柱效
如何测定柱效
如何测定色谱柱柱效？
不通的色谱柱有不同的测试方法，来自不同厂家的同类色谱柱也往往采用不同的测试条件，所以最好按照色谱柱说明书中的测试报告测定柱效。
一般工作站的数据处理都有自动计算柱效值的功能，若没有工作站，可由公式计算：
柱效（理论塔板数）等于保留时间与峰宽之比值的平方再乘以16，或保留时间与半峰宽之比值的平方再乘以5.54
测定柱效时，不要接保护柱，同时注意连接的管路尽可能短，以减少死体积。
自己测定的柱效是会低于出厂时测试报告给出的值，因为一般情况下，应用实验室没有专门用于测柱效的仪器。
当然，使用了一段时间的色谱柱的柱效是会下降的。
以下是Waters用于C18(C8)柱效的测定方法：
流动相：乙腈+水＝60+40
流速：1.0 mL/min
检测波长：254 nm
测试样品：2 mL丙酮，0.20 mg苊，溶于100 mL流动相中
进样体积：3.0 L。
柱效和不对称因子
柱效和不对称因子
柱效 (column efficiency) 是指色谱柱分离性能的指标，通常用
于评估色谱柱的分离效果。
柱效可以通过理论板数 (theoretical plate number) 或者分离系数 (separation factor) 来表征。
理论板数是用于描述柱效的常见指标。
它是指在单位柱高度上，溶质在柱中传质和质量转移的平均次数。
理论板数越高，表示柱的分离效果越好。
常用的计算理论板数的方法有高斯峰宽法(Gaussian peak width method) 和半高峰宽法 (half peak width method)。
不对称因子 (asymmetry factor)，也称为尾数 (tailing factor)，是衡量色谱峰形对称性的指标。
不对称因子等于峰的前沿峰高与后沿峰高之比，通常用来评估色谱峰的对称性。
理想的对称因子为1，对称因子大于1表示尾峰，小于1表示前峰。
柱效和不对称因子是评估色谱柱性能的重要指标，对于正确分离和定量分析非常关键。
衡量柱效和不对称因子的数值越接近理想值，表示柱的分离效果越好，分析结果越准确。
因此，在色谱分析中，选择合适的柱效和不对称因子对于获取准确的分离结果至关重要。
柱效测定
柱效测定是一项经常使用的操作，对于定量表征层析柱的工作状态是否良好，工艺的验证具有重要的意义。
但是实际工作中很多朋友都遇到不会测柱效或者测出来注销过低的状况，不知道如何解决。
所以今天我就给大家详细介绍一下柱效的正确测定方法，以及经常遇到的问题如何解决。
本方法适用于所有GE公司中低压液相色谱的预装柱及自己填装的层析柱。
介绍分为5个部分，测前准备、试剂选择、测柱效操作、测试结果积分、经常发生的问题。
1. 测前准备：⑴ÄKTA层析设备。
要求设备的型号与层析柱大小匹配，从上样阀门到紫外和电导检测器之间的体积要做到最小（管路内径尽量细，管路尽量短），这对于准确测量实验室小层析柱的柱效非常重要。
⑵测试平衡溶液及样品。
这个部分在试剂选择中单独细说。
⑶装填好的层析柱。
使用平衡缓冲液在测柱效的流速下至少平衡1.5 CV（柱体积），平衡方向与测柱效方向必须一致⑷样品环。
容积大于1%柱体积。
2. 试剂选择测柱效主要有两种测试系统：1 NaCl 测试系统；2 丙酮测试系统。
只要操作正确，两个系统测出来的结果是基本一致的。
但是要注意：各试剂的浓度不能随意改变，否则影响测试结果。
⑴NaCl测试系统对于所有种类的柱子和填料，都可以使用氯化钠系统测柱效平衡液：0.4 MNaCl水溶液样品：0.8 M NaCl水溶液⑵丙酮测试系统对于亲和、离子交换和凝胶过滤技术的层析柱和填料平衡液：水样品：1%丙酮的水溶液对于反相和疏水层析柱和填料平衡液：20%乙醇样品：1%丙酮溶于20%乙醇3. 测柱效操作测柱效全程使用30 cm/h线性流速。
平衡层析柱至少1.5 CV，将1% CV的样品（NaCl或丙酮）注射进入层析柱，使用平衡液冲洗直至电导或紫外280nm出现响应峰。
4. 测试结果积分以UNICORN6版本为例演示给大家看如何操作（各UNICORN版本操作基本一致）。
以NaCl系统测柱效的所有操作针对电导曲线，以丙酮系统测柱效的所有操作针对UV 280曲线（手头没有测柱效结果，所以随便找了一个图，里面有两个峰。
柱效计算公式的例子
柱效计算公式的例子
柱效计算公式：N=5.54×(T2r／W1／2)。
柱效计算
柱效以每根柱子的理论塔板数表示，计算公式为 N = 5.54 ( t R / w 0.5 ) 2 其中 t R 是目标分析物的保留时间，w 0.5 是半峰高处的峰宽.
