单克隆抗体制备全攻略(一)[1].
单克隆抗体制备
单克隆抗体制备一、背景单克隆抗体是免疫学研究中一种重要的工具，它具有高度特异性和亲和力，被广泛用于生物医学领域的诊断、治疗和基础研究。
与多克隆抗体相比，单克隆抗体具有更好的一致性和稳定性，适用于许多应用，如药物研发、免疫组化、流式细胞术和免疫疗法。
制备单克隆抗体的常用方法之一是杂交瘤技术，该技术结合了免疫学和细胞生物学的原理，可以高效地从动物体内产生的多克隆抗体中筛选出特定的单克隆抗体。
通过杂交瘤技术，可以将免疫系统的多克隆反应转化为单克隆细胞系，从而获得具有特定抗原结合能力的单克隆抗体。
单克隆抗体的制备通常需要经历免疫原制备、动物免疫、细胞融合、细胞筛选和单克隆化等多个步骤。
在这些步骤中，研究人员需要精心设计实验方案，选择合适的抗原、动物宿主和细胞系，并进行有效的筛选和表征，以确保最终获得具有理想特性的单克隆抗体。
本方案旨在提供一个系统的操作流程，帮助研究人员利用杂交瘤技术制备单克隆抗体，并为进一步的生物医学研究和应用奠定基础。
通过制备和应用单克隆抗体，可以促进相关领域的科学发展，为疾病诊断、治疗和生物学研究提供更精准、有效的工具和方法。
二、制备流程制备单克隆抗体的方案涉及到多个步骤，包括免疫原制备、动物免疫、细胞融合、细胞筛选和单克隆化。
以下是一个详细的方案：1. 免疫原制备1.1 准备目标蛋白或抗原，例如从细胞提取目标蛋白，或合成包含特定抗原肽段的多肽。
1.2 对抗原进行纯化和检测，确保其质量和纯度。
1.3 根据需要，对抗原进行适当的处理，例如结合载体蛋白、乳化、或结合适宜的佐剂，以增强免疫原性。
2. 动物免疫2.1 选择合适的动物（如小鼠、兔子等）作为免疫宿主。
2.2 将抗原与佐剂混合，根据实验计划和动物体重确定免疫方案，包括免疫剂量和注射时间表。
2.3 使用适当的免疫技术（例如皮下、肌肉注射）对动物进行免疫，以激发免疫反应产生抗体。
3. 细胞融合3.1 在免疫完成后，采集动物脾细胞或骨髓细胞。
单克隆抗体制备步骤及注意事项
单克隆抗体制备步骤及注意事项单克隆抗体（Monoclonal antibody，mAb）是指由单一B细胞克隆分离得到的抗体，其具有高特异性和高亲和力。
制备单克隆抗体的方法主要有杂交瘤技术和重组DNA技术。
以下是单克隆抗体制备的步骤及注意事项。
步骤一：抗原免疫1.选择合适的抗原：根据需要检测的分子或细胞表面标志物，选择合适的抗原。
2.免疫动物：常用的动物有小鼠、兔子等。
选择适合的动物后，根据抗原的种类和免疫动物对该抗原的敏感性，设计免疫方案。
3.免疫计划：免疫计划包括免疫剂量、免疫途径和免疫次数等。
通常先进行原位免疫，然后再以单体或混合抗原进行体内免疫。
步骤二：细胞融合1.收集脾细胞：在最佳时期，解剖免疫动物，取出脾脏。
2.细胞培养：将收集的脾细胞在无菌条件下分散成单个细胞，并在培养基中培养，以供细胞融合使用。
3.准备骨髓瘤细胞：选择合适的骨髓瘤细胞，例如NS0或SP2/0等。
将其培养至对数生长期。
4.细胞融合：在抗原刺激下，将脾细胞与骨髓瘤细胞以一定比例混合，用聚乙烯醇或其他化合物促进细胞融合。
步骤三：细胞筛选与扩展1. HT增重培养：用含有hprt缺陷的培养基筛选融合细胞，以选择杂交瘤细胞。
2. Limited Dilution扩展：以一细胞一孔的方式将杂交瘤细胞进行有限稀释，使其实现单克隆化。
3.细胞培养：将单克隆细胞株移植到培养瓶中，进行培养和扩增。
