第四章 抗体制药1[可修改版ppt]
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第四章 抗体制药ppt课件
解决问题的方法或途径——基因工程技术
1984年报道了人—鼠嵌合抗体，之后制备出了改型抗体、 单链抗体、单域抗体、最小识别单位等多种类型，基本上消 除了抗体的鼠源性（免疫源性），相对分子质量只有完整抗 体分子的1/80～1/3。
第一节 单克隆抗体（Monoclonal Antibody） 的制备
1、单克隆抗体与多克隆抗体
单克隆抗体（McAb ）：如果把能分泌某种特异抗体的 一个B型淋巴细胞分离出来，通过纯种培养，则只产生一种 抗体，可以特异性地与体内一种抗原结合，这种单一的特异 抗体即为单一B细胞克隆抗体，即单克隆抗体（monoclonal antibody,McAb）。
2、制备单克隆抗体的一般流程
3、杂交瘤细胞的制备与筛选流程图
BALB/C小鼠
注射矿物油诱发 骨髓瘤细胞 TK或HGBRT缺陷
BALB/C小鼠
注射某种抗原免疫 脾细胞 B淋巴细胞
融合（PEG） 分装于多孔培养板培养（HAT） 亲株死亡
杂交瘤细胞生长繁殖
鉴定单克隆抗体 选出优良杂交瘤细胞， 用于生产或冷冻保藏
二、杂交瘤细胞的制备
1、抗原与动物免疫的获得
免疫方法：体内免疫和体外免疫 抗原：颗粒性抗原和可溶性抗原 免疫动物：BALB/c小鼠和Lou大鼠
多克隆抗体：动物细胞的免疫系统接受到一个新的抗原 时，并不是对抗原的所有表面都作出反应，而只对抗原中特 异的抗原决定簇产生应答，一般一个抗原有多个抗原决定簇， 可以同时诱导产生多个B型淋巴细胞的增生。机体在同一时间 都是接受多种外界的抗原物质的，使得B型淋巴细胞增生的种 类也有多种，造成不同种B型淋巴细胞同时存在于体液中，由 此产生的抗体也是多种，所以从体液中分离提取的多种抗体 也是由多种B型淋巴细胞产生出来的，是多种抗体的混合物。 由B细胞分裂而形成的细胞群（是同质的），称为一个克隆。 因此存在于体液中各种抗体的总和可称为多种B细胞克隆抗体， 简称多克隆抗体（polyclonal antibody）。
生物技术制药第四章抗体制药(ppt)
一、抗原与动物免疫
• （2）稳定的杂交瘤的获得
• 因免疫动物品系和骨髓瘤细胞在种系发生上距离
越远，产生的杂交瘤越不稳定，故一般采用与骨 髓瘤供体同一品系的动物进行免疫。目前常用的 骨髓瘤细胞系多来自BALB/c小鼠和Lou大鼠，因 此免疫动物也多采用相应的品系，最常用的也是 BALB/c小鼠。
• 选择动物时应考虑到动物品系的免疫应答基因
生物技术制药第四章抗体制药 (ppt)
（优选）生物技术制药第四章 抗体制药
第一节 概述
• 1890年：Behring和北里柴三郎等发现了白喉抗毒素，并
建立了血清疗法，开抗体制药之先河。
• 1937年：Tiselius等人用电泳法将血清蛋白分为白蛋白、
甲种（）球蛋白、乙种（ ）球蛋白和丙种（ ）球 蛋白，并证明抗体活性主要存在于丙种球蛋白组分。
一、抗原与动物免疫
• （3）免疫方法：体内免疫法和体外免疫法
• 体外免疫法：用于不能采用体内免疫法的情况下，
如制备人源性单克隆抗体，或者抗原的免疫原性 极弱且能引起免疫抑制时使用。
• 体外免疫法所需要的抗原量少，一般只需几个g，
免疫期短，仅4~5天，干扰因素少，已成功制备 出针对多种抗原的单克隆抗体，但融合后产生的 杂交瘤细胞株不够稳定。其基本方法是用4~8周 龄BALB/c小鼠的脾脏制成单个细胞悬液，再加 入 37适℃当下抗培原养使4~其5天浓，度再达分0.离5~脾5 脏g细/m胞l，，在进5%行C细O胞2、 融合。
• 20世纪60年代初期：抗原决定簇，精制单价血清。 • 1975年：Köhler和Milstein等，单克隆抗体，其具有高度
特异性、均一性，以及来源稳定可大量生产等特点。
• 1984年：人-鼠嵌合抗体 • 1984年至今：单克隆抗体的鼠源性及分子过大的问题得
