盾叶薯蓣悬浮培养细胞生长及薯蓣皂苷元合成

第6卷第2期2008年3月生物加工过程Chinese Journal of B iop r ocess Enginee ringMa r .200843　盾叶薯蓣悬浮培养细胞生长及薯蓣皂苷元合成袁丽红,周海霞,于　潇,欧阳平凯3(南京工业大学　制药与生命科学学院,南京　210009)摘　要:研究了盾叶薯蓣细胞悬浮培养过程中细胞生长、薯蓣皂苷元合成、蔗糖和磷酸盐的吸收利用以及酸性磷酸酶活性与薯蓣皂苷元合成的关系。

结果表明,对数生长期细胞最大比生长速率μm 为0119d -1;倍增时间为3168d;薯蓣皂苷元的形成与细胞的生长相关,培养6d 时薯蓣皂苷元质量分数和产量分别为0120%和25193mg /L;蔗糖利用率达到95165%,磷酸盐吸收率达到最大,为90136%。

盾叶薯蓣细胞悬浮培养过程中酸性磷酸酶活性动态变化规律与薯蓣皂苷元的动态合成规律基本一致。

此外,研究还发现在相同供磷水平下,酸性磷酸酶活性高低与薯蓣皂苷元合成能力呈正相关;而在不同供磷水平下,酸性磷酸酶活性高低与薯蓣皂苷元合成能力没有相关性。

关键词:盾叶薯蓣;悬浮培养;细胞生长;薯蓣皂苷元合成;酸性磷酸酶中图分类号:Q943.1 文献标识码:A 文章编号:1672-3678(2008)02-0043-05D iosgen i n b i osy n thesis i n suspen s i o n cultur es ofD iosco rea zin giberensis cellsY UAN L i 2hong,ZHOU H ai 2xia,Y U Xiao,OUY AN G Ping 2kai(College of Life Sc i ence and Phar m aceutica l Enginee ring,Nanjing Uni ve rsit y of Technol og y,Nanjing 210009,China )Abstra ct:Gr ow th,di osgenin bi osynthesis,the consumoti on of sucr ose and inorganic phos phate in the m e 2dium ,as well as the rela ti onshi p of acid phosphatase activity and diosgenin biosynthe sis in D.zingiber en 2s is cell sus pension cultur e swe r e studied .The r e sults show that the m axi m al specific gr ow th rate was 0119d -1and double ti m e was 3168d in the exponential pha se .The intensity of di osgenin biosynthesiswas cor 2related t o cell gr owth .On the 6th day of cultivation,the content and yield of di osgenin r eached the m axi 2m al level,constituting 0120%and 25193m g/L,95165%of sucr ose wa s depleted and the m axi mal ab 2sor p ti on of phosphate (90136%)arrived .During the incubation peri od,the dyna m ic change of acid phospha tase activity exhibited a si m ila r tr end w ith tha t of diosgenin biosynthesis .Further more,the r e was a positive correlation be t w een acid phosphatase activity and the capability of diosgenin synthesis under the same phosphate leve l ;however,none corr e lati on existed bet ween them under different phos phate levels .Key words:D iosc o r ea zing iber ensis ;suspensi on cultur e;cell gr owth;di osgenin bi osynthesis;acid phos phatase 盾叶薯蓣(D ioscorea zing iber ensis C.H .W right)为薯蓣科薯蓣属植物,从其根状茎提取的薯蓣皂苷元(D i osgenin )是合成甾体激素类药物的重要原料[1],提取的皂苷素是生产盾叶冠心宁、地奥心血康等治疗心血管疾病药物的重要原料[2]。

薯蓣人工栽培生长周期,一般为3～5a,且易受环境、季节、3收稿日期22基金项目国家自然科学基金资助项目(63)作者简介袁丽红(65),女,教授,吉林白城人,研究方向植物细胞工程与微生物。

联系人欧阳平凯,教授,博士生导师,2y @j :20070410:202700:19-::E mail :ou angpk n ut .edu .cn　44　生物加工过程第6卷第2期虫害等因素影响[3],同时还面临品种退化、产量降低等问题[4]。

利用植物组织和细胞培养技术解决薯蓣皂苷元资源问题成为当前研究热点。

美国Kaul和Staba首先开展三角叶薯蓣(D.del2 toid e a)组织培养研究工作,从未分化的愈伤组织培养物中分离检测出薯蓣皂苷元,含量为培养物干质量的115%[5]。