即使峰没有与相邻峰完全分离（分辨率差），只要峰之间的谷值低于半峰高，这种半峰高方法也可以确定每根色谱柱的理论塔板数(N)。
峰的高度。
半高测量通常是数据系统自动确定的首选方法。
每根柱子的理论塔板数越大，峰越尖！如果您需要计算每米的理论塔板数，则必须使用以下公式：
每根色谱柱的理论塔板数x 100/HPLC 色谱柱长度(cm)= 每米理论塔板数。
衡量柱效的三个指标
衡量柱效的三个指标
柱效是指柱体在受力作用下的变形能力，是衡量柱体结构强度的重要指标。
柱效的好坏直接影响着柱体结构的安全性和可靠性，因此，衡量柱效的指标非常重要。
首先，柱效的衡量指标之一是柱体的变形能力。
柱体受力作用时，会发生变形，变形的程度可以反映柱体的变形能力。
柱体变形能力越强，柱效就越好。
其次，柱效的衡量指标之二是柱体的抗压强度。
柱体受力作用时，会发生抗压，抗压的强度可以反映柱体的抗压能力。
柱体抗压能力越强，柱效就越好。
最后，柱效的衡量指标之三是柱体的抗剪强度。
柱体受力作用时，会发生抗剪，抗剪的强度可以反映柱体的抗剪能力。
柱体抗剪能力越强，柱效就越好。
总之，衡量柱效的三个指标分别是柱体的变形能力、抗压强度和抗剪强度。
只有当这三个指标都达到规定的要求时，柱效才能达到规定的标准，柱体结构才能达到安全可靠的要求。
柱效测定以及影响因素
柱效测定以及影响因素柱效测定（Column Efficiency Determination）是指在色谱分析中通过柱沉淀试剂的稳定迁移时间与溶质峰宽的比值来评估柱效的一种方法。
柱效是指柱对样品的分离能力，它取决于柱填充剂的形状和物理化学性质，以及流体力学特性和柱床操作参数等一系列因素。
柱效测定可以帮助分析人员评估柱的性能，并确定最佳的柱操作参数，以提高分离效果和增强分析结果的准确性。
影响柱效的因素较多，下面将对其中几个关键因素进行详细说明。
1.柱填充剂：柱的填充剂是决定柱效的关键因素之一、填充剂的表面性质、孔径大小、孔隙度以及孔道分布等特性都会对柱效产生影响。
孔径大小直接影响柱的分离能力，较小的孔径可提供更大的表面积，并且具有更好的分离效果。
孔隙度和孔道分布则决定了样品分子在柱中的扩散速度和传质能力。
因此，选择合适的填充剂是提高柱效的重要步骤。
2.面层润湿性：表面润湿性是表征柱填充剂孔道分布均匀性和表面润湿程度的重要指标。
不同样品的表面润湿性不同，一些样品在柱填充剂的表面上难以均匀分布，导致部分样品分子的扩散速度较快，使得分离能力降低。
因此，在选择填充剂时，要根据不同的液相样品，选择适合的表面润湿性，以提高柱效。
3.柱长度和内径：柱的长度和内径是影响柱效的重要参数之一、柱长度的选择与待分离的成分数目和分离程度有关，理论上，柱越长，分离程度越高。
然而，随着柱长度的增加，分析时间也会增加。
柱内径越小，柱效越高，但是流速也会减小，分析时间会延长。
因此，在实际应用中，需要根据分析要求平衡分离效果和分析时间，选择合适的柱长度和内径。
4.流速和温度：流速和温度是影响柱效的重要操作参数。
流速的选择需要平衡分离效果和分析时间。
流速过高可能会导致溶质在柱中的分离不完全，流速过低则分析时间会较长。
温度的选择与柱的填充剂和待分离的样品有关。
温度的升高可以提高溶质的扩散速度和减小粘度，有利于更好的分离效果。
但同时，温度过高也可能会引起溶解度的变化和柱填充剂的损失，影响柱效。
液相柱效下降的原因
液相柱效下降的原因
液相柱效下降的原因可能有以下几个方面：
1. 柱材质损坏或老化：柱材质受到物理或化学因素的损害或老化，导致柱效下降。
常见的因素包括溶剂浸润、机械磨损、化学腐蚀等。
2. 柱填充物失活：柱填充物表面上的活性基团出现损坏、污染或失活现象，导致柱分离效果下降。
常见的原因包括样品污染、化学反应、高温等。
