发酵工程课程设计酵母菌高密度发酵
高中生物发酵工程实验教案
高中生物发酵工程实验教案实验目的：1. 了解发酵工程的基本原理和应用。
2. 掌握发酵工程实验中的操作技能。
3. 熟悉实验室安全操作规范。
实验器材与试剂：1. 发酵罐2. 酵母菌培养基3. 酵母菌4. 厌氧罐5. 恒温槽6. 蒸馏水7. 酵母菌培养皿8. 培养皿针管9. 安全手套、护目镜实验步骤：1. 准备工作：洗手、穿戴实验室用具，准备好实验所需的器材和试剂。
2. 实验前操作：将酵母菌培养基均匀涂抹在培养皿上。
3. 发酵罐操作：将酵母菌埋在发酵罐里，放入恒温槽中，控制温度。
4. 培养皿操作：取一定量的酵母菌培养基，注入培养皿中，用培养皿针管均匀涂抹在培养皿上。
5. 结果观察：观察培养皿和发酵罐中酵母菌的生长情况，记录相关数据。
实验注意事项：1. 操作时注意个人安全，保持实验室清洁整洁。
2. 操作实验器材时要轻拿轻放，避免损坏。
3. 实验结束后，将实验器材清洁干净，妥善归还。
4. 发酵罐操作时要注意控制温度，避免温度过高或过低影响实验结果。
实验总结与讨论：1. 通过观察实验结果，分析酵母菌在不同条件下的生长情况。
2. 总结发酵工程实验中的关键操作技巧和注意事项。
3. 探讨发酵工程在生物工程领域中的应用及意义。
扩展实验：1. 可以尝试不同的酵母菌培养基，比较其对酵母菌生长的影响。
2. 可以调节发酵罐中的温度和湿度，观察其对酵母菌生长的影响。
3. 可以尝试使用其他微生物进行发酵实验，比较它们的生长情况。
以上为发酵工程实验的教案范本，教师可根据实际情况进行适当调整和完善。
酵母菌的高密度发酵
课程设计说明书课程名称：发酵工程设计题目：酵母菌的高密度发酵院系：生物与食品工程学院学生姓名：吴亚非学号：201006040051专业班级：10 生物技术指导教师：马瑞霞2013年5月26日课程设计任务书设计题目酵母菌的高密度发酵学生姓名吴亚非所在院系生物与食品工程学院专业、年级、班10级生物技术设计要求：1、设计题目选择要求紧扣发酵工程相关教学内容和生产实际。
2、要充分查阅相关背景资料，了解相关内容的前沿进展及存在问题。
3、设计说明书应字迹清楚文字通顺，并附有各项设计成果表，摘引其他书籍或杂志的材料必须注明出处。
4、实验方案要切合实际，严密合理6、设计结束后，以个人为单位提交设计说明书一份（后附流程图）。
学生应完成的工作：1、在老师的指导下确定设计题目。
2、学生查阅相关文献和资料制定实验路线，并有指导老师检查实验路线的合理性和可操作性。
3、学生在实验室完成既定方案。
4、完成课程设计说明书的初稿，经过指导老师的帮助修改，最后定稿。
参考文献阅读：[1]李寅等著，高细胞密度发酵技术[M]，化学工业出版社，2006-10-01，230-280[2]陈思如，萧熙佩酵母生物化学[M]，济南：山东科学技术出版社，1990年[ 3 ] ( 日) 山根恒夫( 周斌译) , 生化反应工程( 第二版)[M] , 西安: 西安大学出版社, 1992: 243[4]Craig. T.B. and Trotter S G Intern. Symp. SCP. A lgiers A lgoria, O ct, 1983:17-20[5]陈洪章，李佐虎，酵母菌的高密度发酵[J]，工业微生物，1998-28-1工作计划：2013.5.11分组并确认指导老师，在老师指导下查阅文献，确定题目。
2013.5.12----2013.5.13 进行理论试讲阶段，确定实验路线，然后确定实验方案。
2013.5.14----2013.5.17 进行实验操作和书写设计说明书。
酵母菌的高密度发酵
4.3防止乙醇的产生
