19乙肝病毒大表面蛋白通过诱导内质网压力激活S启动子
生物技术在疫苗研发中的应用
生物技术在疫苗研发中的应用疫苗，作为预防和控制传染病最有效的手段之一，其研发和生产一直是全球公共卫生领域的重要课题。
而生物技术的迅速发展，为疫苗研发带来了前所未有的机遇和突破。
生物技术，简单来说，是指利用生物体（包括微生物、动物和植物）或其组成部分（细胞器和细胞）来生产有用物质或进行有益过程的技术。
在疫苗研发中，生物技术的应用广泛且深入。
基因工程技术是其中一项关键的应用。
通过基因工程，科学家可以对病原体的基因进行重组和修饰，从而获得更安全、更有效的疫苗。
以乙肝疫苗为例，传统的血源性乙肝疫苗存在一定的安全隐患，而利用基因工程技术生产的重组乙肝疫苗则有效地解决了这个问题。
科学家将乙肝病毒表面抗原的基因插入到酵母菌或哺乳动物细胞中，使其大量表达乙肝表面抗原，经过纯化后制成疫苗。
这种疫苗不仅安全性高，而且免疫效果好。
此外，蛋白质工程技术在疫苗研发中也发挥着重要作用。
蛋白质工程可以对疫苗中的抗原蛋白进行改造，提高其免疫原性和稳定性。
例如，通过对流感病毒表面蛋白的结构进行分析，利用蛋白质工程技术对其关键位点进行修饰，使其能够诱导更广泛和更强烈的免疫反应，从而研发出更高效的流感疫苗。
细胞工程技术为疫苗的研发提供了新的途径。
利用细胞培养技术，可以大规模生产疫苗所需的细胞和抗原。
例如，在生产脊髓灰质炎疫苗时，使用细胞培养技术可以获得大量纯净的病毒抗原，提高疫苗的产量和质量。
生物技术还促进了新型疫苗的研发。
比如，核酸疫苗的出现就是生物技术的一大成果。
核酸疫苗包括 DNA 疫苗和 RNA 疫苗，它们直接将编码病原体抗原的核酸序列导入人体细胞，使细胞表达抗原蛋白，从而激发免疫反应。
这种疫苗具有制备简单、易于保存和运输等优点，为疫苗研发带来了新的思路和方法。
除了上述技术，生物技术在疫苗的质量控制和安全性评估方面也具有重要意义。
利用生物技术手段，如基因测序、蛋白质分析等，可以对疫苗的成分进行精确检测，确保疫苗的质量和安全性。
真核细胞表达系统(干货分享)
真核细胞表达系统自上世纪70年代基因工程技术诞生以来，基因表达技术已渗透到生命科学研究的各个领域。
并随着人类基因组计划实施的进行，在技术方法上得到了很大发展，时至今日已取得令人瞩目的成就。
随着人类基因组计划的完成，越来越多的基因被发现,其中多数基因功能不明。
利用表达系统在哺乳动物细胞内表达目的基因是研究基因功能及其相互作用的重要手段.在各种表达系统中，最早被采用进行研究的是原核表达系统,这也是目前掌握最为成熟的表达系统。
该项技术的主要方法是将已克隆入目的基因DNA片段的载体（一般为质粒)转化细菌（通常选用的是大肠杆菌）,通过IPTG诱导并最终纯化获得所需的目的蛋白.其优点在于能够在较短时间内获得基因表达产物,而且所需的成本相对比较低廉.但与此同时原核表达系统还存在许多难以克服的缺点:如通常使用的表达系统无法对表达时间及表达水平进行调控，有些基因的持续表达可能会对宿主细胞产生毒害作用，过量表达可能导致非生理反应，目的蛋白常以包涵体形式表达，导致产物纯化困难；而且原核表达系统翻译后加工修饰体系不完善，表达产物的生物活性较低。
为克服上述不足，许多学者将原核基因调控系统引入真核基因调控领域,其优点是:①根据原核生物蛋白与靶DＮＡ间作用的高度特异性设计，而靶DNA与真核基因调控序列基本无同源性,故不存在基因的非特异性激活或抑制；...文档交流仅供参考...②能诱导基因高效表达,可达105倍，为其他系统所不及；③能严格调控基因表达，即不仅可控制基因表达的“开关"，还可人为地调控基因表达量。
因此，利用真核表达系统来表达目的蛋白越来越受到重视。
目前,基因工程研究中常用的真核表达系统有酵母表达系统、昆虫细胞表达系统和哺乳动物细胞表达系统....文档交流仅供参考...1、酵母表达系统最早应用于基因工程的酵母是酿酒酵母,后来人们又相继开发了裂殖酵母、克鲁维酸酵母、甲醇酵母等，其中，甲醇酵母表达系统是目前应用最广泛的酵母表达系统。
细胞应激-参考课件
stress response element，应激反应元件)
→刺激内质网伴侣蛋白的基因转录
ATF6路径
ATF6：含有bZip转录因子结构域的Ⅱ型跨膜蛋
白，在非内质网应激状态下ATF6主要以酶原形
式(P90ATF6)存在于内质网
未折叠蛋白在内质网聚集增多→ATF6从ER进入 Golgi→被S1P(site1 protease)和S2P酶切成 p50bZip转录因子到细胞核→激活XBPI转录增 加→结合ERSE→UPR gene表达→内质网伴侣 蛋白合成↑
前两者由于蛋白质加工紊乱引起，后者是由于在 ER表面合成的胆固醇损耗所致
未折叠蛋白反应
（unfolded protein response, UPR）
蛋白质在内质网内的正确折叠需要许多分子伴侣 蛋白协助，包括Bip/GRP78(immunoglobulin binding protein78)和GRP94(glucose regulated protein94)、折叠酶类等 当内质网中未折叠或错误折叠的蛋白增多时，应 激信号通过内质网膜传递到细胞核中，继而引起 一系列特定的靶基因转录和蛋白质翻译水平下调， 以利于内质网蛋白折叠形成，使细胞继续存活， 这种反应就是未折叠蛋白反应(UPR)
binding and keeping Ca2+ in the ER lumen
UPR信号传导途径
哺乳动物中有三条途径涉及UPR信号传导
PERK-elF2α磷酸化-ATF4路径 IRE1-XBP1路径 ATF6路径 相关信号转导蛋白：
PERK：RNA激活蛋白激酶的内质网类似激酶 elF2α：真核翻译因子 IRE1（inositol requiring enzyme–1, 肌醇必需酶-1, 属丝／苏氨 酸激酶） XBP1（X-box binding protein1，X盒结合蛋白1）：转录因子，促 进多种基因的表达 ATF6(avtiviting transcription factor：激活作用转录因子)
