HIV核酸(RNA)提取
HIV-1病毒载量试剂1技术参数
HIV-1病毒载量试剂1技术参数1.名称：人类免疫缺陷病毒（1型）核酸检测试剂盒（PCR-荧光法）。
2.用途：用于定量检测人血浆中人类免疫缺陷病毒（1型）。
3.原理：应用实时荧光定量聚合酶链式反应原理。
4.检测项目：HIV-1RNA定量检测。
5.检测亚型：HIV-1M、O组。
6.检测方法：全自动核酸分离纯化，全自动核酸扩增和实时荧光PCR方法。
7.适用样品种类：非肝素抗凝血浆。
8.定量方式：内部标准品定量。
9.质控品：提供阴性、弱阳性、强阳性对照质控品。
10.技术要求：a.检测灵敏度：≤20copies/ml,置信度≥95%。
b.检测范围：20-1×107copies/ml。
c.检测特异性：100%。
d.重复性：CV值≤0.3log。
e.规格:48T/盒。
f.即开即用型液体试剂。
11.试剂储存条件：2-8℃保存。
12.试剂组份：包括核酸提取、纯化、扩增和检测的全部试剂。
13.抗污染方案：采用UNG酶防止PCR产物污染。
14.样品处理能力：可以同时进行检测1-72个样品15.备件：含完整实验过程中所需的相关耗材及洗液。
16.适用设备：适用于CobasAmpliprepCobasTaqman全自动病毒载量检测系统。
17.认证文件：中国医疗器械进口注册证等文件。
18.供货计划：按用户要求数量准时分批供货，试剂到货时有效期大于10个月。
HIV-1病毒载量试剂2技术参数1．名称：人类免疫缺陷病毒（HIV-1）核酸（RNA）提取及检测试剂盒2．用途：用于定量检测人血浆中人类免疫缺陷病毒（1型）。
3．检测方法：应用RT-PCR和Real-time实时荧光定量检测技术HIV-1型各组病毒载量。
4．检测项目：HIV-1RNA定量检测。
5.检测亚型：HIV-1型M组(A-H)、O组、N组。
6.适用设备：m2000sp自动核酸提取仪，m2000rt实时荧光定量PCR仪; 7．定量方式：外部标准品定量8．技术要求8.1检测灵敏度:≤40copies/mL（0.6mL、1.0mL样本体系）8.2特异性：100%(95%CI99.28-100%)8.3检测范围:40-107copies/mL8.4适用样本种类:血浆(ACD-A或EDTA抗凝)8.5检测样本体积:可选0.2mL、0.5mL、0.6mL和1.0mL8.6检测方式:96孔PCR反应板8.7检测批量：一次检测批量可选24，48，72和968.8内测标准差(SD):≤0.25log copies/mL8.9内参要求：与样本一起提取和扩增，质控整个实验过程;9.认证文件：中国医疗器械进口注册证等文件。
疾控中心艾滋检测方法
疾控中心艾滋检测方法疾控中心艾滋检测方法主要有两种：抗体检测和核酸检测。
抗体检测是目前广泛使用的艾滋病检测方法之一。
它通过检测人体内是否存在抗人免疫缺陷病毒（HIV）的抗体来判断感染的情况。
一般来说，艾滋病病毒进入人体后，免疫系统会产生特异性的抗体来对抗病毒。
因此，通过检测人体内是否存在这些特定的抗体，可以判断一个人是否感染了艾滋病毒。
抗体检测通常采用酶联免疫吸附实验（ELISA）或免疫荧光法（IFA）等检测方法。
具体操作过程一般包括以下几步：首先，从被检测者体内采集样本，一般选择血液作为样本。
然后，对血液样本进行预处理和稀释处理，以获得合适的测试条件。
接下来，将这些预处理过的样本与特定的艾滋病毒抗原结合，从而形成抗原-抗体复合物。
最后，通过添加染色剂或荧光染料等试剂，可以观察到复合物的形成，进而判断是否存在抗体。
抗体检测具有操作简单、费用低廉等优点。