生物技术制药——第四章抗体制药演示文稿
有害物质： 1.直接使抗原失去活性 2.使免疫效应细胞将其吞噬并加以破坏 3.使抗原表面弱化从而易于受补体破坏
第六页，共194页。
免疫球蛋白（Immunoglobulin,Ig）
破伤风毒素
第七页，共194页。
免疫球蛋白
抗体分子（antibody,Ab）是由浆细胞合成和分泌的，而每一种
浆细胞克隆可以产生一种特异的抗体分子，所以血清中的抗体是 多种抗体分子的混合物，它们的化学结构是不均一的，而且含量 很少，不易纯化，是抗体分子结构分析的困难。 多发性骨髓瘤是由浆细胞无限增殖形成的细胞克隆，由于所有 瘤细胞的遗传特性相同，因此它们合成和分泌的蛋白质分子在 化学结构上是均一的。这种蛋白分子存在于血液中的称为骨髓瘤
(Kappa/Lambda=1.9±0.36) Kappa/Lambda的比率对于不同类型的免疫球蛋白略有不同，如IgG的比值 为2。这个比率也随不同年龄阶段的人群而有所改变，同时有人种和地区差异 。但对于正常人这个比率基本恒定。
在浆细胞瘤中由于一个浆细胞恶性增殖，使Kappa或Lambda含量迅速发生 变化，比率改变，这可以用来鉴别Kappa型或Lambda型骨髓瘤。
通过二硫键连接到免疫球蛋白分子上，分泌至粘膜表面。稳定
分泌型IgA的结构，对抵抗外分泌液中的蛋白水解酶的降解 具有重要作用，使之避免蛋白酶的消化水解。
第三十五页，共194页。
第三十六页，共194页。
免疫球蛋白的水解片段
铰链区有蛋白水解酶的酶切位点。 木瓜蛋白酶在重链间二硫键的N端将其裂解成
分子量基本相等的三个片段：2个Fab和1个Fc 片段。Fab能够与抗原结合，称为抗原结合片 段（Fab），Fc能够与细胞表面的Fc受体结合。 Fc具有免疫原性和抗原性。因它容易形成结晶， 故称为可结晶片段（Fc）。
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免疫球蛋白（Immunoglobulin,Ig）
破伤风毒素
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免疫球蛋白
抗体分子（antibody,Ab）是由浆细胞合成和分泌的，而每一种
浆细胞克隆可以产生一种特异的抗体分子，所以血清中的抗体是 多种抗体分子的混合物，它们的化学结构是不均一的，而且含量 很少，不易纯化，是抗体分子结构分析的困难。 多发性骨髓瘤是由浆细胞无限增殖形成的细胞克隆，由于所有 瘤细胞的遗传特性相同，因此它们合成和分泌的蛋白质分子在 化学结构上是均一的。这种蛋白分子存在于血液中的称为骨髓瘤
(Kappa/Lambda=1.9±0.36) Kappa/Lambda的比率对于不同类型的免疫球蛋白略有不同，如IgG的比值 为2。这个比率也随不同年龄阶段的人群而有所改变，同时有人种和地区差异 。但对于正常人这个比率基本恒定。
在浆细胞瘤中由于一个浆细胞恶性增殖，使Kappa或Lambda含量迅速发生 变化，比率改变，这可以用来鉴别Kappa型或Lambda型骨髓瘤。
通过二硫键连接到免疫球蛋白分子上，分泌至粘膜表面。稳定
分泌型IgA的结构，对抵抗外分泌液中的蛋白水解酶的降解 具有重要作用，使之避免蛋白酶的消化水解。
第三十五页，共194页。
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免疫球蛋白的水解片段
铰链区有蛋白水解酶的酶切位点。 木瓜蛋白酶在重链间二硫键的N端将其裂解成
分子量基本相等的三个片段：2个Fab和1个Fc 片段。Fab能够与抗原结合，称为抗原结合片 段（Fab），Fc能够与细胞表面的Fc受体结合。 Fc具有免疫原性和抗原性。因它容易形成结晶， 故称为可结晶片段（Fc）。
第四章 抗体制药1
