土壤微生物生物量的测定方法氯仿熏蒸

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土壤微生物生物量的测定方法

1土壤微生物碳的测定方法（
熏蒸提取----仪器分析法）

1.1 基本原理
新鲜土样经氯仿熏蒸后（24h），土壤微生物死亡细胞发生裂解，释放出微生物生
物量碳，用一定体积的0.5mol/LKSO溶液提取土壤，借用有机碳自动分析42仪
测定微生物生物量碳含量。根据熏蒸土壤与未熏蒸土壤测定有机碳的差值及转换

系数（K），从而计算土壤微生物生物量碳。 EC1.2 实验仪器
自动总有机碳（TOC）分析仪（Shimadzu Model TOC—500,JANPAN）、真空 干
燥器、烧杯、三角瓶、聚乙烯熟料管、离心管、滤纸、漏斗等。1.3 实验试剂
1）无乙醇氯仿（CHCL）； 32）0.5mol/L硫酸钾溶液：称取87g KSO溶于1L蒸
馏水中 423）工作曲线的配制：用0.5mol/L硫酸钾溶液配制10ugC/L、30ugC/L、
50ugC/L、
70ugC/L、100ugC/L系列标准碳溶液。（其实一般情况下，

仪器会自带的标曲，一般不用自己做的）

1.4 操作步骤
1.4.1 土壤的前处理（过筛和水分调节略）
1.4.2 熏蒸
称取新鲜（相当于干土10.0g，这个可以根据自己土样的情况而定）3份分
别放入25ml小烧杯中。将烧杯放入真空干燥器中，并放置盛有无乙醇氯仿（约
2/3）的15ml烧杯2或3只，烧杯内放入少量防暴沸玻璃珠，同时放入一盛有
NaOH溶液的小烧杯，以吸收熏蒸过程中释放出来的CO，干燥器底部加入少量

2
水以保持容器湿度。盖上真空干燥器盖子，用真空泵抽真空，使氯仿沸腾5分
钟。关闭真空干燥器阀门，于25℃黑暗条件下培养24小时。
1.4.2 抽真空处理
熏蒸结束后，打开真空干燥器阀门（应听到空气进入的声音，否则熏蒸不完
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全，重做），取出盛有氯仿（可重复利用）和稀NaOH溶液的小烧杯，清洁干燥
器，反复抽真空（5或6次，每次3min，每次抽真空后最好完全打开干燥器盖子），
直到土壤无氯仿味道为止。同时，另称等量的3份土壤，置于另一干燥器中为不

※
（注意：熏蒸后不可久放，应该快速浸提）熏蒸对照处理。

1.4.4 浸提过滤聚乙烯
离心管从干燥器中取出熏蒸和未熏蒸土样，将土样完全转移到80ml，考虑到土
样的原因，此部（土水比为1:4中，加入40ml 0.5mol/L硫酸钾溶液
的硫酸钾溶液，当然这个加入
量要16ml4g分熏蒸和不熏蒸土均为，即，4g土：

，用中速定量滤纸过滤。同30minTOC仪器的进入量决定）300r/min振荡根据
（但使℃冷冻保存土壤提取液最好立即分析，
或—203时作个无土壤基质空白。注意这部分很重要，有研究结果表明：提取液
如果不立即分（用前需解冻摇匀）
℃，否则将
影响浸提液的效果，其次，过滤时不要用普通的20析，请保存在—

定性或定量滤纸，以免长久杂质会堵塞仪器的管路，建议使用那种一次性塑料
元）。注射器，配一个0.2um的滤头，一个才1
1.4.5 TOC仪器测定（这个
要根据仪器自己的性能决定，但是一般情吸取上述土壤提取液10ul

况下，在测定土壤滤液时候，要对其进行稀释，如果不稀释，一方面超过原来
）分析仪上，注入自动总有机碳（TOC仪器的标曲，另一方面可能堵塞仪器。）
不同的型号则操作程序测定提取
液有机碳含量。由于总有机碳分析仪型号较多，Model 仪（Shimadzu 的用有机

碳分析验里差存在较大异，这以本实室使 TOC---500,JAPAN）为例。
1.5 计算

CHCL3CK
)*TOC仪器的稀释倍数*E原来的水土比/0.45
SMBC=(E—CC2 土壤微生物生物量氮（茚三酮比色法）
土壤微生物生物氮一般占土壤全氮的2%—7%，是土壤中有机—无机态氮转化的
一个重要环节，关于土壤微生物氮的测定常见的熏蒸浸提法有两种，一是全氮测
定法，另一个是茚三酮比色法，如下

（茚三酮比色法）
2.1 基本原理

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Amato和Ladd（1988）研究表明新鲜土样熏蒸过程所释放出的氮，主要成
分为α-氨基酸态氮和铵态氮，这两种氮形态可以用茚三酮反应定量测定，并发
现熏蒸与未熏蒸土壤提取的茚三酮反应态氮的增量，与其土壤微生物生物量碳之
间存在显著的相关性。因此，人们采用熏蒸提取茚三酮比色法来测定土壤微生物
生物量氮（FE-Nnin）。