然而，该方法在感染后的早期阶段可能无法准确检测到抗体，因为人体在感染后需要一段时间才能产生足够的抗体。
此外，由于艾滋病病毒的变异性较高，不同亚型的病毒可能具有不同的抗原性，因此抗体检测方法可能无法准确检测到所有的感染。
核酸检测是另一种艾滋病检测方法。
它可以直接检测人体内是否存在艾滋病病毒的核酸（例如RNA或DNA）。
核酸检测一般采用聚合酶链式反应（PCR）或其衍生方法进行。
具体操作过程一般包括以下几步：首先，从被检测者体内采集样本，一般选择血液、唾液或尿液等作为样本。
然后，对样本进行前处理，以提取目标病毒的核酸。
接下来，使用特定的引物和酶，通过PCR反应扩增感兴趣的DNA片段，或者通过逆转录反应将RNA转录为cDNA，并进行扩增。
最后，通过电泳、荧光探针法或比色法等方法，可以检测到扩增产物的存在与否，进而判断是否存在病毒核酸。
核酸检测具有高度敏感性和特异性的优点，可以在感染后较早期就检测到病毒核酸，减少漏诊率。
但是，核酸检测仪器设备较复杂，操作难度相对较高，且费用较高。
艾滋病核酸检测
艾滋病核酸检测艾滋病核酸检测艾滋病核酸检测，直击艾滋病病毒的RNA结构，检测血液中是否存在病毒核酸，诊断有无病原体感染。
采用PCR技术，使用分子生物学实验室通用的扩增试剂和自行研究开发设计的复合引物，覆盖常见的HIV毒株，具有很高的灵敏度。
使用二次扩增的套式PCR扩增方法，提高检测的特异性，降低假阳性的概率。
核酸检测将艾滋病病毒的检测窗口期缩短至11天，并且核酸检测这项技术目前可将乙肝、丙肝病毒的检测“窗口期”分别由原来的50天、72天缩短到25天、59天。
艾滋病核酸检测技术1、HIV基因结构HIV基因组由两条单链RNA组成，每个RNA基因组约为9.7k，在RNA5′端有一帽结构（m7G5ppp5′GmpNp），3′端有poly（A）尾巴。
HIV的主要基因结构和组合形式与其他反转录病毒相同，均由5′末端长重复（long terminal repeat，LTR）、结构蛋白编码区（gag）、蛋白酶编码区（pro）、具有多种酶活性的蛋白编码区（pol）、外膜蛋白（env）和3′末端的长重复LTR区组成。
2、核酸的提取方法核酸提取均采用磁珠法。
1）磁珠提取的原理：将磁珠上标记特异性吸附核酸的物质特异性吸附核酸，并通过磁分离技术将病毒核酸从裂解液中提取出来。
2）步骤：裂解—吸附—洗涤—洗涤—洗涤—洗脱3）优点：a.磁珠提取特异性高，受标本因素影响小，灵敏度高b.易于实现自动化4)缺点：a.成本较高、并需要一定的仪器(半自动、全自动)。
b.完全手工工作，工作量太大。
3、应用套式聚合酶链反应(nPCR)检测技术根据HIV-1 gag.pol和env基因序列设计了套式聚合酶链反应(nesled polymerasechain reaction，nPCR)引物。
将外周血单个核细胞裂解液先用外侧引物扩增，其产物再经内侧引物扩增，直接走凝胶电泳判定结果。
nPCR 的敏感性。
较常规PCR高100～1000倍，可检测到0.5fg质粒DNA和50μ1HIV-1感染者外周血样中的HIV基因。
如何进行献血员HIV检测
如何进行献血员HIV检测对献血员HIV的检测主要包括初筛试验和确认试验。
初筛检测的方法有金标法、ELISA、明胶颗粒凝集试验、各种快速检测实验。
其中使用最多的是ELISA，其间接法和双抗原夹心法最常用。
确认试验常用免疫印迹法（WB法）。
对于初筛为阳性的标本应做双孔复测，若均为阳性或一阴一阳则应做确认试验。
各项指标的实验技术原理一、HIV抗体WHO和我国卫生部推荐使用HIV感染诊断方法，是血清学抗体检测。
抗体检测是筛选的重要依据。