3. 柱回收不当：柱按照正常操作要求进行回收和保养，是保持柱效稳定的关键。
如果回收不当，如未正确关闭、储存环境不合适等，可能导致柱效下降。
4. 柱使用条件不合理：液相柱性能与使用条件密切相关，包括流速、温度、溶剂等。
若使用条件不合理，如流速过高、温度过高、溶剂选择不当等，均可能导致柱效下降。
5. 样品干扰：一些样品中的杂质可能与柱填充物发生反应，导致柱效下降。
常见的杂质包括盐、杂质、离子等。
6. 柱连接部位问题：柱连接部位若存在渗漏或没有正确连接，会导致样品在柱中漏失或干扰，从而导致柱效下降。
需要定期检查和维护液相柱，避免以上因素的影响，保持柱效的稳定和良好的分离效果。
定量计算柱效的指标
定量计算柱效的指标柱效是指一些变量对于预测结果的影响程度。
在定量计算柱效的指标中，常用的有相关系数、t统计量和均方差分析。
下面将详细介绍这些指标。
1. 相关系数（Correlation Coefficient）：相关系数用于衡量两个变量之间的线性关系强度和方向。
常用的相关系数有皮尔逊相关系数（Pearson Correlation Coefficient）和斯皮尔曼相关系数（Spearman Correlation Coefficient）。
皮尔逊相关系数适用于两个变量都是连续变量的情况，取值范围在-1和1之间，越接近1代表正相关越强，越接近-1代表负相关越强，趋近于0代表无相关。
斯皮尔曼相关系数则可以用于度量两个变量之间的单调关系，不要求变量是连续的。
2. t统计量（t-statistic）：t统计量用于检验一些变量对于预测结果的显著性。
计算t统计量需要先进行线性回归分析，然后根据模型系数、标准误差和样本量计算。
t统计量的绝对值越大，说明该变量对于预测结果的影响越显著。
一般以绝对值大于1.96（置信水平为95%）的t统计量为显著。
3. 均方差分析（Analysis of Variance, ANOVA）：均方差分析用于检验一些变量对于预测结果的方差解释能力。
通过对总平方和进行分解得到预测变量解释的平方和和误差解释的平方和，然后计算F统计量来检验预测变量对于方差的解释能力。
F统计量的值越大，说明该变量对于解释方差的能力越显著。
4. 确定系数（Coefficient of Determination，R-squared）：确定系数用于衡量预测模型对于观测值的拟合程度，即模型对于变量之间关系的解释能力。
确定系数的值介于0和1之间，越接近1表示模型对于观测值的拟合程度越好，能够解释的变异越大，反之，越接近0表示模型拟合程度较差。
此外，在计算柱效指标时，还需要考虑到相关变量之间的共线性。
共线性可能会导致一些变量的柱效过高或过低，使解释结果产生误差。
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液相色谱柱柱效的提高和测算
液相色谱柱柱效的提高和测算
摘要本文通过对如何提高液相色谱柱柱效的阐述,介绍了几种国际上流行的测量和计算柱效值的方法。
关键词液相色谱柱谱峰扩宽柱效值理论塔板数
一、提高液相色谱柱柱效的方法
我们知道色谱峰的扩宽与移动相在热力学的分配过程、移动相和固定相中传质阻力所引起的不平衡有关,谱峰扩宽(非平衡)的程度是流速对传质速率的直接函数。
要提高液相色谱的效率可从以下几方面入手。
(1)降低移动相的流速,但会使分析时间延长。
(2)减少固定相的量,但色谱柱中样品的负载量也随之减小。
(3)减小固定相的颗粒度,但不能过分,过分后色谱柱的渗透率也会减小。
(4)选用低粘度的移动相,以利于快速传质,但却不利于多组份分析。
(5)适当提高柱温,可降低移动相的粘度,但柱效和分离度也随之降低。
(6)尽量减小停滞移动相的体积,但却加快了移动相的流速。