表位疫苗研究进展
表位疫苗研究进展赵德;乔翠;张强;郭建宏;高凤山【摘要】表位疫苗是近年来发展起来的一种新型疫苗,相对传统疫苗,拥有较多优势.表位疫苗设计的关键是筛选表位,表位的筛选包括蛋白质降解法、肽探针扫描技术、随机肽库技术、计算机表位预测.表位疫苗需要借助一定的载体才能发挥免疫作用,包括脂质载体、蛋白载体、佐剂等.目前国内外学者还采用多种法如串联重复、MAP空间模式及表位修饰等方法增强表位疫苗的免疫效果.表位疫苗主要包括病毒表位疫苗、细菌表位疫苗和寄生虫表位疫苗.尽管表位疫苗的研究发展迅速,但仍然面临一些问题亟待解决.【期刊名称】《动物医学进展》【年(卷),期】2012(033)001【总页数】5页(P102-106)【关键词】表位疫苗;传统疫苗;筛选【作者】赵德;乔翠;张强;郭建宏;高凤山【作者单位】大连大学生命科学与技术学院分子免疫学实验室,辽宁大连 116622;大连大学生命科学与技术学院分子免疫学实验室,辽宁大连 116622;中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原微生物国家重点实验室,甘肃兰州 730046;中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原微生物国家重点实验室,甘肃兰州 730046;大连大学生命科学与技术学院分子免疫学实验室,辽宁大连 116622;中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原微生物国家重点实验室,甘肃兰州 730046【正文语种】中文【中图分类】Q78人类历史上，疫苗的发展史可以分为3个阶段：古典疫苗时期，即在病原体发现前据反复观察和摸索经验而研制出疫苗的时期，例如英国乡村医生Jenner用牛痘接种到人体上，使人获得免疫能力；传统疫苗时期，即利用病变组织、人工培养的病原微生物制备灭活疫苗和减毒疫苗的时期；基因工程疫苗时期，即采用DNA重组技术生产疫苗的时期。
传统疫苗可分为减毒活疫苗和灭活疫苗。
传统疫苗最大的优点就是免疫力强、保护性好，减毒活疫苗缺点是存在毒力恢复、散毒或基因重组等潜在的生物危害。
基因工程大题训练高二下学期生物人教版2019 选择性必修3
1、下面是将乙肝病毒控制合成病毒表面主蛋白的基因HBsAg导入巴斯德毕赤酵母菌生产乙肝疫苗的过程及有关资料，请分析回答下列问题。
资料1：巴斯德毕赤酵母菌是一种甲基营养型酵母菌，能将甲醇作为其唯一碳源，此时AOX1基因受到诱导而表达[5′AOX1和3′AOX1（TT）分别是基因AOX1的启动子和终止子]。
资料2：巴斯德毕赤酵母菌体内无天然质粒，所以科学家改造出了图1所示的pPIC9K 质粒用作载体，其与目的基因形成的重组质粒经酶切后可以与酵母菌染色体发生同源重组，将目的基因整合于染色体中以实现表达。
资料3：限制酶酶切位点）如果要将HBsAg基因和pPIC9K质粒重组，应该在HBsAg基因两侧的A B位置接上______、______限制酶识别序列，这样设计的优点是避免质粒和目的基因自身环化。
（2）酶切获取HBsAg基因后，需用__________将其连接到pPIC9K质粒上，形成重组质粒，并将其导入大肠杆菌以获取。
（3）步骤3中应选用限制酶______来切割重组质粒获得重组DNA，然后将其导入巴斯德毕赤酵母菌细胞。
（4）为了确认巴斯德毕赤酵母菌转化是否成功，在培养基中应该加入卡那霉素以便筛选，转化后的细胞中是否含有HBsAg基因，可以用__________方法进行检测。
（5）转化的酵母菌在培养基上培养一段时间后，需要向其中加入______以维持其生活，同时诱导HBsAg基因表达。
（6）与大肠杆菌等细菌相比，用巴斯德毕赤酵母菌细胞作为基因工程的受体细胞，其优点是在蛋白质合成后，细胞可以对其进行并分泌到细胞外，便于提取。
2、凝乳酶是奶酪生产中的关键性酶。
直接利用动、植物生产凝乳酶受多种因素限制，培育高酶活力凝乳酶微生物菌种是目前最有前途的发展方向。
从牛胃液中分离到的凝乳酶以催化能力强而被广泛应用，研究人员运用基因工程技术，将编码该酶的基因转移到了微生物细胞中。
（1）从牛胃细胞中提取，再逆转录形成cDNA，以此cDNA 为模板PCR 扩增目的基因，有时需要在引物的5’端设计（填“限制酶”“DNA 连接酶”或“R NA 聚合酶”）识别序列，以便构建重组DNA 分子。
乙肝病毒大表面蛋白通过诱导内质压力激活S启动子
原文：Activation of Hepatitis B Virus S Promoter by the Viral Large作者：ZHICHANG XU, GREGORY JENSEN, AND T. S. BENEDICT YEN作者单位：Department of Pathology, University of California, San Francisco, and Pathology Service, Veterans Affairs Medical Center, San Francisco, California发表刊物：JOURNAL OF VIROLOGY, Oct. 1997, p. 7387–7392以下为中文翻译稿 ：乙肝病毒大表面蛋白通过诱导内质网压力激活S启动子 乙肝病毒 (HBV) 编码三种形式的表面蛋白。
其中，数量较少的大表面蛋白由preS1启动子调控的转录物翻译而来，中、小表面蛋白则由下游的S 启动子调控的转录物翻译而来。
当大表面蛋白过量表达时, 亚病毒和病毒颗粒的分泌都被阻滞在分泌路径中。
我们发现，大表面蛋白的过量表达，可导致S 启动子高达10倍的激活（对于无关启动子，则不能激活）。
中、小表面蛋白，和可分泌的大表面蛋白，都不能激活S 启动子 。
但是，一些可诱导内质网(ER)压力的化学试剂，却具有与大表面蛋白相同的激活效果。
大表面蛋白也能在整个病毒基因组的背景中激活S 启动子。