1、酶联免疫吸附法(ELISA夹心法):原理：将HIV抗原包被固相载体上，标本中HIV抗体与包被的HIV抗原结合形成复合物，利用抗体的多价性，又与酶标记的同类HIV抗原形成抗原抗体复合物，最后加入底物，在酶作用下发生显色反应，测定光密度值。
2、金（硒）标记法：原理：是用HIV重组抗原和羊抗鼠IgG分别固定于硝酸纤维素膜，并和包被有胶体金标记的HIV重组抗原及鼠IgG的玻璃纤维纸片及其他试剂组成。
应用胶体金免疫层析技术，采用双抗原夹心的原理检测人类血清及血浆样本中的HIV 1/2抗体。
其特点是比较稳定，操作简单快速，但该方法诊断特异性低于其他方法，假阳性率高。
灵敏度也低。
仅用于无偿献血员现场初筛及临床紧急情况的使用。
3、明胶颗粒凝集试验：原理：是使用明胶颗粒吸附HIV抗原，检测被筛查品中HIV1/2抗体。
该方法也不需仪器设备，其灵敏度高于ELISA法。
二、 HIV抗原在HIV感染的早期会出现一过性的抗原血症，此期间血浆中的病毒抗原是可能被检测到的，大多数感染者在随后相当长的一段时间内测不到抗原，在疾病晚期，部分患者可再次出现可检测到的抗原。
抗原的检测一般来说用的比较少，可作为定性检测的辅助诊断。
主要是检测抗原P24。
1、ELISA法：原理：主要是在固相上包被抗P24抗体，以捕获样品中的抗原成分，再用酶标记的另一抗P24抗体与被捕获得抗原反应，通过对酶催化显色的强度测定判断结果。
rna提取实验步骤
RNA提取实验步骤如下：
●匀浆处理：
●组织：将组织在液氮中磨碎，每50-100mg组织加入1ml TRIzol，用匀浆
仪进行匀浆处理。
●单层培养细胞：直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞，每10cm2面积（即
3.5cm直径的培养板）加1ml，用移液器吸打几次。
●细胞悬液：离心收集细胞，每5-10×106动物、植物、酵母细胞或1×107
细菌细胞加入1ml TRIzol，反复吸打。
加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。
一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。
将匀浆样品在室温（15-30℃）放置5分钟，使核酸蛋白复合物完全分离。
可选步骤：如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖或胞外物质（肌肉，植物结节部分等）可于2-8℃10000×g离心10分钟，取上清。
每使用1ml TRIzol加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟。
2-8℃10000×g离心15分钟。
收集上清液。
使用酒精洗涤RNA，以去除离心管内残留的试剂和盐。
最后利用2-甲基硫氰酸盐（MECT）溶液进行脱水，使RNA干燥而不影响RNA的完整性。
此外，如果是从动物组织中提取RNA，还需要使用DNase I处理RNA，以去除残留的DNA。
如果是从细菌中提取RNA，需要先进行细菌的裂解和细胞壁的破碎。
同时需要注意，整个提取过程需要严格控制RNA酶的污染。
hiv rna检测原理
hiv rna检测原理
HIV RNA检测是一种用于检测人体内是否存在HIV病毒的检测方法。
其原理是通过检测血液样本中的HIV病毒RNA，从而确定感染者的病毒载量。
以下是HIV RNA检测的原理和流程：
1. 提取血液样本，首先需要从被检测者的静脉血中提取血液样本，通常是在临床实验室或医疗机构进行采集。
2. 分离核酸，提取到的血液样本中含有病毒RNA，需要进行核酸提取和纯化的步骤，以获取纯净的核酸样本。