从以上介绍可看出,在色谱分析过程中,各种因素是互相联系和制约的。
只有通过对柱效值的跟踪测算,对自己分析方法不断的研究和实践,才能找到最佳的工作条件。
二、对柱效值进行跟踪测算应注意的问题
我们也应记住柱效值即塔板数只表示该色谱柱装填的好坏,只用柱效值并不足以预测在所有条件下的柱性能,因为在这些条件下,柱性能主要表示动力学过程对色谱柱谱带加宽的量。
其他一些影响峰宽的因素,如柱外效应和热力学因素(通常表现为峰拖尾),在理想情况下对于确定柱效值并不起重要作用。
因为任何一个柱性能的定义都必然与用此色谱柱所做的分离相联系,所以依据一个单独的数字来评定柱性能是不切实际的。
对大多数色谱工作者来说,柱性能指的是色谱柱用于特定分离的能力,而仅仅有高柱效并不能保证这种分离能力。
不管用什么特定的测试方法,都会有几个参数影响柱效的测定。
这些参数包括:洗脱液的成分和粘度及其线流速,测定塔板数所用的溶质,温度,柱长,填料装填方式,颗粒度,还有所选用的测量和计算方法。
尽管大多数柱效测算没有设法消除液相色谱仪器系统各部件对表观峰宽的影响,但只要仪器是正常使用的,这些影响是次要的。
而测量和计算方法对柱效值的确定起着极大的作用。
三、几种测量和计算柱效值的方法
因为色谱峰是假定样品浓度在移动相和固定相中呈正态分布而得到的样品谱带分布,故常常把色谱峰型看作正态曲线来计算理论塔板数。
因此计算柱效(以理论塔板数n为单位)的公式习惯上定义为:
式中tR为色谱峰的保留时间; σ2是以时间为单位测量色谱峰的偏差;a是和峰高(从测峰宽的基线量起)有关的常数, ωb是峰宽,表示由色谱峰顶点与色谱峰两侧拐点处做切线与峰底基线相交两点间的距离。
图1所示为正态峰轮廓所测量峰宽处的峰高与7种可能的测定n的方法所对应的常数a值之间的关系。
拐点法(Inflectionmethod):在拐点处峰宽等于标准偏差的2倍,该法对不对称色谱峰最不敏感。
半峰宽法(Widthathalfpeak):该法最常用,计算者的主观误差降到最小,有很好的重复性。
切线法(Tangentmethod):由于切线是人为确定的,色谱峰的对称性对该法的偏差起决定作用。
3σ,4σ和5σ法:这些方法对色谱峰非对称性的灵敏度随上述顺序增加,测量位置越接近于峰底,其结果受拖尾或前延的影响越大。
5σ法对于确定基线的准确性也很灵敏。
峰高/峰面积法(Height/areamethod):该法可通过积分仪或计算机直接计算出n 值。
n=2π(htR)2/A2,h为峰高,A为峰面积。
量矩法(Momentmethod):此法避免了假设特定的峰型,如果有合适的,正确的程序计算设备,它能够最精确地表示理论塔板数。
非对称法(Asymmetry-basedmethod):从峰顶向基线画一垂线,在峰高10%处测得垂线两边峰宽A,B的长度,并计算其比率。
由于便于测量,该法最能反映色谱峰的非对称性。
在新的国家液相色谱仪检定规程(征求意见稿)中,也增加了对色谱柱柱性能的测试,采用的方法是半峰宽法和非对称法。
四、结论
假如一个色谱峰真是正态峰型,那么每种计算方法都会得到同样的结果。
然而即使一些比较理想的仪器和倾向于得到对称峰型的溶质,由于柱内的槽或空隙,也会出现非正态峰型。
所以不同的计算方法将会得到相差较大的n值。
通常偏离正态模型的峰型表示为“前延”或“拖尾”。
对于这些峰型,越在峰的高处测量,计算的理论塔板数值就越大(准确性越低)。
在许多情况下,色谱工作者需要能反映整个峰型(包括拖尾)的柱效值,同时为了保证定量的重复性,也需要色谱峰很好的对称性。
这时对色谱峰非对称性最敏感的计算方法最适合。
如果目的
仅仅是要监测色谱柱从第一次使用到使用寿命结束这一过程中的柱效,那么以上任何一种方法都可以,应选择最简便的方法。