步骤四：单克隆抗体鉴定1.酶联免疫吸附试验（ELISA）：用ELISA方法筛选单克隆细胞株，检测其抗原特异性。
2.免疫组织化学检测：将单克隆抗体应用于细胞和组织切片，检测其在特定细胞或组织中的反应。
3.流式细胞术：通过流式细胞仪检测单克隆抗体与特定细胞表面标志物的结合情况。
步骤五：单克隆抗体生产与纯化1.细胞培养：将单克隆细胞株培养扩增至一定程度。
2.抗体收集：将培养上清液进行抗体收集。
3.纯化与浓缩：利用亲和层析、离子交换、凝胶过滤等技术，对抗体进行纯化和浓缩。
单克隆抗体制备全攻略
单克隆抗体制备全攻略
第二部分：后续制备抗体
一、克隆抗体转染/细胞表达
1、转染/细胞表达
在细胞转染/表达实验中，选择恰当的细胞系，以实现 Ideal Clone
抗体的有效表达。
一般来说，传统抗体的转染/表达系统可以从常见的细
胞类型中选择，如：CHO、COS、HEK293、HEK293T、BAK、T-Rex等。
在细
胞表达系统中，要获得较高质量和较高抗体表达水平的细胞，需要仔细筛
选要转染的细胞，以确保细胞表达的质量。
此外，在细胞表达实验中，对 mammalian expression vectors（比
如pCDNA3.1）进行转染/表达，通常会使用常用的转染剂，如：FUGENE-6、Lipofectamine 2000，以及使用高效器具，比如：Gene Pulser以及Nucleofector等。
此外，在实验中，也会使用不同类型的细胞表达系统，以同时表达多个受体，以实现有效地克隆抗体制备。
2、显示克隆抗体
显示技术是克隆抗体制备的一种优秀技术，它可以实现高质量的表达，同时保持抗体的结构和性质。
制备单克隆抗体的流程
制备单克隆抗体的流程首先呢，得免疫动物。
就是要给动物注射特定的抗原哦。
这个抗原的选择可重要了呢！我觉得这一步得好好考虑清楚，要根据你想要得到的单克隆抗体的特性来选抗原。
你可别随便就选一个呀！当然啦，不同的动物对不同抗原的反应可能不太一样，这就需要你有点经验或者多做些小试验来确定啦。
接下来，就是取免疫后的动物细胞啦。
一般是取脾脏细胞，这一步要小心点哦！因为脾脏这个器官比较脆弱，要是不小心弄坏了，可能会影响后面的实验呢。
不过也不用太紧张，只要按照基本的操作规范来就好。
然后呢，要把取出来的细胞和骨髓瘤细胞融合。
怎么融合呢？这就用到一些特殊的试剂啦。
这一步呀，我觉得在操作的时候要特别细致。
根据我的经验，融合的条件得控制好，像温度啊、试剂的浓度啊这些，要是稍微有点偏差，可能融合的效果就不太理想了。
融合之后呢，就有了杂交瘤细胞啦。
这时候要进行筛选哦。
为什么要筛选呢？因为我们只想要得到那些成功融合的细胞呀！这一步可不能马虎，要把那些没融合好的细胞或者其他杂质细胞去掉。
这个筛选的方法有好几种呢，你可以根据自己实验室的条件和习惯来选择，我觉得这环节可以根据实际情况自行决定。
筛选出杂交瘤细胞后，就是克隆化培养啦。
这一步很关键呢！要让这些细胞不断地繁殖，得到足够多的细胞。
刚开始可能会觉得这个过程有点漫长，不过习惯了就好了。
在这个过程中，要注意细胞的生长状态，给它们提供合适的生长环境，像营养物质啊、温度啊、湿度这些都得照顾到。
最后呢，就是要检测单克隆抗体啦。
看看你得到的抗体是不是你想要的那种。
这一步要特别注意！小提示：别忘了最后一步哦！要是前面都做对了，最后却没检测好，那可就有点亏啦。
好啦，这就是制备单克隆抗体的大致流程啦。
当然啦，在实际操作过程中，可能会遇到各种各样的小问题，但只要多做几次，积累经验，就会越来越熟练的。