盾叶薯蓣是我国特有薯蓣种,单株薯蓣皂苷元含量在薯蓣科植物中最高[5]。

成都生物所和江苏植物所较早开展盾叶薯蓣组织培养研究,愈伤组织中薯蓣皂苷元质量分数为015%左右[526]。

毕世荣等[7]利用细胞克隆技术获得了淡黄色、质地较疏松、生长快的盾叶薯蓣优良细胞株,并筛选出18株高含量薯蓣皂苷元的克隆细胞系。

李文谦等[8]研究了不同NA A与62BA浓度配比对盾叶薯蓣愈伤组织生长的影响,并用Logistic方程描述了细胞生长特征。

任建伟等[9]以盾叶薯蓣愈伤组织为接种物,研究了悬浮培养细胞生长及薯蓣皂苷元合成的动态变化,发现薯蓣皂苷元合成与生长关系属于延迟型。

多数研究认为甾体皂苷元生物合成是由甲羟戊酸途径而得到的[10]。

由鲨烯合成甾体皂苷配基的具体合成途径和催化酶类目前尚少见报道。

在甲羟戊酸代谢途径中许多中间产物和关键酶(H MG2CoA还原酶)发生磷酸化和去磷酸化反应, H MG2CoA还原酶磷酸化活性低,去磷酸化活性高。

酸性磷酸酶(acid phos phata se,ACP)是生物体内磷酸酯代谢的重要酶类,催化磷酸化的中间产物和磷酸化酶去磷酸化[11],同时它还参与细胞间物质转运、能量转运以及信号转导等重要生命活动[12]。

目前,盾叶薯蓣细胞培养研究多集中在愈伤组织培养方面,对悬浮细胞培养和薯蓣皂苷元合成的研究较少。

本文在已建立的盾叶薯蓣悬浮细胞体系基础上,研究细胞生长与薯蓣皂苷元合成和积累规律,以及培养过程中酸性磷酸酶酶活变化与薯蓣皂苷元合成的关系,为利用盾叶薯蓣细胞大规模培养生产薯蓣皂苷元奠定基础。

1　实验材料和方法1.1　盾叶薯蓣悬浮细胞继代培养将2倍体积新鲜MS培养基(其中附加NAA2 L,B1L,蔗糖3L,灭菌前调51)加入到盾叶薯蓣悬浮细胞培养物中,混匀后分装于5L三角瓶,每瓶5L。

于(6±15)℃黑暗下振荡培养,转速120r/m in,每12d继代一次。

1.2　盾叶薯蓣悬浮细胞培养将种龄10d的细胞接种于新鲜的MS培养基中,附加成分、pH同上。

接种量体积比118/5。

培养条件同上,每2d取样测定。

1.3　细胞生长测定收获细胞培养物,量出总体积,抽滤,滤液供蔗糖、果糖和磷酸盐等分析用,细胞用蒸馏水洗涤3次,称鲜细胞质量。

称取0150g鲜细胞于60℃烘箱中烘干至恒重,称质量并计算出干细胞含量。

生物量以每升培养物中干细胞质量表示(g/L)。

实验重复3次。

1.4　蔗糖、果糖和磷酸盐测定蔗糖、果糖测定参照文献[13]方法。

磷酸盐测定参照文献[14]方法。

实验重复3次。

1.5　盾叶薯蓣细胞培养物薯蓣皂苷元水解提取和R P2HP LC定量分析 薯蓣皂苷元水解提取方法参照文献[15216]并加以改进。

称取10100g鲜细胞置平底烧瓶内,加入30mL、115mol L-1H2S O4-70%异丙醇溶液,沸水浴回流提取8h,冷却、抽滤,滤液中加入等体积蒸馏水后用等体积正己烷萃取3次,合并,用1% Na OH溶液洗至无色,再用蒸馏水洗至中性。

于50℃减压蒸干并用无水乙醇洗出,再蒸干,用甲醇溶解并定容至5mL,供RP2HP LC分析用。

ALLTECH Plus Chr o m atography HP LC仪(美国ALLTECH公司),Kr oma sil C218色谱柱(250mm×416mm,5μm),流动相纯甲醇,流速1mL m in-1,紫外检测器,检测波长208nm,薯蓣皂苷元标准品购自Sig2 m a公司。

薯蓣皂苷元产量以薯蓣皂苷元占干细胞质量的百分数和每升培养物积累的薯蓣皂苷元的量(m g L-1)表示。

实验重复3次。

1.6　酸性磷酸酶提取和酶活性测定称取110g鲜细胞,加入5mL、0105mol L-1 Tris2HC l缓冲液(含2mol L-1EDTA,pH715)和少许石英砂,研磨,4℃离心15m in,转速8000r/ m in,上清液即为酶液。

酸性磷酸酶活性的测定及酶活定义参照文献[14]。

实验重复3次。

2　结果与讨论　盾叶薯蓣悬浮培养细胞生长和薯蓣皂苷元合成与积累 盾叶薯蓣细胞悬浮培养过程中细胞生长和糖mg/A02mg/0g/pH820m0m202.1　2008年3月袁丽红等:盾叶薯蓣悬浮培养细胞生长及薯蓣皂苷元合成45　及磷酸盐吸收与利用情况见图1。

(a )细胞生长; (b )糖吸收利用; (c )磷酸盐吸收利用图1　盾叶薯蓣细胞悬浮培养过程中细胞生长和营养吸收利用F ig .1　Gro wth and nutrient u p take of D.zingib erensis s uspensi on cell culture s 10d 培养过程中细胞生长曲线呈S 形。