精氨酸脱羧酶和谷酰胺转移酶活性的测定方法
GUS酶活检测方法
荧光光度计定量分析转化植株GUS基因稳定表达活性试剂准备：1.GUS提取缓冲液：50mmol 磷酸钠(PH7.0)10mmol EDTAO.1% Triton X-1000.1% Sarcosyl10mmol/l β-巯基乙醇2.1mmol/1 4-MU(4-甲基伞形酮)：称取19．82mg4-MU钠盐，用1ml乙醇溶解，dH2O定容至100ml。
4℃暗处可以贮存一个月。
贮存中有可能发生结晶。
3.反应缓冲液：GUS提取缓冲液中加入1mmol/l MUG（100ml 加入35.23mg），4℃可以保存2周。
4.考马新亮旒G250溶液：lOOmg考马斯亮蓝G250溶于50m1 95％乙醇中，加lOOml磷酸，dH2O定容至1L过滤后于4℃贮存。
操作步骤：新鲜的植物组织6US蛋白的提取：1．取0.1g叶片样品，用液氮研磨成粉。
2．加入3倍体积的提取缓冲液，研成匀浆。
3．4000rpm离心lOmin，收集上清液，于-20℃冰箱中保存备用。
GUS蛋白提取液蛋白含量测定：1.制作标准曲线：BSA母液（ml）H2O（ml）BSA浓度（ug/ml）0.25 4.75 1.250.5 4.5 2.51.0 4.0 5.01.5 3.5 7.52.03.0 10.02.5 2.5 12.55.0 0.0 25.0配制25ug／ml BSA母液：称取2.5mgBSA，加入0.5ml提取缓冲液，用H2O定容至lOOml。
按上表制作BSA梯度液。
从中取4ml加入lml考马斯亮蓝G-250溶液，混匀，室温下放置2min，测定595nm 的吸收值。
吸收值对蛋白浓度作图绘制标准曲线。
取植物材料GUS蛋白提取液20ul，加H2O至4ml，加入lml考马斯亮蓝，混匀，室温下放置2min。
测定595nm光吸收值根据标准曲线计算蛋白质含量。
GUS酶活反应：1. 将反应缓冲液于37℃预热。
2．取6支1.5ml离心管，各加入900ul反应终止液，编号。
谷氨酰转肽酶干化学法100
谷氨酰转肽酶干化学法100
谷氨酰转肽酶（GPAT）干化学法是一种用于测定谷氨酰转肽酶活性的实验方法。
以下是该方法的步骤：
1. 准备实验材料：谷氨酸、甘油-1-磷酸钠、NaOH溶液、硫酸铵、三乙胺、2,4-二硝基苯胺溶液、乙酸乙酯。
2. 准备试样：分别取一定量的目标组织或细胞裂解液，并进行蛋白含量的测定。
3. 预处理样品：将试样加入NaOH溶液中，并加入硫酸铵溶液进行酸化处理。
4. 合成底物：将谷氨酸和甘油-1-磷酸钠混合，加入适量的NaOH溶液进行搅拌，形成底物液。
5. 反应：将处理后的样品与底物液混合，加入三乙胺和2,4-二硝基苯胺溶液，并进行孵育反应。
6. 提取：加入乙酸乙酯提取反应液中的产物。
7. 测定：使用分光光度计对提取物进行测定，根据吸光度的变化可以计算出谷氨酰转肽酶的活性。
这是谷氨酰转肽酶干化学法的基本步骤，具体操作中可能还会有一些细微的差异和优化步骤。
在进行实验前，需要根据实际
情况进行实验设计和样品处理，并确保仪器设备的正确使用和操作流程的规范性，以获得准确可靠的结果。
谷氨酰胺酶(glutaminase, GLS)活性测定试剂盒使用说明
谷氨酰胺酶(glutaminase,GLS)活性测定试剂盒使用说明产品简介：GLS存在于高等动物和某些细菌以及植物根中，催化谷氨酰胺水解成谷氨酸和氨，在氮素代谢中具有重要调控作用，尤其是调节游离氨含量和尿素代谢。
GLS催化谷氨酰胺水解成L-谷氨酸和氨，利用奈氏试剂检测氨增加的速率，即可计算其酶活性。
试验中所需的仪器和试剂：台式离心机、可见分光光度计、1mL玻璃比色皿、可调式移液枪、研钵、冰和双蒸水。
产品内容：试剂一×1瓶，60mL，4℃保存；试剂二×1瓶，50mL，4℃保存；试剂三×1瓶，60mL，常温保存；试剂四×1瓶，12mL，常温保存；试剂五×1瓶，6mL，常温保存；试剂六×1瓶，6mL，常温避光保存。
