基因治疗的概念
原位基因治疗名词解释
原位基因治疗名词解释
原位基因治疗是一种基因治疗方法，旨在通过直接将治疗基因
传递到患者体内的受影响细胞中来治疗遗传性疾病和其他疾病。
这
种治疗方法与传统的基因治疗方法不同，传统方法通常涉及在体外
修饰细胞，然后将其重新植入患者体内。
而原位基因治疗则是在患
者体内直接传递治疗基因，使其在受影响的组织或细胞中发挥作用。
原位基因治疗的过程通常包括以下步骤，首先，治疗基因会被
载体（如病毒或质粒）传递到患者的细胞中。
然后，这些治疗基因
会在细胞内表达，并产生所需的蛋白质或调节信号通路，从而治疗
疾病。
这种方法的优势在于，它可以直接针对患者体内的受影响细
胞进行治疗，避免了涉及体外细胞操作的复杂性和风险。
原位基因治疗在遗传性疾病、癌症和其他疾病的治疗中显示出
潜在的益处。
然而，它也面临着一些挑战，如治疗基因的传递效率、安全性和长期效果的问题。
此外，研究人员还在努力克服免疫反应
和治疗基因在体内稳定性等方面的挑战。
总的来说，原位基因治疗是一种有潜力的基因治疗方法，它可
以直接针对患者体内的受影响细胞进行治疗，为治疗一些目前难以
治愈的疾病提供了新的可能性。
随着技术的不断进步和对其安全性和有效性的深入研究，原位基因治疗有望成为未来医学领域的重要治疗手段之一。
基因治疗基本知识
抑癌基因疗法
抑癌基因：是正常细胞内正常存在的，能抑 制细胞转化和肿瘤发生的一类基因群。 Rb基因，p53基因，MTS基因，nm23基因
p53基因治疗研究：
（1）野生型p53基因的替代疗法 （2）突变型p53基因的阻断疗法 （3）与p53基因有关的新型肿瘤疫苗
反义核酸
1. 反义RNA（antisense RNA）：与mRNA 互补的RNA，抑制mRNA的加工与翻译。
基因治疗
基因工程研究所 宋艳斌
传统治疗方法
1. 药物治疗 2. 手术治疗 3. 放射治疗 4. 理疗 新的生物治疗： 基因治疗 (gene therapy)
基因治疗
一、概念 二、种类和策略 三、基本流程 四、应用与展望
一、基因治疗的概念
• Gene therapy is a medical intervention based on modification of genetic materials in living cells.
• 该基因表达产生的酶可催化无毒性的药物前体转变为 细胞毒性物质，从而杀死肿瘤细胞；
• 同时通过“旁观者效应”（bystander effect）杀死邻近 未导入该基因的分裂细胞而显著扩大杀伤效应。
• 由于携带该基因的受体细胞本身也被杀死，所以这类 基因被称为“自杀基因”。
自杀基因
• 单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-TK）基因 编 码 胸 苷 激 酶 （ TK ） 催 化 丙 氧 鸟 苷 （ganciclovir, GCV）成为磷酸化的核苷酸类似 物，阻断DNA的合成而使细胞死亡。
2.体细胞基因治疗： 研究重点
体细胞治疗的概念
• 指应用人的自体、同种异体或异种（非人体） 的体细胞；
基因治疗
与安全性相联系的就是生殖细胞基因治疗。虽然在人类尚未实施，但在动物实验已获成功，这就是转基因的 动物出现。这一事实既给人类生殖细胞基因治疗带来了希望，同时也使人们耽心这种遗传特征的变化世代相传， 将给人类带来的是福还是祸。
概念
狭义概念
广义概念
狭义概念
指用具有正常功能的基因置换或增补患者体内有缺陷的基因，因而达到治疗疾病的目的。
广义概念
基因治疗指把某些遗传物质转移到患者体内，使其在体内表达，最终达到治疗某种疾病的方法。
主要分类
按靶细胞
按基因操作
给药途径
按基因操作