早在巴斯德时代,人们已知道大量通风不产生乙醇,并且采 用了补料技术(1915年)。但由于酵母菌的乙醇发酵酶系是 组成酶,不受其他影响,而其呼吸酶系是阻遏酶系,受其他条 件影响较大。Crabtrec效应就是指在高糖浓度下,即使在 有氧条件下,使菌体由呼吸型向发酵型转变,也就是高速率 同化葡萄糖而引起的好氧呼吸的阻遏作用。一般产生乙 醇的条件是菌体比生长速率过高时,即使葡萄糖浓度保持 在较低水平,酵母菌仍可转化为发酵性代谢,从而使菌体产 量下降;或者供给糖量高于酵母菌所能同化的速率,即使供 氧充分,仍然产生乙醇。为了防止乙醇产生,一般采用保持 一定的比生长速率,采用补料技术,充分通风,使所产生的乙 醇为酵母菌再利用。近年来兴起的生物反应和分离耦合 技术在高密度发酵中的应用已取得了很大进展。乙醇作 为副产物被在位分离出去。 另外,对于CO2的有效去除, 主要考虑设备选型和操作技巧问题。而消泡剂的使用也 涉及到选型和操作技巧。
2.酵母菌在发酵工业方面的优势
首先,因为酵母菌生长繁殖快、代期短,生产
蛋白的速率为动植物所不能比拟 其次,酵母菌含有极丰富的蛋白质(45%至56%), 具有人体所必需的八种氨基酸和B族维生素,还 拥有丰富的酶系和多种经济价值很高的生理活 性物质。 第三,酵母菌生产不受季节、气候和地区的限 制 第四,酵母与其他微生物相比,具有易于收集, 代谢方式多样性,对环境的适应性较强和人们易 于接受等特性
酵母菌的高密度发酵
发酵工程 课程设计第四组
1.什么是高密度发酵
指培养液中工程菌的菌体浓度在50gDCW （菌体干重）/L以上，理论上的最高值可达 200gDCW/L的发酵方式。 高密度发酵可以提高发酵罐内的菌体密度， 提高产物的细胞水平量，相应的减少了生物 反应器（发酵罐）的体积，提高单位体积设 备的生产能力，降低生物量的分离费用，缩 短生产周期，从而达到降低生产成本，提高 生产效率的作用。
发酵工程课程设计酵母菌高密度发酵
我们选取的罐压为0.05Mpa.
CO2的影响
酵母生长过程中产生大量的CO2对细胞 具有直接的毒害作用，而且溶解于发酵 液中会导致pH值的下降。发酵液中的 CO2的溶解度达到7.04%就可抑制酵母 细胞的生长，高于4%则生长下降，一 般发酵液中的CO2的溶解度应控制在 1%~3%之间。
溶解氧（DO）的影响
DO是发酵工程中的一个关键限制因素，是高 细胞密度发酵过程中影响酵母生长的重要因 素之一。在高密度发酵的后期由于细胞密度 的扩增，耗氧量极大，发酵罐的各项物理参 数不能满足对氧的供给，造成DO下降，细胞 生长减慢。
溶解氧（DO）范围：40%<DO<60%.
增加发酵液中DO的方法
影响酵母高细胞密度发酵的因素
• 培养基的营养物质 • 溶解氧（DO） • 压力 • CO2 • 温度 • pH值 • 发酵液的流变学 • 接种量 • 生长抑制性物质
培养基的营养物质的影响
所需营养物质：水分、碳源物质、 氮源物质、无机元素、生长因子
培养基中的基质的种类和浓度直接影响到细胞的代 谢变化和产物的合成。在发酵前期，碳源和氮源的 浓度迅速下降，在中后期主要用于合成产物，其浓 度下降趋于平稳。碳源和氮源的比例偏小，会导致 细胞生长旺盛，提前衰老自溶；而其比例偏大，则 细胞繁殖数量少，代谢不平衡，不利于产物积累。
• 维生素：在1L溶液中含有维生素H0.05g， 泛酸钙1.0g，烟酸1.0g，肌醇25.0g,对氨基 苯甲酸0.2g，硫胺素1.0g，吡哆醇1.0g。
发酵工程大单元教学设计
发酵工程大单元教学设计
一、单元概述
发酵工程是生物工程的重要组成部分，涉及到微生物的分离、培养、发酵、提取和精制等多个环节。
本单元旨在通过系统的理论学习和实践操作，使学生掌握发酵工程的基本原理、技术和应用，为后续的课程学习和实际工作打下坚实的基础。
二、学习目标
掌握发酵工程的基本原理和技术；
了解发酵工程在工业生产和生活中的应用；
培养学生的实验操作能力、团队协作精神和创新意识。
三、教学内容与安排
发酵工程原理（4学时）
发酵的定义与分类
发酵微生物的种类与特点
发酵过程的基本组成与操作方式
发酵设备与操作（6学时）
发酵设备的类型与结构
发酵设备的操作与维护
发酵设备的安全与环保要求
发酵工艺优化（4学时）
发酵条件的控制与优化
菌种选育与改良技术
代谢产物的形成与调控
实际应用与案例分析（4学时）
工业发酵生产流程与技术要点
生物制药与酶制剂的生产与应用
食品发酵与酿造技术
实验与实践（6学时）
实验操作技能培训