操作步骤：一、粗酶液提取：称取约0.1g组织，加入0.9ml试剂一研钵中研磨均匀，于48000rpm℃离心10min，取上清，作为待测液（粗酶液）。
二、测定步骤：1、空白管：（1）蒸馏水0.05mL，加试剂一0.2mL，加试剂二0.8mL，混匀后37℃水浴1h；（2）加入试剂三1.05mL，混匀后8000rpm离心10min；取上清液1.0mL到新离心管中，加入试剂四0.23mL，混匀；（3）取0.8mL到新离心管中，依次加入试剂五0.1mL和试剂六0.1mL，混匀后等待10min，即可用于调零。
2、样品管：仅需要把蒸馏水0.05mL换成粗酶液0.05mL即可，其余同空白管。
3、实际测定只要做一个空白管，用于调零，于420nm处比色，记录吸光值，记为A。
GLS活性计算：1、酶活性单位定义：37℃下每mg蛋白质每小时催化谷氨酰胺生成1μmol氨。
2、计算公式：GAA（U/mg prot）＝363.1×(A－0.1301)÷蛋白质浓度（mg/mL）。
植物体内谷氨酰胺合成酶活力的测定
实验27 植物体内GS 谷氨酰胺合成酶活力的测定【原理】谷氨酰胺合成酶（GS ）是植物体内氨同化的关键酶之一，在A TP 和Mg 2+存在下，它催化植物体内谷氨酸形成谷氨酰胺。
在反应体系中，谷氨酰胺转化为γ─谷氨酰基异羟肟酸，进而在酸性条件下与铁形成红色的络合物，该络合物在540nm 处有最大吸收峰，可用分光光度计测定。
谷氨酰胺合成酶活性可用产生的γ─谷氨酰基异羟肟酸与铁络合物的生成量来表示，单位μmol ·mg ﹣1protein ·h ﹣1。
也可间接用540nm 处吸光值的大小来表示，单位A ·mg ﹣1 protein ·h ﹣1。
【仪器与用具】冷冻离心机；分光光度计；天平；研钵；恒温水浴；剪刀；移液管（2ml 、1ml ）。
【试剂】提取缓冲液：0.05mol/L Tris-HCl ，pH8.0，内含2mmol/L Mg 2+，2mmol/L DTT ，0.4mol/L 蔗糖。
称取Tris （三羟甲基氨基甲烷）1.5295g ，0.1245g MgSO 4·7H 2O ，0.1543g DTT （二硫苏糖醇）和34.25g 蔗糖，去离子水溶解后，用0.05 mol/L HCl 调至pH8.0，最后定容至250ml ；反应混合液A （0.1mol/L Tris-HCl 缓冲，pH7.4）：内含80mmol/L Mg 2+，20mmol/L 谷氨酸钠盐，20mmol/L 半胱氨酸和2mmol/L EGTA ，称取 3.0590g Tris ，4.9795 gMgSO 4·7H 2O, 0.8628g 谷氨酸钠盐，0.6057g 半胱氨酸，0.1920gEGTA ，去离子水溶解后，用0.1mol/L HCl 调至pH7.4，定容至250ml ；反应混合液B （含盐酸羟胺，pH7.4）：反应混合液A 的成分再加入80mol/L盐酸羟胺，pH7.4；显色剂（0.2mol/L TCA, 0.37mol/L FeCl 3和0.6mol/L HCl 混合液）： 3.3176g TCA （三氯乙酸），10.1021g FeCl 3·6H 2O ，去离子水溶解后，加5ml 浓盐酸，定容至100ml ； 40mmol/L A TP 溶液：0.1210g A TP 溶于5ml 去离子水中（临用前配制）。
谷氨酰胺合成酶活性的测定
谷氨酰胺合成酶活性的测定一．试剂（1）酶提取缓冲液（0.05mol/L Tris- HCl，pH 8.0；内含2mmol/L Mg2+、2mmol/L DTT、0.4mol/L蔗糖）称取 Tris[三（羟甲基）氨基甲烷]1.5295 g，MgSO4·7H2O 0.1245g，DTT（二硫苏糖醇）0.1543 g和蔗糖34.23 g，去离子水溶解后，用0.5~1.0 mol/L HCl调至pH 8.0，最后定容至250 mL。