基因治疗一类为基因修正（gene correction）和基因置换（gene replacement），即将缺陷基因的异常序 列进行矫正，对缺陷基因精确地原位修复，不涉及基因组的其他任何改变。通过同源重组（homologous recombination）即基因打靶（gene targetting）技术将外源正常的基因在特定的部位进行重组，从而使缺陷基 因在原位特异性修复。另一类为基因增强（gene augmentation）和基因失活（gene inactivation），是不去除 异常基因，而通过导入外源基因使其表达正常产物，从而补偿缺陷基因等的功能；或特异封闭某些基因的翻译或 转录，以达到抑制某些异常基因表达。
①ex vivo途径：这是指将含外源基因的载体在体外导入人体自身或异体细胞（或异种细胞），经体外细胞 扩增后，输回人体。ex vivo基因转移途径比较经典、安全，而且效果较易控制，但是步骤多、技术复杂、难度大， 不容易推广；
②in vivo途径：这是将外源基因装配于特定的真核细胞表达载体，直接导入体内。这种载体可以是病毒型或 非病毒性，甚至是裸DNA。in vivo基因转移途径操作简便，容易推广，但尚未成熟，存在疗效持续时间短，免疫 排斥及安全性等一系列问题。
基因药物与基因治疗
2.社会和伦理问题 基因诊断和治疗技术是未来医学 中的主流技术, 基因诊断中的道德问 题包括基因取舍、基因歧视、基因 隐私等;基因治疗中的道德问题包括 基因设计、基因改造等。基因诊断 和治疗要坚持的道德原则有人类尊 严与平等原则、知情同意原则、科 学性原则、优后原则和治病救人原 则等。
3.目前基因治疗所面临的问题 目前尚存在很多根本性的问题： 许多基因缺陷病的早期诊断还有困 难;缺乏对靶细胞定向导入基因的技 术;基因治疗载体的安全性和有效性 问题;导入基因的表达和调控问题;发 现新的治疗基因，尤其是对疾病相 关基因还不十分清楚的肿瘤基因治 疗。
靶向治疗，是在细胞分子水平 上，针对已经明确的致癌位点来设 计相应的治疗药物，药物进入体内 会特异地选择致癌位点来相结合发 生作用，使肿瘤细胞特异性死亡， 而不会波及肿瘤周围的正常组织细 胞，所以分子靶向治疗又被称为 “生物导弹”。
靶向药物的治疗方法称为“靶 向治疗”（targeted therapy）。靶向药 物是针对肿瘤基因开发的，它能够 识别肿瘤细胞上由肿瘤细胞特有的 基因所决定的特征性位点，通过与 之结合，阻断肿瘤细胞内控制细胞 生长、增殖的信号传导通路，从而 杀灭肿瘤细胞、阻止其增殖。
（三）目的基因表达水平的调控
基因选择性表达水平主要通过以 VP16为基础的转录激活系统来放大组 织特异性启动子的作用，是以组织 特异性启动子只带一个嵌合转录因 子的表达，它与启动子上相应的 DNA结合位点结合，通过VP16激活启 动子进行目的基因的转录。
五靶向治疗（targeted therapy）
（2）in vivo法，称为活体直接转移， 即通过在体将目的基因直接转入靶 细胞、组织，使其在体内表达。
三、基因转移的技术
基因转移需要借助于载体，因此， 应用于基因治疗的基因载体主要有： 1）病毒载体 2）非病毒载体
基因治疗
基因矫正、基因置换、基因失活、基因修饰
从临床治疗角度，目前肿瘤基因基因治疗的策略
直接杀伤肿瘤细胞或抑制其生长； 增强机体免疫系统，间接杀伤或抑制肿瘤胞； 改善肿瘤常规治疗方法，提高疗效；
肿瘤基因治疗常用方法
基因干预技术 反义RNA技术：①封闭异常表达的癌基因； ② 作用癌基因的易位和重排部位；⑶抑制肿瘤细胞 的耐药性，提高化疗效果。 RNA干扰技术：用于阻断、抑制癌基因异常表 达的恶性肿瘤治疗。 反义基因技术：设计原癌基因启动子的竞争剂， 从而抑制原癌基因转录。
遗传病的基因治疗研究
人类遗传病4000多种，发病率为40-50%， 必须符合以下要求的遗传病才可考虑开展 基因治疗研究：（30余种） 在DNA水平上明确其发病原因及机制； 单基因遗传病，而且属隐形遗传； 该基因的表达不需要精确调控； 该基因能在一种便于临床操作的组织细胞 中表达并发挥其生理作用； 该遗传病不经治疗将有严重后果。