发酵实验设计与实施
参观企业生产现场，了解实际操作流程
四、教学方法与要求
采用多媒体教学、案例分析、实验操作等多种教学方法；
加强实验教学与实践操作，培养学生的实际操作能力和创新思维；
注重课堂互动，鼓励学生提问和讨论，提高学生的学习积极性和主动性；
对学生的实验报告和课堂表现进行综合评价，建立完善的考核机制。
一种酿酒酵母高密度发酵培养的方法
一种酿酒酵母高密度发酵培养的方法
一种酿酒酵母高密度发酵培养的方法是采用分批喂养法，即在培养前期采用较小的发酵罐进行预培养，待酵母菌体生长达到一定程度后再转移到大型发酵罐进行高密度发酵。
具体步骤如下：
1. 选取适宜的培养基。
酿酒酵母适宜生长的培养基为含有葡萄糖、酵母粉等营养物质的液体培养基。
2. 酵母菌体的预培养。
将适量的酵母菌体接入小型发酵罐中，进行预培养。
此时，控制好温度、氧气供应量等条件，使酵母菌体得到良好的生长。
3. 转入大型发酵罐进行发酵。
在酵母菌体生长到一定程度时（一般为菌体生长至罐体积的1/3~1/2时），将其转入大型发酵罐中进行高密度发酵。
在发酵过程中，要不断调整pH值、温度、氧气供应量等因素，以保证发酵过程的顺利进行。
4. 酵母菌体分离和提取。
在发酵完成后，采用离心等方法将酵母菌体分离出来，然后进行干燥处理或者进一步提取。
通过采用分批喂养法进行高密度发酵，可以有效地控制发酵过程中的环境参数，促进菌体的快速生长和繁殖，从而提高酵母的发酵效率和产量。
发酵工程实验方案的设计
发酵工程实验方案的设计本实验的目的是通过发酵工程实验，探讨在不同条件下发酵过程对产物的影响，优化发酵参数以提高产物的质量和数量。
实验材料：1. 酵母菌2. 发酵罐3. 发酵培养基4. pH计5. 温度控制设备6. 搅拌器7. 无菌操作台8. 实验室常规设备实验步骤：1. 准备工作确保所有材料和设备都已清洁消毒，并在无菌操作台上进行操作。
2. 发酵罐的准备将发酵罐进行清洁消毒，并加入适量的发酵培养基。
根据实验设计的要求，可以调节发酵培养基的pH值和温度。
3. 加入酵母菌将事先培养好的酵母菌接种到发酵罐中，确保接种量合适。
4. 发酵过程控制在发酵过程中，通过监测pH值和温度，以及调节搅拌速度，控制发酵过程的条件。
5. 样品检测在不同时间点，取样品进行检测，包括产物的数量和质量，以及培养基中的营养成分的消耗情况等。
6. 数据统计和分析对实验数据进行统计和分析，探讨不同发酵条件对产物的影响，寻找最优的发酵参数。
实验设计：1. 不同初始pH值对酵母菌发酵产物的影响分别设置初始pH值在不同条件下的实验组，通过检测不同时间点的产物浓度，探讨不同初始pH值对酵母菌发酵产物的影响。
2. 不同温度条件下的发酵实验设置不同温度下的发酵实验组，通过检测不同温度条件下产物的产量和质量，探讨温度对发酵产物的影响。
3. 不同搅拌速度对发酵的影响在相同的pH值和温度条件下，设置不同搅拌速度的实验组，通过检测产物的质量和数量，探讨搅拌速度对发酵的影响。
实验结果和讨论：1. 不同初始pH值对酵母菌发酵产物的影响实验结果表明，初始pH值对酵母菌发酵产物有明显影响。
在中性条件下，产物的产量和质量较高，而在酸性和碱性条件下，产物的产量显著减少。
2. 不同温度条件下的发酵实验实验结果表明，较低的温度条件下，产物的产量较低，但质量较好；较高的温度条件下，产物的产量较高，但质量有所下降。
3. 不同搅拌速度对发酵的影响实验结果表明，在较低的搅拌速度下，产物的产量较低，但质量较好；在较高的搅拌速度下，产物的产量较高，但质量略有下降。
酵母工程菌细胞高密度发酵的研究进展
用分子生物学技术将编码外源蛋白或多肽的基因引入酵母菌，构建重组酵母工程菌表达抗原或细胞因子等，用于制备相应的生物制品，是研究开发新生物制品的重要趋势之一。
20世纪80年代，默克和史克公司用重组酿酒酵母菌（Saccharomyces cere －visiae ）表达的乙型肝炎表面抗原（HBsAg ）制备乙型肝炎疫苗，是最早用重组酵母制备生物制品的成功范例。