希望大家都能顺利制备出自己想要的单克隆抗体哦！。
单克隆抗体的制备流程
单克隆抗体的制备流程
一、抗体cDNA克隆
2、结合分离：抗体和抗原之间采用免疫学方法，进行亲和结合分离，在病理学中，可以采用细胞亲和免疫电泳或者细胞色素紧缩技术来进行识
别性结合分离抗体。
3、mRNA提取：使用RNAsy Plus Kit根据操作说明提取亲和结合分
离后的抗体的mRNA，用于cDNA合成。
4、cDNA合成：使用双链cDNA合成试剂盒，根据说明书操作，将mRNA合成双链cDNA。
5、克隆：将双链cDNA进行克隆，经过构建的一系列步骤，最终将cDNA克隆到载体上，构建出抗体cDNA克隆库。
二、抗体cDNA克隆抗体制备
1、选择克隆体：选择抗体cDNA克隆库中的抗体表达克隆，采用PCR
技术进行选择，并检测克隆体具有良好的免疫特性，可以快速确定最佳克
隆体。
2、表达载体构建：将最佳克隆体插入到表达载体中，构建出属于克
隆体的表达载体，以此保证克隆体的正确表达。
3、表达系统筛选：利用多种表达系统，筛选出最佳的表达系统，以
此来达到最佳的表达效果。
4、表达调控：对于最佳的表达系统，根据cDNA克隆体的特性，进行
最佳的表达调控，以此达到最佳的抗体表达效果。
单克隆抗体制备实验步骤
单克隆抗体制备实验步骤
嘿，咱今儿就来唠唠单克隆抗体制备实验这档子事儿哈！
首先呢，得选个好苗子，就像咱挑水果得挑个水灵的，这就是要选对细胞啦。
把咱要的免疫细胞找出来，这可是关键的第一步哟！
然后呢，把这些小家伙放到合适的环境里，让它们好好长。
就好比给花浇水施肥，得让它们茁壮成长呀。
接着呀，得让这些细胞和骨髓瘤细胞来个亲密接触，这就像一场特别的相亲会，得找到最合适的那一对。
这可不是随便凑凑就行的，得精心挑选呢。
之后呢，把它们放在一块儿培养，看着它们融合在一起，就好像看到了新的希望诞生啦。
再然后，就得筛选啦！把那些不符合要求的淘汰掉，留下最棒的融合细胞。
这就像选秀比赛，只有最出色的才能留下来。
接下来，把这些选出来的宝贝们放到合适的地方继续培养，给它们提供最好的条件，让它们不断繁殖。
再往后，还得检测检测它们的能力呢，看看是不是真的厉害。
这就像考试，得检验一下真本事。
等确定了它们确实是我们想要的，那就可以大量生产啦！就像工厂生产产品一样，源源不断地制造出我们需要的单克隆抗体。
你想想，这过程多像培育一个小生命呀，从最开始的挑选，到精心呵护，再到筛选出最优秀的，最后让它发挥大作用。
这单克隆抗体制备实验可不简单，但要是做好了，那可真是了不起呀！它能帮我们解决好多难题呢，在医学、生物学等好多领域都大有用处。
所以呀，可别小瞧了这一系列步骤，每一步都得认真对待，就像对待一件珍贵的宝贝一样。
咱得有耐心，有细心，才能让这个实验成功呀！大家都加油吧，让我们一起在单克隆抗体制备实验的道路上越走越远，创造出更多的奇迹！怎么样，是不是觉得很有意思呀？。
单克隆抗体制备步骤及注意事项
单克隆抗体制备步骤及注意事项一、脾细胞的准备：1.将Balb/c小鼠拉颈脱臼处死，浸泡于75%酒精3～5min。
无菌操作取出脾脏，置于盛有5mL不完全培养液的平皿中，洗涤3次去除脾脏表面的脂肪和结缔组织。
2.将洗好的脾脏用剪刀剪成3～5个小块，然后将脾脏研碎，过细胞筛，收集细胞。
3.将脾脏细胞悬液在1000r/min条件下，离心5min，弃上清。
再以同样的方法洗涤离心一次。
4.将沉淀细胞重新悬浮于10mL不完全培养液中，计活细胞数，取108个脾淋巴细胞悬液备用。
