白质 之间的相互作用。
VS
详细描述
功能域是蛋白质中负责特定生物功能的区 域，通过分析核酸序列，可以识别出蛋白 质中的功能域，进一步了解其生物学功能 。此外，还可以利用生物信息学方法预测 蛋白质之间的相互作用，揭示基因网络中 的相互关系。
系统生物学和网络分析
基因组组装
01
基因组组装是将测序得到的短读段组装成完整的基因组序 列的过程。
02
基因组组装是基因组学研究中的关键步骤，对于理解基因 组结构和功能、发现新基因和基因变异等具有重要意义。
03
基因组组装可以使用各种软件和算法，如SOAPdenovo、 Velvet和Abyss等，根据不同的测序技术和数据类型选择合适
核酸序列的表示方法
符号表示
通常使用大写字母表示碱基，如A代表腺嘌呤，G代表鸟嘌呤，C代表胞嘧啶， T代表胸腺嘧啶。
转录和翻译
DNA中的信息通过转录过程传递给RNA，然后通过翻译过程将RNA的信息转化 为蛋白质。
核酸序列的来源和测序方法
来源ห้องสมุดไป่ตู้
核酸序列可以从各种来源获得，如细菌、病毒、动植物等。
测序方法
总结词
从整体角度研究生物系统的结构和功能，通 过网络分析揭示基因之间的相互关系。
详细描述
系统生物学将基因、蛋白质等生物分子视为 相互关联的网络，而非孤立的实体。通过构 建基因调控网络、蛋白质互作网络等，可以 全面了解基因的功能及其在生物过程中的作 用。网络分析有助于发现关键基因、模块和 通路，为药物研发和疾病治疗提供新的思路。
06
实际应用和案例分析
基因组学研究中的应用
核酸序列分析与DNA计算
基本原理
将DNA片段的末端磷酸基作放射性标记，再分别采用不同的 化学方法修饰和裂解特定碱基，从而产生一系列长度不一的 DNA片段，这些片段群通过凝胶电泳分离，再经放射线自显 影，确定裂解位点碱基的种类和相对排列顺序，从而得出目 的 DNA 的碱基序列。
所用特异性试剂主要是硫酸二甲酯（腺嘌呤 A 的 N2 和鸟 嘌呤 G 的 N７ 甲基化 ）、肼（胞嘧啶 C 和胸腺嘧啶 T 的 C4 和 C6 位置开环）和哌啶（从修饰甲基处断裂核苷酸 链）。
四种终止物必须在4个PCR管中分别进行反应，即每管加1种 ddNTP DNA聚合酶Ⅰ，单链DNA模板，引物 ，四种dNTP（其 中一种为同位素标记），还有少量的ddNTP。
+ddATP
+ddCTP
每管均有正常的 dNTP，而ddNTP 约为dNTP浓度的 100-5000倍，这 样对于每个反应 管能形成一系列 以同个ddNTP为 3’端结尾的长 短不一片段的混 合物。 一般来说，测 序产物的平均 链长取决于 ddNTP与dNTP 的比例，比例 高时，得到较 短的产物；
标记终止物
四种混合物可以在一个PCR管中进行反应，当 然也可跑一道电泳。
只需一道电泳检测
荧光检测探头
讨论
Sanger法的改进
Sanger测序反应与PCR的差异
测序只用一条引物，PCR需要两条引物
测序反应需要加入dNTP和 ddNTP,PCR反应只需 dNTP
测序产物线性增长，PCR产物指数增长
1、 双脱氧链终止法
1977年Sanger等提出了“终止 法”。 这是一种利用双脱氧核苷三磷酸 （ddNTP），将延伸的DNA链特 异性终止的技术。
互补链合成过程
第四章核酸序列分析
EBI整理的生物软件目录biocatalog ()，包含有近千个软件，其中包括常用的引 物设计软件Primer Premier和酶切位点设计软件WEBcutter等，基本上是最全的专业 软件目录。
o 相关资源 CENSOR http:///censor/ RepeatMasker http://-bin/ WEBRepeatMasker Repbase
这些网站上的在线程序可帮助识别并去除重复序列。
➢同源性检索
一般来说，数据库相似性搜索是进行基因辨识的最初手段，也是 DNA序列分析的最基本步骤。
一个全长的cDNA分子可以有许多个EST，但特定的EST有时可以代表某个特 定的cDNA分子。首先对获得的EST数据进行同源性性分析，两端有重叠的共有 序列的EST可以组装成一个叠连群，直到装配成全长的cDNA序列，然后再进行 ORF和相关功能位点的判定，这样就等于是克隆了一个基因的编码序列。还可以 将EST作为一种标记序列定位在基因组，从而明确这个cDNA的基因组结构，包 括外显子、内含子等。
Kozak规则是研究第一个ATG侧翼序列的碱基分布所满足的统计规律， 若将第一个ATG中的碱基A，T，G分别标为1，2，3位，则Kozak规则可 描述如下： • 第4位的偏好碱基为G； • ATG的5’端约15bp范围的侧翼序列内不含碱基T； • 在-3，-6和-9位置，G是偏好碱基； • 除-3，-6和-9位，在整个侧翼序列区，C是偏好碱基。 Kozak规则是基于已知数据的统计结果，不见得必须全部满足，一般来说， 满足前两项即可。
在线分析<7000bp序列，大于此 长度的可通过E-mail进行分析
IDB
内含子序列数据库
ExInt Intronerator GenScan
o 相关资源 CENSOR http:///censor/ RepeatMasker http://-bin/ WEBRepeatMasker Repbase
这些网站上的在线程序可帮助识别并去除重复序列。
➢同源性检索
一般来说，数据库相似性搜索是进行基因辨识的最初手段，也是 DNA序列分析的最基本步骤。
一个全长的cDNA分子可以有许多个EST，但特定的EST有时可以代表某个特 定的cDNA分子。首先对获得的EST数据进行同源性性分析，两端有重叠的共有 序列的EST可以组装成一个叠连群，直到装配成全长的cDNA序列，然后再进行 ORF和相关功能位点的判定，这样就等于是克隆了一个基因的编码序列。还可以 将EST作为一种标记序列定位在基因组，从而明确这个cDNA的基因组结构，包 括外显子、内含子等。
Kozak规则是研究第一个ATG侧翼序列的碱基分布所满足的统计规律， 若将第一个ATG中的碱基A，T，G分别标为1，2，3位，则Kozak规则可 描述如下： • 第4位的偏好碱基为G； • ATG的5’端约15bp范围的侧翼序列内不含碱基T； • 在-3，-6和-9位置，G是偏好碱基； • 除-3，-6和-9位，在整个侧翼序列区，C是偏好碱基。 Kozak规则是基于已知数据的统计结果，不见得必须全部满足，一般来说， 满足前两项即可。
在线分析<7000bp序列，大于此 长度的可通过E-mail进行分析
IDB
内含子序列数据库
ExInt Intronerator GenScan