因此，HBV 似乎已经进化形成了一种反馈机制：大表面蛋白的积累诱导产生ER压力，ER压力使中、小的表面蛋白的合成增加，然后，它们与大表面蛋白一起，组装成混合的、可分泌的颗粒。
另外，像其他可诱导ER压力的试剂一样，大表面蛋白也能激活细胞的 grp78 和 grp94 启动子,这增加了它改变宿主细胞生理特性的可能。
乙肝病毒（HBV）是一种具外膜的嗜肝性DNA病毒，已经在全世界范围内感染了大量人群。
2022版高考生物一轮复习第十单元现代生物科技专题专题二十五基因工程2试题含解析
专题二十五基因工程考点1 基因工程的基本工具与操作程序1.[2021某某某某阶段训练,12分]超氧化物歧化酶(SOD)具有抗衰老作用。
研究人员培育了能合成SOD的转基因酵母菌。
结合下图回答下列问题。
注:Hin d Ⅲ和Apa LⅠ是两种限制酶,箭头表示酶的切割位置。
(1)将图中的重组DNA分子用Hin d Ⅲ和Apa L Ⅰ完全酶切后,可得到种DNA片段。
(2)作为受体细胞的酵母菌缺失URA3基因,必须在含有尿嘧啶的培养基中才能存活,为了筛选出成功导入表达载体的酵母菌,所使用的培养基(填“需要”或“不需要”)添加尿嘧啶,理由是。
(3)目的基因进入受体细胞内,并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程,称为。
为了确定受体细胞中SOD基因是否转录,可用标记的作探针与从受体细胞中提取的RNA进行分子杂交检测,分子杂交的原理是。
(4)利用蛋白质工程获得活性更高的SOD时,需根据所设计蛋白质的结构推测其氨基酸序列,最终确定相对应的脱氧核苷酸序列并经获得所需的基因。
2.[2020某某示X高中联考,15分]南极某种鱼含有抗冻基因,如图是获取转基因抗冻番茄植株的过程示意图。
请回答下列相关问题:(1)利用①过程的方法获取目的基因需要用到酶。
②过程中常需要用到的工具酶是。
(2)通过①、②过程成功构建的重组质粒,除目的基因外,还应该具备等。
(3)将目的基因导入番茄体细胞的方法是利用农杆菌的作用,其原理是。
(4)要确认抗冻基因是否在转基因番茄植株中表达出相应的蛋白质,可以采用方法,除进行分子检测外,有时还需要进行的鉴定。
考点2 基因工程的应用与蛋白质工程3.[2021某某某某质量检测,12分]植物基因工程技术的发展为人类更好地利用盐碱地提供了可能。
请回答下列问题:(1)欲培育转基因耐盐水稻,需要完成的基因工程的核心步骤是,一个基因表达载体的组成,除了目的基因和复制原点外,还必须有、以及标记基因。
(2)用PCR技术扩增耐盐基因的原理是,目前将耐盐基因导入双子叶植物最常用的方法是。
2023-2024学年高中生物沪科版(2020)选择性必修3第3章 基因工程单元测试(含答案解析)
2023-2024学年沪科版（2020）高中生物单元测试学校 __________ 班级 __________ 姓名 __________ 考号 __________注意事项1．答题前填写好自己的姓名、班级、考号等信息;2．请将答案正确填写在答题卡上;一、选择题（本大题共计20小题每题3分共计60分）1.最早完成体外DNA重组的科学家是（）A. 伯格B. 帕米特C. 科恩D. 博耶【答案】A【解析】解 1972年美国斯坦福大学科学家伯格领导的研究小组完成了世界上首次DNA分子体外重组 A正确故选 A2.依据人的胰高血糖素基因制成DNA探针对样品进行检测不能与探针形成杂交分子的是（）A. 胰岛A细胞的DNAB. 胰岛B细胞的DNAC. 胰岛A细胞的mRNAD. 胰岛B细胞的mRNA【答案】D【解析】解 A.胰岛A细胞中都含有全套遗传物质也包括胰高血糖素基因则用胰高血糖素基因探针能与胰岛A细胞中解旋后的DNA单链发生碱基互补配对形成杂交分子 A正确B.在同一个人所有的体细胞都是有同一个受精卵经过有丝分裂来的胰岛B细胞含有胰高血糖素基因用胰高血糖素基因探针能与胰岛B细胞中解旋后的DNA单链发生碱基互补配对形成杂交分子 B正确C.胰岛A细胞由于基因选择性表达胰高血糖素基因表达会产生相应的mRNA 进行碱基互补配对形成杂交分子 C正确D.胰岛B细胞中虽然也含有胰高血糖素基因但是胰高血糖素基因不能在胰岛B细胞中表达则形成的mRNA也不能与探针进行杂交 D错误故选 D3.下列关于“分子运输车”的叙述正确的是（）A. 常见种类只有质粒和动植物病毒B. 能够在受体细胞中进行自我复制但不能整合到染色体DNA上C. 质粒上的抗生素抗性基因有利于质粒与外源基因连接D. 在基因工程操作中真正被用作载体的质粒都是进行过人工改造的【答案】D【解析】基因工程中运载目的基因的“分子运输车”常见种类有质粒和动植物病毒及噬菌体等 A错误载体能够在受体细胞中进行自我复制也可能整合到染色体DNA上 B错误质粒上的抗生素抗性基因有利于检测目的基因是否导入受体细胞内 C错误在基因工程操作中真正被用作载体的质粒都是进行过人工改造的 D正确4.下列叙述错误的是（）A. 酶的化学本质是蛋白质或RNAB. 纤维素酶能够降解植物细胞壁和细菌细胞壁C. 酶活性最高时的温度不适合酶的保存D. 不同酶的最适温度可能相同【答案】B【解析】5.乙型肝炎病毒和戊型肝炎病毒分别是乙型肝炎、戊型肝炎的病原体病毒结构见下图研究人员用基因工程技术获得了两种含肝炎病毒抗原基因（DNA序列）的细胞用转基因细胞来生产病毒表面蛋白抗原然后制备成疫苗用于肝炎的预防下列说法正确的是（）A. 获得的两种肝炎疫苗在人体内都不能复制需多次接种B. 获取两种肝炎病毒的抗原基因都必需要用到逆转录酶C. 获取的两种肝炎病毒抗原基因都可以直接转入受体细胞中进行表达D. 用抗原—抗体杂交法可确定肝炎病毒抗原基因是否插入到受体细胞DNA上【答案】A【解析】解 A.获得的两种肝炎疫苗在人体内都不能复制需多次接种目的是为了提高抗体和记忆细胞的数量 A正确B.乙型肝炎病毒是DNA病毒获取DNA病毒的抗原基因不需要用到逆转录酶 B错误c.获取的两种肝炎病毒抗原基因在导入受体细胞之前需要构建基因表达载体不可以直接转入受体细胞中进行表达 C错误D.