第六章 植物 细胞培养2014

◆可在培养期间使细胞保持在对数生长期，细胞增殖速度快。
◆适于大规模工业化生产。
（1）封闭型连续培养
在培养过程中， 排出的旧培养基 由加入的新鲜培养基进行补充， 进出数量保持平衡， 从而使培养系统中营养物质的含量 总是超过细胞生长的需要。
悬浮在排出液中的细胞经机械方法收集后 再放回到培养系统中，
因此，随培养时间的延长， 细胞密度会不断增加。
筛选出有效成分高而生长较快的细胞株。
细胞悬浮培养
（一）培养类型和方法
1. 分批培养（batch culture）
是指把细胞分散在一定容积的培养基中进行培养，
当培养物增殖到一定量时，转接继代，建立起单细胞培养物。
在培养过程中除了气体和挥发性代谢产物可以同外界交换外， 一切都是密闭的。
分批培养所用的容器一般是100-250mL三角瓶， 每瓶装20-75mL培养基。
小室可通过毛细管与外界通气，便于观察。 注意：载玻片厚度1mm，微室厚度最好不超过20µm，
盖玻片厚度在0.17-0.18mm左右，观察效果才好。
此法的优点 在培养过程中可以连续进行显微观察， 把1个细胞的生长、分裂和形成细胞团的全过程记录下来。
现在可使用特制的凹穴载玻片与盖玻片做成单细胞培养的小室进行培养，
也称”双层盖玻片法”
微室制作
由悬浮培养液中取出一滴只含有单细胞的培养液，放在一张无菌载玻片上， 在这滴培养液四周与其相隔一定距离加上一圈石蜡油，构成微室的“围墙”。
在“围墙”左右两侧再各加一滴石蜡油， 再在每滴石蜡油上放一张盖玻片作为微室的“支柱”， 然后将第3张盖玻片架在两个支柱之间，构成微室的“屋顶”。
培养中的细胞在遗传和生理生化上会出现变异， 形成的植株就表现出一定的差异 （这种差异主要反映在它们的产量、品质、抗病虫和抗逆性等方面）。 可以用于突变体筛选，选育出符合生产需要的新品种。
单细胞培养的方法
平板培养 看护培养 微室培养 条件培养
1.平板培养
把单个细胞与融化的琼脂培养基均匀混合， 并平铺一薄层在培养皿底上的培养方法。
方法
把液体培养基中培养了4-6周的高密度细胞虑掉， 将其培养基制成液体培养基或固体培养基 来培养单细胞或低密度细胞群体， 这样可明显提高单细胞培养物存活和分裂的能力。
二、细胞悬浮培养
细胞悬浮培养（suspension culture） 是使离体的植物细胞悬浮在液体培养基中进行的无菌培养。
建立在愈伤组织的液体培养技术基础上。
（2）开放型连续培养
为了不使限制细胞生长的因子出现， 创造一个稳定的培养细胞生长的环境， 必须建立一套自动控制系统 来调节培养基注入的数量和培养液的总体积。
在开放连续培养中， 注入的新鲜培养液的容积与流出的培养液容积相等， 其中细胞密度保持恒定， 通过调节流入和流出的速度，使细胞的生长速度一直保持一个稳定状态， 流出的细胞数目相当于培养系统中新细胞的增加数。
目前已发展到全自动控制的大容积发酵罐的大规模工业生产的连续培养。
为研究细胞的生长和分化提供了一个独特的实验系统。
悬浮培养的优点
◆ 能提供比较均匀一致的细胞； ◆ 细胞增殖速度比愈伤组织快； ◆ 适宜大规模培养，成为细胞工程中独特的产业。
日本大量培养人参细胞，并从中取得人参皂甙等有效成分； 德国培养洋地黄取得疗效高、毒性低的强心甙。 中国正在进行人参、三七、三分三、贝母、紫草、紫杉等，
用于分裂细胞的果胶酶（0.5%）
不仅降解中胶层， 还能软化细胞壁。
作为渗透调节剂甘露醇（0.8% ），
防止细胞胀裂。
3. 由愈伤组织分离单细胞
愈伤组织诱导 材料自来水冲洗
——75%的乙醇擦洗 ——将材料切成小块（带形成层） ——接种，MS+2,4-D 2mg/L+水解酪蛋白（CH） 500mg/L+琼脂0.8%，
广泛应用于细胞、原生质体及融合产物的培养。
具体步骤
a. 细胞计数 先对含有游离细胞和细胞团的悬浮培养物进行细胞计数，得到细胞密度。
b. 过滤 然后进行过滤，除去较大的细胞团。 留下游离的单细胞和小细胞团，从而得到单细胞无性系。
c. 接种 将含有琼脂的培养基灭菌后，冷却到35℃，放到恒温水浴中， 将细胞悬浮液接种进去，充分混合后倒入培养皿中。 当培养基凝固后，细胞能均匀分布并固定在很薄一层（约１mm厚）培养基中。
他当时就预见到， 单细胞培养系统将有助于对植物细胞特性和潜力的研究
以及对多细胞有机体细胞间相互关系的了解。
现在， 不仅能够培养游离细胞， 还能使离体单细胞发生分裂，并产生完整植株。
植物细胞培养（plant cell culture）
是指对植物器官或愈伤组织上分离出的单细胞（或小细胞团） 进行培养，形成单细胞无性系或再生植株的技术。
连续培养是植物细胞培养技术中的一个重要进展， 对于植物细胞代谢调节的研究、