注意事项：➢免疫脾细胞一般取最后一次加强免疫3天以后的脾脏，制备成细胞悬液，因为此时B淋巴母细胞比例较大，融合的成功率较高。
二、骨髓瘤细胞的准备：1.选好骨髓瘤细胞株，取体外培养对数生长期细胞或体内生长的肿瘤分离骨髓瘤细胞。
2.取对数生长骨髓瘤细胞离心，用无血清培养液洗2次。
3.制备细胞悬液，计活细胞数。
4.调整细胞浓度，取107细胞悬液备用。
注意事项：➢常用的骨髓瘤细胞系有：NS1、SP2/0、X63、Ag8.653等。
➢骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤细胞在同一品系小鼠腹腔内生产大量McAb。
➢骨髓瘤细胞的培养适合于一般的培养液，如RPMI-1640基础培养液，DMEM培养基。
小牛血清的浓度一般在10～20%。
细胞的最大密度不得超过106个/mL。
➢一般扩大培养以1:10稀释传代，每3～5天传代一次。
细胞的倍增时间为16～20小时。
➢一般准备融合前的两周就应开始复苏骨髓瘤细胞，为确保该细胞对HA T的敏感性，每3～6个月应用8～AG（8氮杂鸟嘌呤）筛选一次，以防止细胞的突变。
➢保证骨髓瘤细胞处于对数生长期，良好的形态，活细胞计数高于95%，也是决定细胞融合的关键。
三、细胞融合：1.将骨髓瘤细胞与脾细胞按1:10 或1:5的比例混合，加入20～50mL RPMI-1640培养液。
2.在1000r/min条件下离心8min，弃上清，用滴管轻轻吸净残留液体。
单克隆抗体制备的具体步骤
单克隆抗体制备的具体步骤
嘿，咱今儿就来唠唠单克隆抗体制备的那些事儿！
你想啊，要制备单克隆抗体，就像盖一座特别的房子。
第一步呢，
得选好材料呀，这就好比选建房子的砖头和瓦片。
咱得先找到合适的
抗原，这抗原就像是房子的基石，得稳稳当当的呢。
然后呢，就该让免疫细胞出马啦！把抗原注射到小鼠体内，让小鼠
的免疫系统动起来，产生抗体。
这小鼠啊，就像个勤劳的小工匠，努
力地工作着。
接着，等小鼠的免疫系统被激发得差不多了，就把它的脾脏取出来。
这脾脏就像是个藏宝库，里面有好多我们需要的宝贝细胞呢。
把脾脏
细胞弄出来后，再和骨髓瘤细胞融合在一起，这融合的过程就好像两
种不同的材料要完美结合在一起，变成一种全新的、更厉害的东西。
融合之后，可不是所有的细胞都能用哦，得经过筛选才行。
这就好
比在一堆沙子里找金子，得仔细挑挑拣拣呢。
把那些能产生我们想要
的抗体的细胞选出来，其他的就淘汰掉。
选出来的细胞还得培养呀，给它们提供一个舒适的环境，让它们好
好长大，多多生产抗体。
这就像照顾小树苗，得给它浇水、施肥，让
它茁壮成长。
最后，经过一系列的步骤，我们就能得到我们心心念念的单克隆抗体啦！这抗体就像是我们盖房子最后的成品，坚固又好用。
你说这单克隆抗体制备是不是很神奇？它就像是一个魔法的过程，把一些看似普通的东西，通过一系列复杂的操作，变成了非常有用的宝贝！这过程虽然有点复杂，但每一步都充满了惊喜和挑战呢。
咱要是能把这单克隆抗体给制备出来，那可真是了不起呀！你难道不想试试吗？。
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一、单克隆抗体的概念抗体是机体在抗原刺激下产生的能与该抗原特异性结合的免疫球蛋白。
常规的抗体制备是通过动物免疫并采集抗血清的方法产生的,因而抗血清通常含有针对其他无关抗原的抗体和血清中其他蛋白质成分。