3. 反转录，经过核酸提取后，接下来的步骤是将病毒RNA反转录成相应的DNA。
这一步骤通常借助于反转录酶，将RNA转录成互补的DNA。
4. 扩增和检测，得到的DNA样本需要进行扩增，通常使用聚合酶链式反应（PCR）技术，将少量的DNA扩增成大量，以便进行后续的检测。
扩增后的DNA样本会被引物和荧光探针结合，形成荧光信号。
5. 测序和定量，扩增后的DNA样本可以进行测序和定量分析，
通过测序可以确定病毒的基因序列，通过定量可以确定病毒的载量，即血液中病毒的数量。
6. 结果分析，最终，经过测序和定量分析后，可以得出HIV病
毒RNA的检测结果，判断被检测者是否感染了HIV病毒以及病毒的
数量。
总的来说，HIV RNA检测的原理是通过提取样本、分离核酸、
反转录、扩增和检测、测序和定量等步骤，最终得出病毒RNA的检
测结果。
这种检测方法可以快速、准确地确定感染者的病毒载量，
对于HIV感染的早期筛查和疾病监测具有重要意义。
HIV核酸检测技术及应用
The COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HIV-1 Qualitative Test, v2.0
Dual-PCR target Assay design
gag: • Targeted in previous Roche HIV-1 tests • Large sequence database from Roche’s Global
修改了艾滋病感染产妇所生儿童HIV感染早期感染检测流 程
初筛+复检+
补充试验（核酸试验）
HIV定性检测试剂盒
试剂：必须是经国家食品药品监督管理总局注册批准、 在有效期内的试剂。严格按说明书操作。全球目前正式 用于临床诊断HIV-1 急性期感染的核酸检测试剂比较少
Gen-Probe 公司生产的Aptima HIV-1 RNA 核酸定性 试剂盒
结果判读与报告
用于治疗效果和病程监测：检测值小于试剂盒线性范围下限，报告低于检测限， 检测值大于等于试剂盒线性范围下限，按照检测值报告。
用于HIV-1感染的诊断： ➢ 检测值>5000 CPs/ml(或IUs/ml)，报告检测值； ➢ 检测值≤5000 CPs/ml(或IUs/ml)，尽快再次严格按核酸检测的要求采样检测，
HIV RNA
HIV前病毒DNAHIV生活周期图
HIV感染的自然史
急性感染期 无症状期 艾滋病期
HIV感染后标志物变化时间
Reactivity
HIV RNA
p24 Ag
IgM AntiHIV
IgG Anti-HIV
012345678
Weeks post-infection
HIV核酸检测的意义
HIV病毒载量(Viral Load) 指体内复制的病毒的数量，反映体液
国内外核酸自动提取仪常见品牌分类及特点
中国医疗核酸检测行业自动化进程及国内外核酸自动提取仪常见品牌浅析国内在核酸检测方面的自动化进程尚且远远落后于美国日本等国，很多医院仍然在进行手动提取检测的模式。
因为大多数核酸检测的目的基因是HBV、HCV、HIV等传染性病毒，这种检测方法大大增加了一线操作人员的感染风险，且工作效率低下，无法完成大量样本的快速检测。
目前国内医疗资源紧张，很多病人都反映在医院看病难，速度慢，等待时间长，价格贵等等。
这和我国医疗机构的自动化进程普遍较低也有关系。
试想，一个熟练的核酸提取及检测人员每次仅能进行20~30个样本的提取检测，每次提取需要1~2个小时，面对数以千记的需要检测的病人，想要完成检验，要么需要很长的时间，要想缩短时间，就要大量增加人手，显然就会增加医疗成本。
要解决这些问题，推动国内医疗检测行业的自动化进程是非常有必要的。