用抗原—抗体杂交法只可确定目的基因在受体细胞中是否翻译出蛋白质 D错误故选 A6.利用基因工程技术生产羧酸酯酶（CarE）制剂用于降解某种农药的残留基本流程如下图所示下列叙述正确的是（）A. 过程①的反应体系中需要加入逆转录酶和核糖核苷酸B. 过程②需使用限制酶、Taq酶以及DNA连接酶C. 过程③需要使用NaCl溶液制备感受态的大肠杆菌细胞D. 过程④可利用DNA分子杂交技术鉴定CarE基因是否成功导入受体细胞【答案】D【解析】解分析图解图中过程①表示利用mRNA通过反转录法合成相应的DNA 过程②表示基因表达载体的构建过程③表示将目的基因导入受体细胞过程④表示通过筛选获得工程菌A.过程①表示通过反转录法合成目的基因该过程需要逆转录酶和脱氧核糖核苷酸 A错误B.过程②需使用限制酶和DNA连接酶构建基因表达载体是基因工程的核心步骤 B错误C.过程③常用 Ca^2+处理大肠杆菌使其成为易于吸收DNA的感受态细胞 C错误D.过程④可利用DNA分子杂交技术鉴定CarE基因是否成功导入受体细胞 D正确故选 D7.在研磨菜花时加入SDS的目的是（）A. 可以使蛋白质变性与DNA分离B. 防止DNA酶降解DNAC. 提供缓冲体系D. 使研磨充分【答案】A【解析】解根据题意已知SDS指的是SDS-聚丙烯酰胺．在研磨菜花时加入SDS 让蛋白质都带上大量的负电荷这样就避免了待分类蛋白质自身所带电荷的干扰使其分离完全取决于分子量大小从而与DNA分离．故选 A．8.DNA的粗提取中加入与滤液体积相等的、冷却的A溶液静置2min~3min 溶液中会出现白色丝状物上面的A溶液是指（）A. 0.9%的NaCl溶液B. 0.14mol/L的NaCl溶液C. 质量分数15%的HClD. 体积分数为95%的酒精溶液【答案】D【解析】解 DNA的粗提取中将处理后的溶液过滤加入与滤液体积相等、冷却的酒精溶液静置2~3min 溶液中会出现白色丝状物这就是粗提取的DNA故选 D9.高粱由于含有磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶在强光、高温的条件下其利用 CO_2的能力远远高于水稻从高粱的基因组中分离出磷酸烯醇式丙酮酸装化酶基因（ppc基因）将其转入水稻体内培育出了一批光合效率较高的转基因水稻下列说法正确的是（）A. 从高粱的基因组中分离出ppc基因需要限制性核酸内切酶、DNA连接酶等工具酶B. 获得的该转基因水稻都是杂合子C. 该批转基因水稻都能产生磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶D. 获得的转基因水稻每个体细胞都有ppc基因且都能产生磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶【答案】C【解析】解 A、从高粱的基因组中分离出ppc基因需要限制性核酸内切酶不需要DNA 连接酶 A错误B、获得的该转基因水稻不一定都是杂合子有些可能是纯合子 B错误C 、该批转基因水稻都能产生磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 C正确D、获得的转基因水稻每个体细胞都有ppc基因但由于基因的选择性表达不一定都能产生磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 D错误．故选 C．10.对禽流感的确诊先用PCR技术将标本基因大量扩增然后利用基因探针测知待测标本与探针核酸的碱基异同．右图P表示禽流感病毒探针基因在凝胶的电泳标记位置M、N、Q、W是四份送检样品在测定后的电泳标记位置哪份标本最有可能确诊为禽流感（）A. MB. NC. QD. W【答案】C【解析】图中P表示禽流感病毒探针基因在凝胶的电泳标记位置 M、N、Q、W是四份送检样品在测定后的电泳标记位置其中Q的电泳位置与P最接近因此最有可能为禽流感11.下列关于基因工程技术的叙述正确的是（）A. 抗虫基因即使成功地插入到植物细胞染色体上也未必能正常表达B. PCR反应中需要DNA解旋酶来催化DNA解旋C. 载体质粒全部采用抗生素合成基因作为筛选标记基因D. 切割质粒的限制性核酸内切酶均特异性地识别6个核苷酸序列【答案】D【解析】12.某四倍体植物细胞内的一条染色体上有P基因和Q基因它们编码各自蛋白质的前3个氨基酸的DNA序列如图起始密码子均为AUG 下列叙述正确的是（）A. 该四倍体植物细胞中最多含4个P基因B. a、b链的分开就意味着等位基因的分离C. 基因P和基因Q转录时都以b链为模板合成mRNAD. 若箭头处的碱基突变为T 则对应密码子一定改变【答案】D【解析】解 A.若该四倍体为纯合子则分类间期DNA复制后细胞中最多可含8个基因PA错误B.在减数分裂过程中等位基因随同源染色体的分开而分离 a、b链的分开表示DNA双螺旋结构解开进行DNA的复制或转录 B错误C.已知起始密码子均为AUG 则基因P以b链为模板合成mRNA 基因Q以a链为模板合成mRNA C错误D.基因P以b链为模板合成mRNA 若箭头处碱基突变为T 即CAG变为TAG 则对应的密码子由GUC变为了AUC D正确故选 D13.下列关于基因工程的叙述中正确的是（）①基因工程是人工进行基因重组的技术是在分子水平上定向改变生物的遗传物质②基因治疗是基因工程技术的应用③基因工程打破了物种与物种之间的界限④DNA探针可用于病毒性肝炎的诊断、遗传性疾病的诊断、改造变异的基因、检测饮用水病毒含量．A. ②③④B. ①②③C. ①②④D. ①③④【答案】B【解析】解①基因工程的操作水平属于分子水平其运用的原理为基因重组即是在分子水平上对生物遗传作人为干预①正确②基因治疗属于基因工程技术的应用②正确③基因工程打破了生殖隔离突破远缘杂交不亲和的障碍③正确④DNA探针可用于病毒性肝炎的诊断、检测饮用水病毒含量但是不能改造变异的基因④错误．故选 B．14.被限制酶错位切开的 DNA两条单链的切口带有几个伸出的核苷酸它们正好碱基互补配对这样的切口叫黏性末端如图①～⑥是多种限制酶识别序列及切割位点示意图据图分析下列叙述错误的是（）A. 