一般的抗原分子大多含有多个不同的抗原决定簇,所以常规抗体也是针对多个不同抗原决定簇抗体的混合物。
即使是针对同一抗原决定簇的常规血清抗体,仍是由不同B细胞克隆产生的异质的抗体组成。
因而,常规血清抗体又称多克隆抗体(polyclonal antibody,简称多抗。
由于常规抗体的多克隆性质,加之不同批次的抗体制剂质量差异很大,使它在免疫化学试验等使用中带来许多麻烦。
因此,制备针对预定抗原的特异性均质的且能保证无限量供应的抗体是免疫化学家长期梦寐以求的目标。
随着杂交瘤技术的诞生,这一目标得以实现。
1975年,Kohler和Milstein建立了淋巴细胞杂交瘤技术,他们把用预定抗原免疫的小鼠脾细胞与能在体外培养中无限制生长的骨髓瘤细胞融合,形成B细胞杂交瘤。
这种杂交瘤细胞具有双亲细胞的特征,既像骨髓瘤细胞一样在体外培养中能无限地快速增殖且永生不死,又能像脾淋巴细胞那样合成和分泌特异性抗体。
通过克隆化可得到来自单个杂交瘤细胞的单克隆系,即杂交瘤细胞系,它所产生的抗体是针对同一抗原决定簇的高度同质的抗体,即所谓单克隆抗体(monoclonal antibody,简称单抗。
与多抗相比,单抗纯度高,专一性强、重复性好、且能持续地无限量供应。
单抗技术的问世,不仅带来了免疫学领域里的一次革命,而且它在生物医学科学的各个领域获得极广泛的应用,促进了众多学科的发展。
Kohler和Milstein两人由此杰出贡献而荣获1984年度诺贝尔生理学和医学奖。
二、杂交瘤技术(一杂交瘤技术的诞生淋巴细胞杂交瘤技术的诞生是几十年来免疫学在理论和技术两方面发展的必然结果,抗体生成的克隆选择学说、抗体基因的研究、抗体结构与生物合成以及其多样性产生机制的揭示等,为杂交瘤技术提供了必要理论基础,同时,骨髓瘤细胞的体外培养、细胞融合与杂交细胞的筛选等提供了技术贮备。
1975年8月7日,Kohler和Milstein在英国《自然》杂志上发表了题为“分泌具有预定特异性抗体的融合细胞的持续培养”(Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity的著名论文。
他们大胆地把以前不同骨髓瘤细胞之间的融合延伸为将丧失合成次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(hypoxanthine guanosine phosphoribosyl transferase,HGPRT的骨髓瘤细胞与经绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合。
融合由仙台病毒介导,杂交细胞通过在含有次黄嘌呤(hypoxanthine,H、氨基喋呤(aminopterin,A和胸腺嘧啶核苷(thymidine,T的培养基(HAT中生长进行选择。
在融合后的细胞群体里,尽管未融合的正常脾细胞和相互融合的脾细胞是HGPRT,但不能连续培养,只能在培养基中存活几天,而未融合的HGPRT-骨髓瘤细胞和相互融合的HGPRT-骨髓瘤细胞不能在HAT培养基中存活,只有骨髓瘤细胞与脾细胞形成的杂交瘤细胞因得到分别来自亲本脾细胞的HGPRT和亲本骨髓瘤细胞的连续继代特性,而在HAT培养基中存活下来。
实验的结果完全像起始设计的那样,最终得到了很多分泌抗绵羊红细胞抗体的克隆化杂交瘤细胞系。
用这些细胞系注射小鼠后能形成肿瘤,即所谓杂交瘤。
生长杂交瘤的小鼠血清和腹水中含有大量同质的抗体,即单克隆抗体。
这一技术建立后不久,在融合剂和所用的骨髓瘤细胞系等方面即得到改进。