现已用重组酵母工程菌制备乙型肝炎疫苗、HPV 疫苗、人血清白蛋白（HSA ）和细胞因子；近年来，用重组酵母工程菌，特别是甲醇营养型酵母工程菌高效表达外源蛋白或多肽已成为相关研究的热点之一。
用甲醇营养型酵母，主要是汉逊酵母（Hanse-nula polymorpha ）和毕赤酵母（Pichia postoris ）已实现了HBsAg 、HPV -VLP 、戊型肝炎病毒（HEV ）ORF2、sHSA 、水蛭素及多种细胞因子等的高表达。
由于装备技术与成本的限制及生物制品生产中对制品批次质量控制要求的综合考虑等，用于酵母工程菌培养的生产发酵罐容积一般小于1000L （葛兰素维康制备乙型肝炎疫苗的发酵罐容积为1500L ）。
在保持外源蛋白或多肽表达水平不降低的前提下，在容积有限的发酵罐中实现酵母工程菌的高密度发酵，是维持制品生产规模和控制成本的重要技术途径。
影响酵母细胞高密度发酵的主要因素有工程菌本身的生物学特性和发酵工艺特点、培养基种类与配方、发酵罐的结构和性能、发酵过程各项重要工艺参数或变量的控制等。
重要工艺参数或变量包括溶氧、pH 值、温度、培养基营养成分补料、压力、搅拌转速、通气流量、CO 2、有害代谢产物积累和发酵液流变学性质等。
培养基中甲醇含量、其消耗与补充流量的控制，是影响甲醇营养型酵母工程菌培养后期去阻遏和表达外源蛋白或多肽的表达效率的关键因素。
在确保工程菌表达产率不变和表达产物性质稳定的前提下，将众多因素及其相互影响整合优化为一项发酵工艺，实现酵母工程菌细胞的高密度发酵，是一项复杂的、综合性很强的研发工作；在实现酵母工程菌高密度发酵的同时，提高表达产物的产率和活性则更具挑战性，国内外学者及企业为实现上述目标进行了大量研究。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
pH值的影响
在发酵过程中，pH值的变化取决于所用的菌种、 培养基和培养条件。如果pH值的波动导致其偏理 了细胞所需的最适范围，将会引起各种酶活力的 改变，影响细胞代谢。酵母细胞利用酵母细胞利 用葡萄糖产酸产气，发酵时产生的有机酸（主要 是乙酸）可导致发酵液的pH值降低。另外细胞释 放的CO2也会导致pH的降低。
1.提高机械搅拌速率 适当提高搅拌转速，增加气液接触面积，有利于 氧的传递，但搅拌速率过大会使发酵泡沫过多， 反而会导致DO降低。 2. 增大空气流量 空气流量的增大减小了氧传质工程中的气膜阻力， 有利于氧的传递吸收。但过大的流量会形成“过 载”现象，使大量发酵液蒸发，引起浓缩和粘度 上升。
压力的影响
啤酒酵母的高密度发酵
生物与食品工程学院 Xxxxxx
xxxxxxxxx
组员
酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） 是发酵工业最常用的菌种之一
在发酵中如果单方面提高发酵 液中的碳源含量，酵母菌就会 生成乙醇或乙酸，但其生物量 则有所下降；如果将碳源保持 在最低水平，就会限制酵母的 生长。而利用分批补料发酵的 方式，既可以满足高密度 发酵 时酵母细胞对营养源的大量需 求，又能减少生长抑制物质的 产生。
啤酒酵母的最适PH4.5~5.0.我们发酵用PH=5.0 调节PH用氨水或者硫酸铵，可以视情况随同补料一 块添加
接种量的影响
• 接种量是指移入的种子液和培养液体 积的比例，它的大小决定了菌种在发 酵罐中的生长速度。过多过少都不好， 在一定范围内增加接种量有利于菌体 的生长。因此，接种应根据实际情况 确定接种量。
培养基汇总
种子培养基：蔗糖25g/L，尿素3g/L，KH2PO4
10g/L,MgSO4 2.5g/L,微量元素10 ml/L，维生素液
15ml/L，pH 5.0
发酵培养基：（NH4）2SO4 15g/L，KH2PO4 8.0g/L，
溶解氧（DO）的影响
DO是发酵工程中的一个关键限制因素，是高 细胞密度发酵过程中影响酵母生长的重要因 素之一。在高密度发酵的后期由于细胞密度 的扩增，耗氧量极大，发酵罐的各项物理参 数不能满足对氧的供给，造成DO下降，细胞 生长减慢。
溶解氧（DO）范围：40%<DO<60%.