不同的限制酶可能识别相同的DNA序列切割产生不同的黏性末端B. 不同的限制酶可能识别不同的DNA序列切割产生相同的黏性末端C. 不同的限制酶可能识别相同的DNA序列切割产生相同的黏性末端D. 限制酶只能识别“其中一条链上按\ 5^prime 到\ 3^prime 读取的序列与其互补链上按相同的\ 5^prime 到\ 3^prime读取的序列一致”的回文序列【答案】D【解析】解 A.由①②可知不同的限制酶可能识别相同的DNA序列切割产生不同的黏性末端 A正确B.由③④可知不同的限制酶可能识别不同的DNA序列切割产生相同的黏性末端 B正确C.由⑤知不同的限制酶可能识别相同的DNA序列切割产生相同的黏性末端 C正确D.由⑥可知 BbvCⅠ识别的就不是回文序列 D错误故选 D15.下列关于PCR技术的叙述正确的是（）A. PCR技术建立在对扩增的目的基因序列完全已知的基础上B. 该技术需要解旋酶和热稳定的DNA聚合酶C. 该技术需要一对特异性的引物要求一对引物的序列是互补的D. 该技术应用体内DNA双链复制原理也需要模板、原料、能量、酶等条件【答案】D【解析】16.下列有关叙述不正确的是（）A. C、H、O、N、P是DNA、质粒、胰岛素、NADPH共有的化学元素B. 糖蛋白、抗体、RNA聚合酶、限制性内切酶都是具有识别作用的物质C. 结合水是细胞结构的重要组成成分D. 根据细胞代谢需要线粒体可在细胞质基质中移动和增殖【答案】A【解析】A、胰岛素的化学本质是蛋白质元素组成是C、H、O、N、S 不含有P A错误B、糖蛋白在细胞间的识别中具有重要作用抗体能特异性识别抗原并与之结合 RNA聚合酶、限制性内切酶都能识别相应的底物并起催化作用 B正确C、结合水是细胞结构的重要组成成分主要与细胞的其它物质结合在一起 C正确D、线粒体是有氧呼吸的主要场所根据细胞代谢需要线粒体可在细胞质基质中移动和增殖 D正确故选A.17.科学家将编辑基因的分子工具构建到靶向侵染心肌细胞的病毒中通过尾部静脉注射到成年小鼠体内成功编辑线粒体DNA 该研究让耳聋、癫痫、肌无力等线粒体遗传病病人看到治愈的希望下列叙述错误的是（）A. 线粒体基因的遗传不遵循分离定律B. 侵染心肌细胞的病毒在该研究中作为载体起作用C. 线粒体DNA的突变可能会导致能量代谢障碍D. 该项研究中后代雌性小鼠心脏功能会得到改善【答案】D【解析】解 A.线粒体基因属于细胞质基因其遗传不遵循分离定律和自由组合定律 A正确B.侵染心肌细胞的病毒在该研究中作为运载基因的载体 B正确C.线粒体是细胞的能量供应车间线粒体DNA的突变可能会导致能量代谢障碍 C正确D.该项研究用的是靶向侵染心肌细胞的病毒心肌细胞的线粒体功能得到改善生殖细胞中的线粒体功能不变故该项研究中后代雌性小鼠心脏功能仍然未能改善 D错误故选 D18.以下有关基因工程的说法正确的是（）A. 目的基因是指重组DNA质粒B. 一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列C. DNA重组所用的工具酶是限制酶、连接酶和运載体D. 只要受体细胞中含有目的基因目的基因就一定能够表达【答案】B【解析】目的基因和质粒重组才能构成重组DNA质粒 A错误限制酶具有专一性一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列 B正确运载体不是工具酶 C错误目的基因导入受体细胞后不一定能够成功表达 D错误19.下列关于组成细胞的化合物的叙述错误的是（）A. 胆固醇是构成细胞膜的成分B. 糖类、脂质、蛋白质都能氧化分解供生物利用C. 某些蛋白质在生命活动中能够传递信息D. 所有糖类在细胞中的作用都是为细胞供能【答案】D【解析】A．胆固醇是构成动物细胞膜的重要成分 A正确B．糖类是主要的能源物质脂肪是储能物质蛋白质也能氧化供能 B正确C．某些蛋白质在生命活动中能传递信息如细胞膜上的糖蛋白 C正确D．糖类中的纤维素是构成细胞壁的结构成分无法为细胞供能 D错误故选D20.下图为DNA分子在不同酶的作用下所发生的变化图中依次表示限制性酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、解旋酶作用的正确顺序是（）A. ①④③②B. ①④②③C. ①②④③D. ①②③④【答案】B【解析】解限制酶能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂形成黏性末端因此作用于① DNA聚合酶用于DNA分子的复制能在单链上将一个个脱氧核苷酸连接起来因此作用于④ DNA连接酶能在具有相同碱基末端的两个DNA片段之间形成磷酸二酯键因此作用于② 解旋酶能够将DNA分子的双螺旋解开故作用于③故选 B二、解答题（本大题共计5小题每题10分共计50分）21.（1）要构建重组人乳铁蛋白基因、重组人溶菌酶基因表达的载体需在目的基因的上游和下游分别引入________21.（2）在造血稻米的培育过程中研究人员利用水稻外植体经脱分化形成愈伤组织愈伤组织是由具有________能力的________细胞组成若对水稻使用________法导入重组质粒则需要在愈伤组织中加入适量的酚类化合物目的是 ________以促进转化对于筛选后获得的转基因植株自交若某植株所结种子中具有重组人血清白蛋白的占________ 则判断该植株为T-DNA单拷贝插入（只插入了一个目的基因）21.