基因转移的生物学与非生物学方法
生物学方法：以病毒载体作为转移系统
逆转录病毒基因组经过改造后作为载体 ( retrovirus vector) 腺病毒(adenovirus,AV)基因组可作为载体携带治疗基因
腺病毒相关病毒（adenovirus associated virus, AAV)载体适合治疗基因的稳定长效表达。
几种已经或可望在临床进行基因治疗的 人类单基因遗传病
腺苷脱氨酶(ADA)和嘌呤核苷磷酸化酶（PNP) 缺乏症； 血友病：针对凝血因子Ⅸ基因； 中国科学家1991年12月成功进行了血友病B的基因 治疗。 将携带凝血因子Ⅸ基因的巨细胞病毒载体导入患者 自身皮肤的成纤维细胞—— 经体外培养---再植入患者皮下----患者血浆中凝血因子Ⅸ浓度 上升，凝血活性改善。
基因治疗的新进展
基因治疗的新进展基因治疗是一种针对基因缺陷性疾病的治疗方法，通过修复或替换患者体内存在的异常基因，达到治疗目的。
近年来，基因治疗在医学领域中越来越受到关注和重视，也在不断的获得新的进展和突破。
一、基因治疗的历史基因治疗的概念最早可以追溯到20世纪60年代，但是当时由于技术水平、治疗安全等方面的原因，一直没有实现应用。
直到20世纪90年代，随着研究者基因工程技术的不断发展，基因治疗才逐渐推进到实践阶段。
但是，在初期试验中也一度遭遇了多次失败，甚至有患者因基因治疗导致严重不良反应或者死亡。
这也造成了人们对基因治疗的质疑和谨慎态度，使得基因治疗的进展相对缓慢。
二、基因治疗的新进展1. CRISPR/Cas9基因编辑技术CRISPR/Cas9是近年来发展速度最快的基因编辑技术。
利用这种技术，科学家们可以指定特定的DNA序列进行切割、更改或添加等操作，从而精确定位、修改特定基因，可以有效地治疗基因缺陷性疾病。
例如去年，科学家通过CRISPR/Cas9基因编辑技术成功地治愈了一名先天性失聪的病人。
这突破为其他基因缺陷性疾病的治疗提供了新的思路和希望。
2. 肤质干细胞基因治疗技术在2017年底，一项让全球关注的“加7厘米”基因治疗成功完成临床试验。
该项临床试验的对象是男性胎儿发育不良综合症患者，通过皮肤里的干细胞，再通过基因技术将所需的正常基因修复到干细胞中，再将处理后的干细胞移植到患者身体部位中，能让身体的一个部位增长7厘米以上。
这种技术成功为极端矮小症患者提供了帮助，也为其他基因缺陷性疾病的治疗提供了指导。
3. 疾病早期基因诊断和治疗随着基因测序技术的不断发展，我们可以更快速、准确地了解患者的基因信息，进而对基因缺陷性疾病进行预测和防范。
该技术在疾病早期诊断和治疗上有着广泛的应用前景。
例如2019年，我国科学家成功地利用二代测序技术开发出一种快速准确的新型男性不育基因筛查方法。
这项技术无需在人体内进行，只要通过外周血液样本便能得出生殖能力的预测结果，从而更好的进行预测性干预。
基因治疗基础
定向干细胞 (造血祖细胞, HPC)
红系祖细胞 巨核系祖细胞 单核系祖细胞
成熟的终末细胞
ABioCell
(1). 造血干/祖细胞(HS/PC)
优点:
1）具有可移植性和自我更新能力，在体内永不耗竭， 只需单次治疗；
2）具有多能性，可分化为粒、红、淋巴和血小板等 各种血细胞，且在分化过程中保持基因组的相对稳定， 使目的基因随细胞的分化成熟而相对扩增，病人可终身 受益；
ABioCell
2.成体细胞及组织
成纤维细胞 肌细胞 淋巴细胞 血管内皮细胞 皮肤组织 眼组织和神经组织
ABioCell
2.1 成纤维细胞
优点：易获得和在体外培养；方便进行遗传修饰；容易 移植回体内，必要时还可将已植入的细胞重新移走，使 其介导的基因治疗终止。已有多种细胞因子基因治疗在 小鼠上试验成效，使小鼠对肿瘤的免疫功能明显增强。