要推进核酸检测类别的自动化进程，就需要引入自动化仪器，目前国内外很多仪器厂商都致力于生产开发改进核酸自动提取仪。
国外主流品牌有以下几个：贝克曼库尔特SPRI-TE作为小型化的自动提取，提供高质量，高效率，可重复的磁珠核酸提取，专门为小实验室设计。
Vidiera NsP则更倾向于血站，CDC，大型医院实验室等大客户。
贝克曼库尔特是提供和QIAGEN签约的extraction reagents，而且提取的核酸可以同LightCycler,* Cobas* Taqman* or 96-well Thermowell Plate等联用去做定量检测的结果。
产品性能：SPRI-TE自动化处理1-10个样品即开即用的试剂UV去除污染Vidiera NsP全自动样品提取96 样本提取需要2.5小时阳性样本追踪预制样本提取和用户定义样本提取雅培雅培m2000系统是由雅培加拿大公司研发成功的，旨在用于医学诊断实验室样品的自动提取，可以和m2000 rt联用。
目前可以应用的检测有RT HIV-1, RT HBV, RT HCV 和RT CT/NG。
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HIV核酸（RNA）提取（QIAGEN Viral RNA Mini Kit）
1.实验前准备
●取出样品恢复至室温（15－25℃），解冻待用。
●将AVE缓冲液恢复至室温，以备后续步骤使用。
●取大约1.5ml AVL缓冲液加入一管冻干的Carrier RNA中，待溶解完全后，转入
AVL缓冲液瓶中（一管Carrier RNA对应一管AVL31ml），分装到1.5ml eppendorf
管中，每管560ul，4℃保存。
AVL／CarrierRNA缓冲液4℃保存时会有沉淀，使用
前需37℃预热溶解沉淀。
注：不要将AVL／CarrierRNA缓冲液加热超过6次，每
次孵育不要超过5分钟。
●AW1和AW2缓冲液按照说明书上的量加入96－100％的乙醇，乙醇应无RNA酶（无
水乙醇）。
●所有离心步骤均在室温进行。
注意：使用无DNase和RNase的Tip头。
2.将560ul准备好的含有CarrierRNA的AVL缓冲液加入1.5ml离心管。
3.将140ul血浆加入盛有AVL／CarrierRNA缓冲液的离心管，振荡混匀15秒。
4.室温（15－25℃）孵育10分钟。
5.将1.5ml离心管短暂离心，消除管盖内的液滴。
6.加入560ul乙醇（96－100％），振荡混匀15秒。
振荡混匀后将离心管短暂离心，消除
管盖内的液滴。
7.将630ul步骤6中的溶液小心转入OIAamp RNA提取柱（放置于2ml收集管中），注意不
要碰湿柱子边缘。
盖上盖子，6000g(小离心机约8000转)离心1分钟，将柱子移入一新的2ml收集管（提供），丢弃剩有滤液的收集管。
8.小心打开柱子的盖子，重复步骤7。
9.小心打开柱子的盖子，加入500ul AW1液，盖上盖子，6000g(8000rpm)离心1分钟，将
柱子放入一新的2ml收集管，丢弃剩有滤液的收集管。
10.小心打开柱子的盖子，加入500ul AW2液，盖上盖子，全速（20000g or 14000rmp）离
心3分钟。
11.将柱子放入一新的1.5ml离心管（自备），丢弃剩有滤液的收集管。
小心打开柱子的盖
子,加入60ul已恢复室温的AVE缓冲液，盖上盖子，室温孵育5分钟后，6000g(8000rmp) 离心1分钟。
12.离心得到的洗脱液，即为RNA样本，注意：RNA样本易降解，需马上进行后续的RT－PCR
反应，如不能立即进行RT－PCR，可以放－20℃保存（一个月），长期保存可以放－80℃（半年）。