（3）某些重组蛋白的使用不会发生药物引发的免疫排斥反应方法是通过设法除去该蛋白基因中与抗原决定有关的DNA序列而使该药物不含有________ 不对相应蛋白质直接进行改造而对其基因进行改造的原因是________【答案】（1）启动子和终止子【解析】（1）要构建重组人乳铁蛋白基因、重组人溶菌酶基因表达的载体需在目的基因的上游和下游分别引入启动子和终止子从而保证目的基因正常的转录过程【答案】（2）分生, 薄壁, 农杆菌转化, 吸引农杆菌移向愈伤组织, 3/4【解析】（2）在造血稻米的培育过程中研究人员利用水稻外植体经脱分化形成愈伤组织愈伤组织是由具有分生能力的薄壁细胞组成的这些细胞的全能性较高若对水稻使用农杆菌转化法导入重组质粒则需要在愈伤组织中加入适量的酚类化合物这些酚类化合物能吸引农杆菌移向愈伤组织以促进转化对于筛选后获得的转基因植株自交若该植株为T-DNA单拷贝插入（只插入了一个目的基因）则相当于该植株为杂合子则其自交所结种子中具有重组人血清白蛋白的占3/4【答案】（3）（引起免疫排斥的）抗原, 蛋白质是由基因决定的（对蛋白质的结构进行设计改造必须通过基因来完成）【解析】（3）某些重组蛋白的使用不会发生药物引发的免疫排斥反应方法是通过设法除去该蛋白基因中与抗原决定有关的DNA序列而使该药物不含有（引起免疫排斥的）抗原进而无法使机体发生相应的免疫反应该方法没有对相应蛋白质直接进行改造而对其基因进行改造的原因是蛋白质是由基因控制合成的对基因的改造过程实现了对该基因控制合成的所有蛋白质的改造22.（1）图甲中①\sim ⑤所示的生物工程为________．该工程是指以________作为基础通过________修饰或基因合成对现有________进行改造或制造出一种新的蛋白质以满足人类的生产和生活的需求．22.（2）图甲中序号④所示过程叫做________ 该过程遵循的碱基互补配对原则不同于翻译过程的是________（请将模板碱基写在前）．22.（3）若预期蛋白质欲通过乳腺生物反应器生产则构建基因表达载体时图乙中序号1代表的是________ 且在图甲中⑨过程之前要对精子进行筛选保留含性染色体________的精子．【答案】表示蛋白质工程, 蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系, 基因, 蛋白质【解析】解（1）蛋白质工程是以蛋白质分子的空间结构规律及其与生物功能的关系作为基础通过基因修释或基因改造合成对现有蛋白质进行改造或制造一种新的蛋白质以满足人类的生产和生活需要．图甲中①\sim ⑤所示的生物工程为表示蛋白质工程．【答案】逆转录, \A -T【解析】（2）图甲中④表示逆转录过程该过程遵循的碱基互补原则为U-A、A-T、C-G、G-C 而翻译过程中遵循的碱基互补原则为U-A、A-U、C-G、G-C 前者不同于翻译过程的是A-T．【答案】乳腺蛋白基因的启动子, X【解析】（3）制备乳腺生物反应器过程中在构建基因表达载体时需在目的基因前加上乳腺蛋白基因的启动子图乙中序号1代表的是启动子因为只有雌性个体能分泌乳汁所以在图甲中⑨过程之前要对精子进行筛选、保留含性染色体X的精子．23.（1）切割目的基因与质粒通常选用同一种限制酶原因是_________ 对平末端和黏性末端都能进行连接的是________酶23.（2）基因工程的核心是________ 启动子的作用是________23.（3）重组质粒导入的受体细胞一般是________ 原因是________23.（4）培育转基因牛的过程中对含重组质粒的受体细胞进行培养时需满足的条件有________（填序号）①无菌无毒环境②添加血清、血浆等一些天然物质的培养液③适宜的温度和pH④含95% CO_2、5% O_2的混合气体的培养箱23.（5）从分子水平检测利用________法可以鉴定出转基因牛体内的目的基因已成功表达【答案】（1）得到相同的黏性末端, \ T_4DNA连接【解析】解（1）酶具有专一性同一种限制性核酸内切酶切割目的基因和质粒会产生相同的黏性末端有利于后面的连接对平末端和黏性末端都能进行连接的是 T_4DNA连接酶【答案】（2）基因表达载体的构建, RNA聚合酶的识别结合位点开启基因转录【解析】（2）基因工程的核心是基因表达载体的构建启动子的作用是RNA聚合酶的识别结合位点开启基因转录【答案】（3）受精卵, 受精卵能够直接发育成个体易获得转基因个体【解析】（3）重组质粒导入的受体细胞一般是受精卵原因是受精卵能够直接发育成个体易获得转基因个体【答案】（4）①②③【解析】（4）培育转基因牛的过程中对含重组质粒的受体细胞进行培养时需满足的条件有无菌无毒环境添加血清、血浆等一些天然物质的培养液和适宜的温度和pH【答案】（5）抗原—抗体杂交【解析】（5）抗原—抗体杂交法可以直接检测出目的基因的表达产物蛋白质24.（1）基因工程中常用的工具有_______________________ T_4DNA连接酶在基因工程中的作用特点是__________________________24.（2）基因工程中的目的基因主要指________________ 也可以是一些具有________作用的因子24.（3）如果将水稻细胞不同基因的DNA片段导入受体菌的群体中储存这个受体菌群就叫作水稻的________24.（4）20世纪60年代我国科学家经过不懈努力完成了人工合成胰岛素这项创举人工合成蛋白质的基本途径是从预期的蛋白质的功能出发→____________________→推测应有的氨基酸序列→________________ 通过基因修饰或基因合成对现有蛋白质进行改造或制造一种新的蛋白质的技术属于________工程【答案】（1）限制酶、DNA连接酶、（运）载体, 既可连接黏性末端又可以连接平末端【解析】解（1）基因工程中常用的工具有限制酶、DNA连接酶、（运）载体 T_4DNA 连接酶在基因工程中的作用特点是既可连接黏性末端又可以连接平末端【答案】（2）编码蛋白质的基因, 调控【解析】（2）目的基因主要是指编码蛋白质的基因也可以是一些具有调控作用的因子【答案】（3）基因文库【解析】（3）如果将水稻细胞不同基因的DNA片段导入受体菌的群体中储存这个受体菌群就叫作水稻的基因文库【答案】（4）设计预期的蛋白质结构, 找到相对应的脱氧核苷酸序列, 蛋白质【解析】（4）人工合成蛋白质的基本途径是从预期的蛋白质的功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列通过基因修饰或基因合成对现有蛋白质进行改造或制造一种新的蛋白质的技术属于蛋白质工程25.