（2）酶反应液1.对照反应液A（0.1mol/L Tris- HCl缓冲液，pH 7.4；内含80mmol/L Mg2+、20mmol/L谷氨酸钠盐、20mmol/L半胱氨酸和2mmol/L EDTA-Na2）称取1.2236 g Tris、1.9918 g MgSO4·7H2O、0.3451 g谷氨酸钠盐、0.2422 g半胱氨酸、0.0744 g EDTA-Na2，分别用去离子水浴解后，用0.5~1.0mol/L HCl调至pH 7.4，定容至100mL。
2.完全反应液B（含盐酸羟胺、pH 7.4的0.1mol/L Tris- HCl缓冲液）除了反应混合液A的成分外，再添加80mmol/L盐酸羟胺（每100 mL 中含0.5560 g盐酸羟胺）。
（3）显色剂（0.2mol/L TCA、0.37mol/L FeCl3和0.6mol/L HCl混合液）称取3.3176 g TCA（三氯乙酸）和10.1021 g FeCl3·6H20，用去离子水溶解后，加5mL浓盐酸，定容至100mL。
（4）40mmol/L ATP溶液称取0.2420 g ATP溶于10 mL去离子水中（临用前配制）。
二．实验步骤（1）粗酶液的提取取10mL藻液，在4500r/min离心15分钟，去掉上清液，加5mL酶提取液，超声波破碎10min，4℃,12000g离心20min,上清液即为粗酶提取液（2）GS活性的测定取1.0mL完全反应液B于10mL离心管中，加入0.5mL粗酶液和0.5mL ATP溶液，混匀，于37℃下保温0.5 h，加入1mL显色剂终止反应，摇匀，室温下放置5min后，于3500r/min下离心10min，取上清液于540nm下测定吸光度，以加入1.0mL对照反应液A的为对照。
GUS酶活性测定
实验注意事项： 4-MU梯度浓度液的配置时需要根据预估样品的浓度范围来确定，要求 是4-MU的浓度梯度要跨过样品的浓度范围。 预估时可以参考一下数据： 0.05nmol的MU的荧光强度是843; 0.1nmol是1968; 1.5nm品（叶、根）20mg于预冷的1.5mL eppendorf管中，加入液氮研磨成粉末，加 入200uL的提取buffer，混匀； • 13000rpm, 4℃离心15min，吸取上清于另一 eppendorf管中4℃备用。可以做几个平行。
MU标准曲线的制作
用反应终止液将MU母液（1mM）稀释成浓度范围在0－10uM的 系列标准液，通过测定它们的荧光强度作出一条标准曲线。
2、GUS assay buffer :
称取22mg 4-MUG于50ml的 GUS extraction buffer中，4℃ 保存。
4、G-250 dye:
3、Stop solution:
0.2M Na2CO3
实验结束后清洗工作: • 96孔板用过以后用清水洗净,然后用碱液(氢 氧化钠溶液)浸泡一个小时后用清水洗净后 烘干后备用. • 测蛋白的比色杯用酒精洗净后用清水洗净, 烘干后备用.
测定原理
GUS酶活性
（pmol 4-MU/hr/ug protein)
反应底物（4-MU）的物质的量 反应时间*蛋白含量 反应底物（4-MU）的浓度*（体积） 反应时间*蛋白浓度*（体积）
注： 1. 4-MU的浓度是由荧光分光光度计测得数值后从标准曲线上读数获得； 2. 反应时间可以设置梯度时间：5min、10min、20min、30min、45min和 60min等, 也可以只取一个时间； 3. 蛋白浓度是通过考马斯亮蓝法测得吸光度后从BSA标准曲线读数获得。
氨基酸脱羧酶对照生化鉴定管
氨基酸脱羧酶对照生化鉴定管是一种用于检测样品中氨基酸脱羧酶活性的试剂盒，由不同种类的氨基酸和相关酶组成。
该试剂盒可用于各种样品中氨基酸脱羧酶的检测和鉴定，如食品、饲料、药品等。
使用氨基酸脱羧酶对照生化鉴定管时，需要将待测样品与试剂盒中的试剂混合，并在适宜的温度下培养一定时间。
然后根据样品的颜色变化和对照管的比较，判断待测样品中是否存在氨基酸脱羧酶活性。
需要注意的是，在使用氨基酸脱羧酶对照生化鉴定管时，应严格按照说明书上的操作步骤进行，以免影响检测结果的准确性。