(2). 肿瘤浸润淋巴细胞（tumor infiltrating lymphocyte，TIL） 主要获自实体瘤组织或癌性胸水、腹水等，具有肿 瘤病灶趋向性。 在IL-2的刺激下，从肿瘤组织分离的TIL体外培养能 大量扩增，存活时间可超过100天，回输到体内后能 聚集于病灶部发挥抗肿瘤作用而对机体不构成威胁， 因而是较为理想的靶细胞。
ABioCell
2.5 皮肤组织
最容易大面积接近的组织，质粒裸DNA可直接注入， 或经颗粒轰击（基因枪）而导入。外源基因的表达产 物可产生全身性影响。
针刺介导的基因转移（puncture-mediated gene transfer）可进行较大面积的体细胞基因治疗。
潜在临床应用范围： 1. 导入DNA疫苗, 诱导机体的保护性免疫。 2. 转入免疫增强基因 (immune-enhancing gene) 或
病毒载体与基因治疗
根据基因导入的靶细胞分为两种：
1.生殖细胞基因治疗
生殖生物学问题复杂 伦理学问题 禁止应用人体
2. 设计和制备方便 体外转录获得
3. 能直接作用于一些RNA病毒
RNA干扰技术
概念：短的双链RNA (dsRNA) 导入细胞，可以使同源mRNA 发生特异性的降解，从而阻断 相应基因的表达。
❖ 高度的序列专一性 ❖ 高效性 ❖ 易操作性
(二) 间接策略
导入与致病基因无直接联系的治疗基因
1. 免疫基因治疗 2. 分子化疗 3. 特异性细胞杀伤
受体介导的反义RNA转移
❖ 脱唾液酸糖蛋白（ASGP）受体介导的转移，通过化学 物质作为中间连接物，将ASGP与多聚赖氨酸（PL）共 价结合，得到ASGP-PL复合物，这种复合物可以携带 RNA，再专一性地被肝细胞表面的ASGP受体所识别， 并被吞噬到肝细胞内发挥作用。
反义RNA应用前景
1. 安全性高 不改变基因结构，最终在细胞内被降解。
筛选等。
逆转录病毒载体的特点
1. env编码的糖蛋白结合细胞膜上的特异性受 体，基因转移效率更高；
2. 结构基因gag、env、pol的缺失不影响其他 部分的活性；
3. 整合到靶细胞基因组，可长期表达； 4. 包装好的假病毒颗粒分泌至包装细胞的培养
上清中，易于分离制备。
问题
1. 靶细胞DNA合成必须很活跃，因为病毒感 染和整合作用均依赖靶细胞DNA的复制；
3. 基因增强（gene augmentation）
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基因治疗的概念
基于修饰活细胞遗传物质而进行的医学干预。
细胞可以体外修饰，随后再注入患者体内；或将基因治疗产品直接注入患者体内，使细胞内发生遗传学改变。
这种遗传操纵的目的可能会预防、治疗、治愈、诊断或缓解人类疾病。
基因治疗的类型
根据目的
基因治疗：治疗或预防疾病
基因增强：增强人的性状和能力
根据干预对象
体细胞：基因转入体细胞内
生殖细胞：基因转入生殖细胞或早期胚胎。
体细胞基因治疗、生殖细胞基因治疗、
体细胞基因增强、生殖细胞基因增强
治疗简要过程
1. 体外法(ex vivo)：患者细胞经体外遗传处理后，再移入患者体内进行治疗。
2. 体内法(in vivo)：把基因通过载体（如病毒）直接转入患者病患部位，进行治疗。
3. 基因治疗使用的载体
（1）病毒
1.1 反转录病毒：RNA病毒，其基因可整入受体基因组
1.2 腺病毒：双链DNA病毒，形成核外DNA，不遗传，需多次施用
1.3 腺相关病毒：单链DNA病毒，可近100%插入19号染色体的特殊位点。
感染人和灵长类，不致病，宿主免疫原性小。
携带DNA小，难以制造
1.4 病毒壳蛋白形成的假病毒：“魔法子弹”
（2）非病毒载体：易于制造、低免疫，但感染和表达少
2.1 裸DNA ：表达效率低；电转移和基因枪转移
2.2 多核苷酸：合成的小分子核酸，使体内基因的表达失活
2.3 脂质体和多聚体：用脂质体和多聚体分子包裹DNA，使DNA被细胞吞入，提高转移效率
（3）复合方法：如脂质体加病毒
（4 ）多晶体：含有核酸（DNA、RNA）的多晶体可以增强基因的转移效率、毒性小