（1）根据前胰岛素原的氨基酸序列设计前胰岛素原基因（简称P基因）会设计出多种脱氧核苷酸序列这是因为________ 由于P基因较小故常用________法获得该基因25.（2）人们常选用大肠杆菌作为受体菌原因是________ 研究发现诸如胰岛素原等小分子蛋白质易被大肠杆菌内的蛋白酶水解为防止蛋白质被降解在生产时可选用________的大肠杆菌作为受体菌25.（3）从大肠杆菌中获取的前胰岛素原无生物活性需在体外用蛋白酶切除引导肽和C段肽不能从大肠杆菌中直接获得具有生物活性的胰岛素的原因是________【答案】密码子具有简并现象（存在多种密码子决定同一种氨基酸的现象）, 人工合成【解析】由于密码子具有简并现象因此根据氨基酸序列会设计出多种脱氧核苷酸序列对于较小的基因（如P基因）可用人工方法合成该基因【答案】单细胞、繁殖快、遗传物质少, 蛋白酶缺陷型【解析】人们常选用大肠杆菌作为受体菌原因是单细胞、繁殖快、遗传物质少研究发现诸如胰岛素原等小分子蛋白质易被大肠杆菌内的蛋白酶水解为防止蛋白质被降解在生产时可选用蛋白酶缺陷型的大肠杆菌作为受体菌【答案】大肠杆菌为原核细胞缺少加工修饰蛋白质的细胞器（内质网、高尔基体）【解析】大肠杆菌是原核细胞无内质网、高尔基体等细胞器不能对前胰岛素原进行加工。
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原文：Activation of Hepatitis B Virus S Promoter by the Viral Large作者：ZHICHANG XU, GREGORY JENSEN, AND T. S. BENEDICT YEN作者单位：Department of Pathology, University of California, San Francisco, and Pathology Service, Veterans Affairs Medical Center, San Francisco, California发表刊物：JOURNAL OF VIROLOGY, Oct. 1997, p. 7387–7392以下为中文翻译稿：乙肝病毒大表面蛋白通过诱导内质网压力激活S启动子乙肝病毒 (HBV) 编码三种形式的表面蛋白。
其中，数量较少的大表面蛋白由preS1启动子调控的转录物翻译而来，中、小表面蛋白则由下游的S 启动子调控的转录物翻译而来。
当大表面蛋白过量表达时, 亚病毒和病毒颗粒的分泌都被阻滞在分泌路径中。
我们发现，大表面蛋白的过量表达，可导致S 启动子高达10倍的激活（对于无关启动子，则不能激活）。
中、小表面蛋白，和可分泌的大表面蛋白，都不能激活S 启动子。
但是，一些可诱导内质网(ER)压力的化学试剂，却具有与大表面蛋白相同的激活效果。
大表面蛋白也能在整个病毒基因组的背景中激活S 启动子。
因此，HBV 似乎已经进化形成了一种反馈机制：大表面蛋白的积累诱导产生ER压力，ER压力使中、小的表面蛋白的合成增加，然后，它们与大表面蛋白一起，组装成混合的、可分泌的颗粒。
另外，像其他可诱导ER压力的试剂一样，大表面蛋白也能激活细胞的 grp78 和 grp94 启动子,这增加了它改变宿主细胞生理特性的可能。
乙肝病毒（HBV）是一种具外膜的嗜肝性DNA病毒，已经在全世界范围内感染了大量人群。
在这种病毒的外膜中，发现了三种HBV表面（外膜）蛋白。
大表面蛋白由开放阅读框的第一个ATG密码起始翻译而来，中、小表面蛋白是由更远的下游的内部ATG密码起始翻译而来（图1）。
三种表面蛋白都是跨膜蛋白，因此翻译之后，都插入在内质网上（ER），它们与外膜胞质核心（核衣壳）一起，组装成成熟的病毒体，通过组成型分泌途径，被分泌到胞外。
另外，在没有其它的病毒蛋白存在的情况下，中蛋白和/或小蛋白则会出芽进入ER内腔，以球状或丝状的亚病毒颗粒的形式分泌出去。
相反，如果只单独表达了LS，则LS就不会被分泌出去，而是以ER腔内颗粒的形式滞留下来。
如果LS与其它种类的表面蛋白共同表达，它们就会形成异质性多聚体，这种多聚体的表型依赖于不同表面蛋白的相对含量的多少：LS相对含量较低，多聚体分泌，而LS相对含量较高，则多聚体滞留。
多聚体的滞留，不仅影响非感染性亚病毒颗粒的分泌，而且也会影响感染性病毒颗粒的分泌。
因此，对病毒的生命周期产生危害[1]。
所以，并不令人奇怪的是，在感染性细胞中，LS的量，比中、小蛋白少得多。
HBV的这种差别性的调控方式，是通过两个独立的启动子实现的（图1）。
上游的preS1启动子所调控的转录物，主要翻译成LS，而下游的S启动子所调控的转录物，则被翻译成中蛋白和小蛋白。
因为前S1mRNA的量通常比SmRNA少得多，所以，LS的量总是不足的，不能阻止颗粒的分泌。
因为LS与中、小表面蛋白的相对含量比，对于病毒的复制是关键的，所以我们推测，可能存在一个反馈机制，来确保均衡的合成这些蛋白。
在本研究工作中，我们证明了这样的机制确实存在，LS可显著激活S启动子。
这种激活与LS细胞内阻滞相关联，并且能被可诱导ER 压力的化学试剂模拟。
相反，LS也能激活细胞内的能对ER压力产生应答的启动子，而其它不相关的启动子则不行。
因此，LS的过量表达以及随后的胞内颗粒滞留，似乎是通过由ER压力诱导的一种胞内信号途径来激活S启动子。
这种激活反过来会增加中、小表面蛋白的合成，这样，使亚病毒颗粒和病毒颗粒得以分泌。
我们的发现不仅揭示了HBV基因表达调控的新的一层复杂性，而且提出了一种机制，LS通过这种机制，在慢性HBV感染过程中，影响宿主细胞的生理特性。
图. 1.(顶部) HBV 基因组编码表面蛋白的区域的示意图。
阴影框表示的是开放阅读框。
preS1 启动子引发编码LS (含 preS1, preS2, 和表面域)的 2.4-kb 转录物。
S 启动子引发2.1-kb转录物，横跨了一个内在ATG密码，从而，引发中、小表面蛋白(分别含preS2和表面域或仅含表面域). 在质粒 pCMVLM-S-中,内源性 preS1 启动子被CMV立即-早期取代，并且编码中、小表面蛋白的起始密码子ATG被突变成ACG。