同时，对于不同的样品和实验条件，可能需要进行适当的调整和优化。
重组植物乳杆菌谷氨酸脱羧酶活力测定实验
重组植物乳杆菌谷氨酸脱羧酶活力测定实验一、实验目的了解原核表达系统熟悉并掌握粗酶液的制备方法熟悉并掌握谷氨酸脱羧酶活力的测定方法熟悉并掌握超声破碎仪及U-V1100紫外可见分光光度计使用方法二、实验原理γ-氨基丁酸（GABA）作为一种非蛋白氨基酸，是目前研究较为深入的哺乳动物脑组织一种重要的抑制性神经递质，具有一系列的生理功能，例如降血压功能、治疗癫痫、抗疲劳、提高免疫力等。
谷氨酸脱羧酶（GAD,EC4.1.1.15）是一种磷酸吡哆醛（PLP）类酶，能专一催化L-谷氨酸脱羧成为γ-氨基丁酸（GABA）和CO2。
催化效率——即酶的活力是酶的重要参数，研究酶的活力是研究酶性质及应用的基础。
本实验通过测定谷氨酸脱羧酶催化产物γ-氨基丁酸产率来定义谷氨酸催化活力。
谷氨酸脱羧酶催化反应式如下：L-谷氨酸谷氨酸脱羧酶（GAD）γ-氨基丁酸（GABA）GAD现行测定方法及优缺点测定方法优点缺点HPLC法准确灵敏度高操作复杂、测定时间较长氨基酸自动分析仪法稳定操作简单仪器使用复杂、昂贵纸层析和薄层层析法方便简单稳定性差、适合定性测量Berthelot比色法灵敏度高、方便简单有游离氨干扰毛细管电泳法耗材少，环境污染小重现性较差根据样品的特性及实验的需要，本实验采用Berthelot法测定反应液中GABA。
GABA的测定方法采用Berthelot法，该方法利用苯酚和次氯酸钠与氨基反应生成蓝绿色物质(次氯酸钠氧化苯酚生成醌，醌和氨基反应生成蓝绿色物质)。
Berthelot法对GABA（ω-氨基酸）的响应高，而对L-谷氨酸（α-氨基酸）响应低，所以用Berthelot法可以快速、高灵敏度测定出催化反应产物中的GABA。
通过测定一定时间反应液中的GABA的吸光度值从而得到GABA的浓度，最终计算出谷氨酸脱羧酶的活力。
三、实验材料和主要仪器1、仪器MIKRO 220R 2205型低温冷冻离心机UV-1100型紫外可见分光光度计水浴锅ZHWY-110XAB104-N型电子分析天平FS-250N型超声破碎仪2、主要器皿100mL容量瓶、烧杯、样品瓶、5mL试管、5mL离心管、10mL离心管、50mL离心管3、试剂和材料γ-氨基丁酸（GABA）标准品（sigma公司）L-谷氨酸钠（味精）磷酸盐缓冲液（PBS）：8g/L NaCl,0.2g/L KCl,1.42g/L Na2HPO4,0.27g/L KH2PO4,加入浓盐酸调节pH至7.4Na2HPO4-柠檬酸缓冲液（pH4.8，含0.2MNa2HPO4，0.1M柠檬酸，20mL）：0.2M Na2PO49.86mL,0.1M柠檬酸10.14mL混合。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
精氨酸脱羧酶和谷酰胺转移酶活性的测定方法
赵福庚;刘友良
【期刊名称】《植物生理学通讯》
【年(卷),期】2000(36)5
【摘要】介绍了一种测定精氨酸脱羧酶和谷酰胺转移酶活性的方法———苯甲酰化紫外检测 ,并鉴定了该方法的灵敏性。
【总页数】4页(P442-445)
【关键词】精氨酸脱羧酶;谷酰氨转移酶;活性测定;测定方法
【作者】赵福庚;刘友良
【作者单位】南京农业大学农学系
【正文语种】中文
【中图分类】Q946.54;Q946.55
【相关文献】
1.白血病细胞内精氨酸酶,鸟氨酸脱羧酶和组氨酸脱羧酸活性的变化 [J], 缪金明;潘瑞彭
2.吗啡依赖状态下大鼠脑组织左旋精氨酸脱羧酶活性的测定 [J], 苏瑞斌;李锦;秦伯益
3.低温胁迫下褪黑激素对烟草悬浮细胞精氨酸脱羧酶活性的影响 [J], 张贵友;李萍;戴尧仁
4.不同生态型芦苇叶片中多胺浓度和精氨酸脱羧酶活性的季节变化 [J], 王洪亮;张承烈
因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。