最早仙台病毒被用做融合剂,后来发现聚乙二醇(PEG的融合效果更好,且避免了病毒的污染问题,从而得到广泛的应用。
随后建立的骨髓瘤细胞系如SP2/0-Ag14,X63-Ag8.653和NSO/1都是既不合成轻链又不合成重链的变种,所以由它们产生的杂交瘤细胞系,只分泌一种针对预定的抗原的抗体分子,克服了骨髓瘤细胞MOPC-21等的不足。
再后来又建立了大鼠、人和鸡等用于细胞融合的骨髓瘤细胞系,但其基本原理和方法是一样的。
(二基本程序和方法杂交瘤技术在具体操作上,各实验室使用的程序不尽一致。
本节中介绍的方法是作者所在实验室采用的、实践证明成熟的程序,该程序适合国内大多数实验室。
在开展杂交瘤技术制备单抗之前,培养骨髓瘤和杂交瘤细胞必须具备下列主要仪器设备:超净工作台、CO2恒温培养箱、超低温冰箱(-70℃、倒置显微镜、精密天平或电子天平、液氮罐、离心机(水平转子,4000r/min、37℃水浴箱、纯水装置、滤器、真空泵等。
其需要的主要器械包括:100ml、50ml、25ml细胞培养瓶,10ml、1ml刻度吸管,试管,滴管(弯头、直头,平皿,烧杯,500ml、250ml、100ml盐水瓶,青霉素小瓶,10ml、5ml、1ml注射器等,96孔、24孔细胞培养板,融合管(50ml圆底带盖玻璃或塑料离心管,眼科剪刀,眼科镊,血细胞计数板,可调微量加样器(~50ul,~200ul,~1000ul,弯头针头,200目筛网,小鼠固定装置等。
此外,杂交瘤细胞的筛选与检测的仪器设备,依据检测单抗的方法不同而各异,请参阅本节有关部分。
淋巴细胞杂交瘤技术的主要步骤包括:动物免疫、细胞融合、杂交瘤细胞的筛选与单抗检测、杂交瘤细胞的克隆化、冻存、单抗的鉴定等,图6-1概括了淋巴细胞杂交瘤技术研制单抗的主要过程。
1、动物免疫(1抗原制备制备单克隆抗体的免疫抗原,从纯度上说虽不要求很高,但高纯度的抗原使得到所需单抗的机会增加,同时可以减轻筛选的工作量。
因此,免疫抗原是越纯越好,应根据所研究的抗原和实验室的条件来决定。
一般来说,抗原的来源有限,或性质不稳定,提纯时易变性,或其免疫原性很强,或所需单抗是用于抗原不同组分的纯化或分析等,免疫用的抗原只需初步提纯甚至不提纯,但抗原中混杂物很多,特别是如果这些混杂物的免疫原性较强时,则必须对抗原进行纯化。
检测用抗原可以是与免疫抗原纯度相同,也可是不同的纯度,这主要决定于所用筛检方法的种类及其特异性和敏感性。
(2免疫动物的选择根据所用的骨髓瘤细胞可选用小鼠和大鼠作为免疫动物。
因为,所有的供杂交瘤技术用的小鼠骨髓瘤细胞系均来源于BALB/c小鼠,所有的大鼠骨髓瘤细胞都来源于LOU/c大鼠,所以一般的杂交瘤生产都是用这两种纯系动物作为免疫动物。
但是,有时为了特殊目的而需进行种间杂交,则可免疫其他动物。
种间杂交瘤一般分泌抗体的能力不稳定,因为染色体容易丢失。
就小鼠而言,初次免疫时以8-12周龄为宜,雌性鼠较便于操作。
(3免疫程序的确定免疫是单抗制备过程中的重要环节之一,其目的在于使B淋巴细胞在特异抗原刺激下分化、增殖,以利于细胞融合形成杂交细胞,并增加获得分泌特异性抗体的杂交瘤的机会。
因此在设计免疫程序时,应考虑到抗原的性质和纯度、抗原量、免疫途径、免疫次数与间隔时间、佐剂的应用及动物对该抗原的应答能力等。
没有一个免疫程序能适用于各种抗原。
现用的免疫程序中多数是参照制备常规多克隆抗体的方法。
表6-1列举了目前常用的免疫程序。
免疫途径常用体内免疫法包括皮下注射、腹腔或静脉注射,也采用足垫、皮内、滴鼻或点眼。