@, 即多聚腺苷酸化信号。
(底部)显示的是 S 启动子的一部分序列。
CCAAT元件被加框显示，两个在体内与Sp1 结合的位点加了下划线。
每个位点的簇生点突变序列标注在主序列下面。
材料与方法质粒。
所有的操作，酶的处理，和质粒的生长都按照标准技术流程进行[27]。
所有的HBV基因组DNA都得自于病毒株adw2[29]。
质粒pSVLM-S- (2)含有猿猴病毒40（SV40）增强子-早期启动子，这个启动子位于含S、X基因及多聚腺苷酸信号的HBV DNA片段的上游。
中、小表面蛋白的起始ATG密码已被突变；这样，含有这种质粒的细胞就只表达LS和X蛋白，而不表达中、小蛋白。
除了一个编码β-内酰胺酶信号序列的DNA片段被融合到LS开放阅读框的5’端外，质粒pSVsignalLM-S- (2)与pSVLM-S-相同。
这一改变的结果是，可分泌型的LS的合成[2]。
除了SV40启动子被细胞巨化病毒（CMV）立即早期启动子取代（通过替换一个pCMVL [33]的片段），质粒pCMVLM-S-与pSVLM-S-相同。
pSVLM-S-的Sal I到Eco RI的片段，PCR扩增时使用的引物为5’GGCGTCGACCGAGCTTGCATGCCTGCAGG和5’GTGGAATTCCAC TGCGTGGCC（注意后者有一个核苷酸发生了变化[划线]，所以就像在pSVLM-S-中一样，中、小蛋白的起始密码ATG被改变为ACG）。
已确认扩增片段的序列没有出现其它的突变。
质粒pCMVL-M-S-在LS基因内含有一个移码突变，所以不能合成全长的LS。
这种质粒的来源是：先将pCMVL-M-S- 用内切核酸酶Eco RI处理，然后用DNA聚合酶I的Klenow片段修复交错末端，最后重新连接。
质粒pSVLM-S-X-在X基因内有两个损伤：一个是在1682与1683位残基之间插入一个额外的G残基，造成一个移码突变；另一个是将1685位的残基突变为A，造成一个早期终止密码子。
最初，这些突变是用诱变引物在全长的HBV结构(pHBV1.2) [31]中经重叠PCR扩增形成的，然后，通过把后者的自Spe I至Kpn I 的片段更换为前者质粒的自Spe I至Apa I的片段（Kpn I- 和Apa I-的消化末端都是用DNA聚合酶I的Klenow片段修复的），最后将这些突变引入质粒pSVLM-S-。
质粒pSAgDHin [38]含调控中、小表面蛋白表达的天然S启动子，而质粒pCMVS含有调控小表面蛋白表达的CMV启动子。
质粒pRVL- (1)含整个HBV基因组的超过全长的片断，它不含任何外源启动子，它也含有一个点突变，这个突变不影响任何其它的HBV基因产物的表达，只是使LS不能表达。
质粒突变I[32]含有整个HBV基因组的超过全长的片段，其中，含有CCAAT元件的S启动子出现了一个129-bp的框内缺失。
这个缺失导致了中、小表面蛋白合成的减少，而增加了LS在转染细胞中的合成，因此，将会使表面蛋白颗粒在小囊泡中堆积。
质粒pS1CAT含130-bp的S启动子片段，它是由PCR扩增产生的，并通过DNA测序确认，插入在无启动子的氯霉素乙酰转移酶(CAT)报告基因pCAT-basic (Promega)的限制内切酶位点Hin dIII 和Xba I之间。
使用的启动子为5’CACAAGCTTAACAATTCCTCCTCCTGCCTCCAC 和 5’CAGTTCTAGACTGCAGAGGTTGGTGCAAGGCAG。
类似的在CCAAT元件和S启动子Sp1结合位点出现突变的报告质粒，是将含有这些突变的HBV变异体（先通过重叠PCR产生）作为模板而产生的。
质粒pSBCAT含调控CAT 基因[38]的HBV preS1启动子。
质粒pgrp78(2457)CAT [13]和pgrp94(2357)CAT [23]分别含有调控CAT 基因的启动子grp78 和grp94，这是承蒙A. S. Lee (University of Southern California)惠赠的。
质粒 pSp1CAT(3) (12)含minimal人类免疫缺陷性病毒I 型启动子，它含有三个串联的Sp1位点，用以调控CAT基因，这是承蒙K. T. Jiang (National Institutes of Health) 通过S. Tong-Starksen (University of California, San Francisco)惠赠的。
质粒pSp1CAT(3) CCAAT含HBV启动子的CCAAT元件，插入在pSp1CAT的Pst I 和Sal I 位点之间。
这个插入是通过将序列为5’GCCACCAATCGGCAGTCAGGAAGGCAGA 和5’TCGATCTGCCTTCCTGACTGCCGATTGGTGGCTGCA两个寡聚核苷酸退火得来的。
细胞培养与转染。
将HuH-7肝细胞瘤细胞,置于37℃，外加10%胎牛血清的Dulbecco’s改良Eagle’s 培养液，含7%CO2的空气中培养。
将质粒DNA用磷酸钙方法转染细胞，在转染的第2天收集。
细胞在收集前的最后16个小时用如下试剂处理：2-脱氧葡萄糖（10mM，由1M贮存液稀释而来），衣霉素(50μg/ml, 用二甲基亚砜[DMSO]稀释5 mg/ml贮存液而来), EGTA (5 mM,由0.25 M贮存液稀释而来),毒胡萝卜素(4μg/ml，用DMSO 稀释5mg/ml 贮存液而来)，A23187 (200μg/ml,500mg/ml 贮存液稀释于DMSO而来), DMSO (0.8μl/ml)。
CAT测定和RNA分析。
转染细胞中的CAT活性用薄层层析法定量。
必要时，稀释细胞抽提液，所以活性能保持在测定的线性范围内（<50%的氯霉素的乙酰化）。
转染细胞的RNA用RNAzolB（Biotex）纯化，而引物延伸则被用于preS1和S转录物的定量，就像前面提到的那样[37]。