各个生长限制因子对细胞生长的影响 以及对次生物质的大量生产等都有重要意义。
排除细胞不返回培养罐
（二）悬浮细胞的继代
第一节 植物细胞培养
20世纪初， Haberland进行了分离和培养显花植物单个叶细胞的最早尝试。
小野芝麻和凤眼兰的栅栏细胞 虎眼万年青属表皮细胞
Haberlandt
首次进行离体细胞培养（细胞未分裂）
失败原因 实验材料都是已经高度分化的细胞； 培养基过于简单，特别是没有生长激素（未发现）。
1902年发表《植物离体细胞培养实验》， 提出胚囊液在组织培养中的作用和看护培养法的科学预见。
（3）从悬浮培养物或疏松的愈伤组织上分离出单细胞， 并把单细胞接种在培养瓶中的滤纸上面。
（4）恒温培养 当这个培养的细胞长出微小细胞团后， 将它转到琼脂培养基上，以便进一步促进其生长。
3. 微室培养
由Jones等1960年设计的， 人工制造一个小室（载玻片和盖玻片）， 将单细胞培养在小室中的少量培养基上，使其分裂增殖成细胞团的方法。
这样含有细胞的培养液被覆盖于微室之中， 构成围墙的石蜡油能阻止微室中水分的丢失，且不妨碍气体的交换， 最后把有微室的整张载玻片放在培养皿中培养。
4. 条件培养基培养
当合成培养基中的细胞或细胞培养由于起始密度太低而不能发生分裂时， 可采用条件培养基。
所谓条件培养基是在培养基中加入高密度的细胞进行培养， 一定时间后这些细胞就会向培养基中分泌一些物质，使培养基条件化。
pH5.8 ——产生愈伤组织 ——扩大繁殖（提高愈伤组织松散性）。
单细胞分离 ——愈伤组织（未分化、易散碎）转入液体培养基，
振荡（120r/min）培养（弱光或黑暗，25±1℃）； —— 200µm网筛过滤，离心 —— 60-100µm，20-30µm无菌网筛过滤，离心 ——回收，液体培养基冲洗，用于培养
分批培养
优点
1） 设备简单； 2） 操作简单、重复性好。
缺点
1） 培养基成分在不断改变，没有一个稳定生长期； 2） 细胞数目、代谢产物等不能保持恒定。
2. 半连续培养
是利用培养罐进行细胞大量培养的一种方式。
当培养罐内细胞内细胞数目增殖到一定量后， 倒出一半细胞悬浮液于另一个罐内， 再分别加入新鲜培养基继续进行培养， 如此这样频繁地进行再培养。
疏松愈伤组织
将愈伤组织在液体培养基中培养， 建立悬浮培养物
振荡作用
形成小细胞团或单细胞； 在培养基中均匀分布； 有空气交流。
悬浮振荡培养
（二）单细胞培养*
单细胞培养就是对分离得到的单个细胞进行培养， 诱导其分裂增殖，形成细胞团， 再通过细胞分化形成芽、根等器官或胚状体， 直至长成完整植株的技术。 它是常用的细胞培养方法。
然后用封口膜封严， 用双筒倒置显微镜（×40）的直接计量细胞数。
平板培养注意事项
◆选用的培养基无论是条件培养基还是合成培养基， 其目的是能够在低的起始密度下使细胞生长；
◆不可选用处在静止期过久的细胞， 因为只有处在分裂旺盛时期的细胞才有较高的细胞分裂能力；
◆在固体培养基中适宜的起始密度因不同的植物种类不同；
一、单细胞培养
（一）单细胞的分离*
1. 机械法
Ball等（1965）最早由花生成熟叶片得到了离体单细胞。 其方法是： 首先撕去叶表皮，使叶肉细胞暴露， 然后用解剖刀把细胞刮下来， 直接接种在液体培养基中培养。
Rossini（1972） 只有在薄壁细胞组织排列松散、细胞间接触面很小时， 用机械法分离叶肉细胞才能成功。因此并不适合所有植物。
3. 连续培养（continue culture）
是利用特制的培养容器进行大规模细胞培养的一种方式。
在培养过程中，以不断抽取悬浮培养物，并注入等量新鲜培养基， 使培养物不断得到养分补充，保持其恒定体积的培养。
连续培养的特点
◆由于不断加入新鲜培养基，保证了养分的充分供应， 不会出现悬浮培养物发生营养不足的现象。
现在广泛用于分离叶肉细胞的方法
先把叶肉组织轻轻研碎， 然后再通过过滤和离心将细胞纯化。
具体过程 在研钵中放入10g叶片和40ml研磨介质
（20µmol蔗糖+10µmolMgCl2 +20µmolTris-HCl缓冲液，pH7.8） 轻轻研磨 用双层纱布过滤 低速离心， 游离细胞就会沉降到试管底部，得到纯化细胞。
◆接种细胞时固体培养基的温度要严格控制，一般不超过35℃， 温度低，对细胞伤害小，但分布不均。
在细胞培养中，培养液中的细胞密度随着培养的进行， 超过一定限度的高值，增殖速度下降，不久细胞数的增加便停止下来， 此时期称为静止期。
2. 看护培养
用同种或异种材料的愈伤组织作为看护组织。 由Muir等1954年设计的。
机械法分离细胞的特点
A. 细胞不受酶的伤害； B. 不会发生质壁分离；
对生理、生化研究意义很大。 C. 一般机械分离的细胞能够发生分裂并形成愈伤组织。