最后一次加强免疫多采用腹腔或静脉注射,目前尤其推崇后者,因为可使抗原对脾细胞作用更迅速而充分。
在最后一次加强免疫后第3天取脾融合为好,许多实验室的结果表明,初次免疫和再次免疫应答反应中,取脾细胞与骨髓瘤细胞融合,特异性杂交瘤的形成高峰分别为第4天和第22天,在初次免疫应答时获得的杂交瘤主要分泌IgM抗体,再次免疫应答时获得的杂交瘤主要分泌IgG抗体。
笔者体会阳性杂交瘤出现的高峰与小鼠血清抗体的滴度并无明显的平行关系,且多在血清抗体高峰之前。
因此,为达到最高的杂交瘤形成率需要有尽可能多的浆母细胞,这在最后一次加强免疫后第3天取脾进行融合较适宜。
已有人报道采用脾内免疫,可提高小鼠对抗原的免疫反应性,且节省时间,一般免疫3天后即可融合。
表6-1不同免疫抗原的免疫程序免疫原特性、抗原量、接种次数、间隔时间、单抗的特性、抗体滴度、亲和性免疫原性强(如细胞、细菌和病毒等106-106个细胞或1-10ug2-42-4周高中等至强免疫原性中等10-100ug2-42-4周中等或高中等或强免疫原性弱 A.20-400ug2-4随后2-3每月2-3月中等强B.10-50ug其后200-400ug2其后4每月每天中等中等C.10-100ug2其后4其后“休息”最后加强每月10天1-2月中等中等或强体内免疫法适用于免疫原性强、来源充分的抗原,对于免疫原性很弱或对机体有害(如引起免疫抑制的抗原就不适用了。
如果制备人单克隆抗体几乎不大可能采用体内免疫法。
因此,针对这些情况,可采用体外免疫。
所谓体外免疫就是将脾细胞(或淋巴结细胞,或外周血淋巴细胞取出体外,在一定条件下与抗原共同培养,然后再与骨髓瘤细胞进行融合。
其基本方法是取4-8周龄BALB/c小鼠的脾脏,制成单细胞悬液,用无血清培养液洗涤2-3次,然后悬浮于含10%小牛血清的培养液中,再加入适量抗原(可溶性抗原0.5-5ug/ml,细胞抗原105-106个细胞/ml和一定量的BALB/c小鼠胸腺细胞培养上清液;在37℃,6%CO2浓度下培养3-5天,再分离脾细胞与骨髓瘤细胞融合。
2、细胞融合(1主要试剂的配制a、细胞培养基杂交瘤技术中使用的细胞培养基主要有RPMI-1640或DMEM(Dulberco Modified Eagles Medium两种基础培养基,具体配制方法按厂家规定的程序,配好后过滤除菌(0.22um,分装,4℃保存。
•不完全RPMI-1640培养基:RPMI-1640培养基原液96ml100×L.G.溶液1ml双抗溶液1ml7.5%NaHCO3溶液1-2mlHEPES溶液1ml•不完全DMEM培养基:DMEM13.37g超纯水或四蒸水980mlNaHCO33.7g双抗溶液10ml100×L.G.溶液10ml用1N HCl调试PH至7.2-7.4,过滤除菌,分装4℃保存。
•完全RPMI-1640或DMEM培养基:不完全RPMI-1640或DMEM培养基80ml 小牛血清15-20ml用于骨髓瘤细胞SP2/0和建株后的杂交瘤细胞培养。
•HT培养基:完全RPMI-1640或DMEM培养基99mlHT贮存液1ml•HAT培养基:完全RPMI-1640或DMEM培养基98mlHT贮存液1mlA贮存液1mlb、氨基喋呤(A贮存液(100×,4×10-5mol/L:称取1.76mg氨基喋呤(Aminopterin MW440.4,溶于90ml超纯水或四蒸水中,滴加1mol/L NaOH0.5ml中和,再补加超纯水或四蒸水至100ml。