用腺病毒进行基因治疗
Fragile-X 的基因治疗
癌症的基因治疗
基因在癌细胞中表达，引起癌细胞凋亡，从而达到治杀死癌细胞，治愈癌症的目的。
今又生Ad-p53腺病毒注射液
小分子核酸的抑制基因表达和治疗的机制
从DNA到蛋白质，小分子核酸进入细胞后剪切mRNA使基因不能翻译
基因治疗的策略与关键步骤
基因治疗是用具有正常功能的基因去置换或增补患者体内有缺陷的基因，从而达到治疗疾病的目的。
（一）基因治疗的策略
基因治疗分为直接基因治疗和间接基因治疗，其中直接基因治疗为纠正突变基因，在原位修复缺陷的基因，以达到治疗目的。
为较理想的基因治疗策略，由于存在某些问题，目前正在努力之中；间接基因治疗为以正常的基因替代致病基因。
导入外源正常基因，代替有缺陷的基因。
而对靶细胞而言，没有去除或修复有缺陷的基因。
用DNA重组技术设法修复患者细胞中有缺陷的基因，使细胞恢复正常功能而达到治疗遗传病的目的。
具体可分为以下几种策略：
1、基因矫正：对于致病基因中的异常碱基进行精确修复，使其恢复正常功能。
2、基因置换：基因置换就是用正常的基因原位替换病变细胞内的致病基因，使细胞内的DNA 完全恢复正常状态。
这种治疗方法最为理想，但目前由于技术原因尚难达到。
3、基因修复：基因修复是指将致病基因的突变碱基序列纠正，而正常部分予以保留。
这种基因治疗方式最后也能使致病基因得到完全恢复，操作上要求高，实践中有一定难度。
4、基因修饰又称基因增补，将目的基因导入病变细胞或其它细胞，目的基因的表达产物能修饰缺陷细胞的功能或使原有的某些功能得以加强。
在这种治疗方法中，缺陷基因仍然存在于细胞内，目前基因治疗多采用这种方式。
如将组织型纤溶酶原激活剂的基因导入血管内皮细胞并得以表达后，防止经皮冠状动脉成形术诱发的血检形成。
5、基因失活：利用反义技术能特异地封闭基因表达特性，抑制一些有害基因的表达，已达到治疗疾病的目的。
如利用反义RNA、核酶或肽核酸等抑制一些癌基因的表达，
抑制肿瘤细胞的增殖，诱导肿瘤细胞的分化。
用此技术还可封闭肿瘤细胞的耐药基因的表达，增加化疗效果。
6、免疫调节：将抗体、抗原或细胞因子的基因导入疾人体内，改变病人免疫状态，
达到预防和治疗疾病的目的。
如将白细胞介素-2导入肿瘤病人体内，提高病人IL-2的水平，激活体内免疫系统的抗肿瘤活性，达到防治肿瘤复发的目的。
7、耐药基因治疗：在肿瘤化疗过程中，把产生抗药物毒性的基因导入患者体内，从而使患者能耐受更大剂量的化疗。
（二）基因治疗的策关键步骤
1、治疗性基因的获得：在了解疾病发生的分子机制基础上，选择对疾病有治疗作用的特定基因。
如，对单基因缺陷遗传病，可用野生型（非突变）基因即可用于治疗；对于肿瘤，最好选择某些与该类肿瘤密切相关的癌基因或抑癌基因用于基因治疗。
治疗性基因获得的方法
很多：用酶切或探针杂交法从基因组DNA文库获得，从cDNA文库获取，PCR扩增，人工合成等。
2、基因载体的选择：基因治疗关键步骤之一，是将治疗基因高效转移入患者体内、并能调控其适度表达。
常用的载体有两类：病毒载体和非病毒载体。
病毒载体：逆转录病毒载体，腺病毒载体，腺相关病毒载体等；非病毒载体：与病毒载体的主要区别在于：采用理化方法将治疗基因转移入患者体内。
3、靶细胞的选择：基因治疗的受体细胞有生殖细胞和体细胞两大类。
对生殖细胞进行基因治疗，可使该生殖细胞分化发育成长的个体及其后代均具有正常基因，理论上讲是根治遗传病的理想方法。
但由于涉及安全性和伦理学问题，目前基因治疗中禁止使用生殖细胞作为靶细胞，只限于使用体细胞。
基因治疗存在的困难
基因导入系统尚不成熟。
结构不稳定，影响基因组功能，基因难以到达靶细胞，等等
对多基因遗传病的致病基因及基因间的相互作用还不清楚
到达靶细胞盲目性大，表达可控性差，有激活致癌基因产生新病毒的潜在危险
无法保障干预生殖细胞基因不对后代产生医源性伤害。