增加发酵液中DO的方法
在高细胞密度发酵过程中，如果葡萄糖浓度 超过其一阈值，碳源供给量高于酵母所能同 化的速率，即使是在供氧充足的条件下也会
发生克拉布特里（Crabtree）效应而产生乙
醇，而糖的有氧氧化受到抑制，这是对发酵 不利的。所以要对营养物的配比进行优化
解决途径：在实际发酵中，基质 浓度和碳源氮源比例主要依靠流 加补料来实现和维持。（碳氮比、 流加量、流加频率）
ZnSO4 0.4g/L.
流加培养基：KH2PO4 9.0g/L,MgSO4 2.5g/L,K2SO4 3.5g/L,NaSO4 0.28g/L,蔗糖500g/L（流加补料，用于 维持高比生长速率或者高产物生产速率）
微量元素配方和维生素配方
• 微量元素:在1L溶液中含有EDTA15g，
znso45.75g,Mncl20.32g,Cuso40.50g,C ocl20.47g,Na2MoO40.48g,Cacl22.9g,F eso42.8g,121℃湿热灭菌20min待用。
我们用的培养基类型
种子培养基：蔗糖25g/L，尿素3g/L，KH2PO4
10g/L,MgSO4 2.5g/L,微量元素10 ml/L，维生素液
15ml/L，pH 5.0（供发酵前菌体大量生长繁殖）
发酵培养基：（NH4）2SO4 15g/L，KH2PO4 8.0g/L，
MgSO4 3.0g/L,微量元素液 10 ml/L，消泡剂 0.3ml/L，
在常见的小型发酵罐中接种量范围在 5%~10%。我们取最大接种量10%
后期补料量及参数
• 发酵开始是为分 批发酵，当作为 碳源的蔗糖耗尽 后，表现为DO的 突然升高和CO2 产生量、O2消耗 量的突然上升， 这时开始流加培 养。
生产条件总汇
• 接种量：10% • 温度：30℃ • PH：5.0 • DO溶解度：40%~60% • 罐压：0.05Mpa • CO2溶解度：1%~3% • 转速：300rpm~600rpm • 调节PH：氨水或者硫酸铵 • 补料时间：有待观察（2~4h左右） • 通气量：50~100L/h
• 维生素：在1L溶液中含有维生素H0.05g， 泛酸钙1.0g，烟酸1.0g，肌醇25.0g,对氨基 苯甲酸0.2g，硫胺素1.0g，吡哆醇1.0g。
培养基配制注意事项
1.碳源与氮源分开灭菌，防止“美 拉德反应”产生有毒物质抑制菌体 生长； 2.蔗糖要单独灭菌后加入，尿素和 维生素液通过微孔滤膜过滤除菌后 加入； 3.为防止焦糖化反应，将碳水化合 物pH调至低于4.0灭菌
影响酵母高细胞密度发酵的因素
• 培养基的营养物质 • 溶解氧（DO） • 压力 • CO2 • 温度 • pH值 • 发酵液的流变学 • 接种量 • 生长抑制性物质
培养基的营养物质的影响
所需营养物质：水分、碳源物质、 氮源物质、无机元素、的代 谢变化和产物的合成。在发酵前期，碳源和氮源的 浓度迅速下降，在中后期主要用于合成产物，其浓 度下降趋于平稳。碳源和氮源的比例偏小，会导致 细胞生长旺盛，提前衰老自溶；而其比例偏大，则 细胞繁殖数量少，代谢不平衡，不利于产物积累。
在发酵工程中必须保持罐压为正压，如果 罐压为0或者负压，则会造成细胞的染菌， 甚至造成整罐发酵液的废气。罐压增高能 适度增加氧在发酵液中的溶解度，但二氧 化碳在水中的溶解度要比氧大30倍，溶解 过多的二氧化碳会造成细胞染菌，所以罐 压也不能太高。
我们选取的罐压为0.05Mpa.
CO2的影响
酵母生长过程中产生大量的CO2对细胞 具有直接的毒害作用，而且溶解于发酵 液中会导致pH值的下降。发酵液中的 CO2的溶解度达到7.04%就可抑制酵母 细胞的生长，高于4%则生长下降，一 般发酵液中的CO2的溶解度应控制在 1%~3%之间。