.2 实验仪器
2 分光光度计、硬质试管、水浴锅、真空干燥器、烧杯、三

角瓶、聚乙烯塑料管、离心管、漏斗等
2.3 实验试剂
1）无乙醇氯仿（CHCl）； 32）0.5mol/L (KSO)溶液：称取硫酸钾（KSO）87g，
溶于去离子水中，稀 4422 释至1000ml；
3）pH5.2的乙酸锂（LiOH?HO）溶液：称取氢氧化锂（LiOH?HO）168g，加 22
入冰乙酸（优级纯）279ml，加水稀释到1000ml，用浓盐酸或50%氢氧化钠溶
液调节pH至5.2。
4）茚三酮溶液：取150ml二甲基亚砜（CHOS）和乙酸锂溶液50ml加入4g 水

62?H?2HO）搅拌至完全O ）和0.12g还原茚三酮（C 合茚三酮（CHOHO2631021894
溶解；

5）50%乙醇水溶液：吸取50ml 99%乙醇于100ml容量瓶中，用蒸馏水定容；
6）1mol/L的硫酸铵[(NH4)SO]标准储存液：称取4.7167g分析纯硫酸铵（称 42
前105℃烘2h）溶于0.5mol/L 硫酸钾溶液中，并用硫酸钾溶液定容至1000ml，
摇匀，于4℃冰箱中保存。
7）0.1mol/L 的硫酸铵[(NH4)SO]标准液：吸取10ml 1mol/L的硫酸铵标准 42 储
存液于100ml容量瓶中，用0.5mol/L硫酸钾溶液定容至100ml，摇匀。此
溶液最好现配现用。
8）工作曲线的制备：分别吸取0.00ml、0.50ml、1.00ml、2.00ml、3.00ml、4.00ml、
5.00ml 0.1mol/L的硫酸铵标准液于100ml容量瓶中，用0.5mol/L硫酸钾溶液
定容至100ml，摇匀，其浓度分别为0mol/L、0.25mol/L、0.5mol/L、1.0mol/L、
1.5mol/L、2.0mol/L、2.5mol/L硫酸铵标准氮的系列溶液。
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2.4 操作步骤
.4.1 土壤的前处理（和1.4.1一样） 22.4.2 熏蒸（和1.4.2一样）
2.4.3抽真空处理（和1.4.3一样）
2.4.4 浸提过滤
从干燥器中取出熏蒸和未熏蒸土样，将土样完全转移到80ml聚乙烯离心管中，
加入40ml 0.5mol/L硫酸钾溶液（土水比为1:4，考虑到土样的原因，此部
分熏蒸和不熏蒸土均为2g，即，
2g土：8ml的硫酸钾溶液）300r/min振荡30min，
用中速定量
滤纸过滤。同时作3个无土壤基质空白。土壤提取液最好立即分析，或—20℃冷
冻保存（但使用前需解冻摇匀）（注意这部分很重要，有研究结果表

※
，否则将影响浸提液的效果，，请

保存在—20℃明：提取液如果不立即分析，
其次，过滤时不要用普通的定性或定量滤纸，以免长久杂质会堵塞仪器的管路，
建议使用那种一次性塑料注射器，配一个0.2um的滤头，一个才1元）。
2.4.5 分光光度计比色测定（此处沸水浴不好控制※）
吸取0.5ml样品提取液和标准工作液，分别置于10ml的塑料离心管中，加入2ml
茚三酮显色剂，涡旋搅拌充分混匀，置于试管架上，在沸水中水浴15min，迅速
冷却（冰浴约2min），加入5ml稀释液（50%乙醇水溶液），摇匀于570nm下比
色。
2.5 结果计算

CHCL3CK
)*稀释倍数*原来的水土比*5

SMBN=(EE—
CC

? 土壤微生物生物量氮的测定（全氮测定法,建议使用此

法）
注意：所配的试剂和全自动凯氏定氮仪的试剂一样，具体见农化分析课本

.4.1 土壤的前处理（和1.4.1一样） 22.4.2 熏蒸（和1.4.2一样）
2.4.3抽真空处理（和1.4.3一样）
2.4.4 浸提过滤
从干燥器中取出熏蒸和未熏蒸土样，将土样完全转移到80ml聚乙烯离心管中，
加入40ml 0.5mol/L硫酸钾溶液（土水比为1:4，考虑到土样的原因，此部
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分熏蒸和不熏蒸土均为4g，即，2g土：16ml的硫酸钾溶液）300r/min振荡30min，
用中速定量
滤纸过滤。同时作3个无土壤基质空白。土壤提取液最好立即分析，或—20℃冷
冻保存（但使用前需解冻摇匀）（注意这部分很重要，有研究结果表

※
，否则将影响浸提液的效果，20℃，

明：提取液如果不立即分析，请保存在—
其次，过滤时不要用普通的定性或定量滤纸，以免长久杂质会堵塞仪器的管路，
建议使用那种一次性塑料注射器，配一个0.2um的滤头，一个才1元）。
2.4.5 全自动凯氏定氮仪的测定
吸取10ml滤液与消煮管中，加入KSO—CuSO—Se混合催化剂1.08g，加442入
4ml浓硫酸；同时设置2—3空白（10ml的0.5mol/l的KSO，加入KSO—4422CuSO
—Se混合催化剂1.08g，加入4ml浓硫酸）；在高温消化（340℃消煮3个4小时）
至澄清后放置2-3h。然后用全自动凯氏定氮仪测定浸提液中的全氮含量。
2.5 结果计算
E=(V-V)*C*14*1000*(16/10)÷W
S

NOSH2SO4
式中：E为全氮，V为滴定空白对照所消耗的标准硫酸体积（注意：消煮

一批ON ※），V为滴定土样所消耗的标准硫酸体积，C