1937年Tiselius用电泳法将血清蛋白 1937年Tiselius用电泳法将血清蛋白 分离为白蛋白、甲种（ ）、乙种 乙种（ 分离为白蛋白、甲种（α）、乙种（β）、 丙种（ 球蛋白， 丙种（γ）球蛋白，并证明抗体活性主要 存在于丙种（ 球蛋白组分。 存在于丙种（γ）球蛋白组分。 在一段时间内， 在一段时间内，丙种球蛋白成为抗体的 代名词。 代名词。
IgA抗体进入身体的黏膜表面，包括呼吸、消 抗体进入身体的黏膜表面，包括呼吸、 抗体进入身体的黏膜表面 生殖等管道的黏膜，中和感染因子。 化、生殖等管道的黏膜，中和感染因子。还可以 通过母乳的初乳把这种抗体输送到新生儿的消化 道黏膜中，是在母乳中含量最多， 道黏膜中，是在母乳中含量最多，最为重要的一 类抗体 IgE抗体的尾部与嗜碱细胞、肥大细胞的细胞 抗体的尾部与嗜碱细胞、 抗体的尾部与嗜碱细胞 膜结合。当抗体与抗原结合后， 膜结合。当抗体与抗原结合后，嗜碱细胞与肥大 细胞释放组织胺一类物质促进炎症的发展。 细胞释放组织胺一类物质促进炎症的发展。这也 是引发速发型过敏反应的抗体； 是引发速发型过敏反应的抗体； IgD抗体的作用还不太清楚。它们主要出现在 抗体的作用还不太清楚。 抗体的作用还不太清楚 成熟的B淋巴细胞表面上 可能与B细胞的分化有 淋巴细胞表面上， 成熟的 淋巴细胞表面上，可能与 细胞的分化有 关。
一个B 一个B细胞针对一个抗原决定簇所产生 单克隆抗体。 的一种特异性抗体，称为单克隆抗体 的一种特异性抗体，称为单克隆抗体。 单克隆抗体具有高度特异性 均一性、 高度特异性、 单克隆抗体具有高度特异性、均一性、 来源稳定、可大量生产等特点 等特点， 来源稳定、可大量生产等特点，为抗体制 备和应用提供了全新的手段， 备和应用提供了全新的手段，还促进了基 础和临床医学的发展。 础和临床医学的发展。
生物制药技术-第四章-抗体制药(1,2,3)
胞都是次黄嘌呤鸟瞟岭磷酸核糖转移酶 (HGPRT)缺乏株，脾细胞内却有这种酶，因此脾-瘤融合的杂交瘤细 胞 可利用HGPRT，用次黄瞟岭(H)和胸腺嘧啶(T)合成DNA，使杂交瘤细胞 得以生长。选择 性培养的常规方法是将融合的细胞悬浮于HAT的培养 液(表4 - 2)中，加入到含有饲养细胞 的96孔板内.根据情况每2~3 d 换液一次。换液时吸去l/2~2/3培养液，加入等量的新鲜 培养液。在 融合后7 d内用HAT培养液，杀死瘤瘤融合细胞后，第七天至第十四天 改用HT 培养液，第十四天以后用普通的RPMl1640完全培养液(表4 3)，从融合后8~9d就可对所 有克隆生长孔的培养上清进行抗体检测， 筛选出产生抗体的阳性克隆。
因此，抗体是指能与相应抗原特异性综合的具有免疫功能的球 蛋白。它是机体免疫系统受 抗原物质刺激后，B淋巴细胞被活化、 增殖和分化为浆细胞，由浆细胞合成和分泌的球蛋白。20 世纪60年 代初期.发现多发性骨髓瘤是浆细胞癌变形成的恶性增殖性疾病。患 者血清中也出现 同抗体分子结构类似的球蛋白。因此，将具有抗体 活性及化学结构与抗体相似的球蛋白统称为 免疫球蛋白 (immunoglobulin，Ig)。 显然，Ig是化学结构上的概念，而抗体是生物学功能上的概 念。也 就是说，所有抗体均是Ig，但并非所有Ig分子都具有抗体活性。由 于病原微生物是含有 多种抗原决定簇的抗原物质，因此这些抗体制 剂也是多种抗体的混合物.故称多克隆抗体， 即针 对多种抗原决定 簇的抗体。这些抗体制剂在应用过程中经常发生非特异性交叉反应 而出现假阳 性结果，必须经多次吸收试验才能得到所谓的精制单价 血清，用于临床病原学诊断，如痢疾杆菌 属诊断血清和沙门氏菌属 诊断血清等。虽然称为精制单价血清，但仍然难免出现假阳性结果; 而且其产量很低.很难满足临床治疗和诊断上的需要。
因此，抗体是指能与相应抗原特异性综合的具有免疫功能的球 蛋白。它是机体免疫系统受 抗原物质刺激后，B淋巴细胞被活化、 增殖和分化为浆细胞，由浆细胞合成和分泌的球蛋白。20 世纪60年 代初期.发现多发性骨髓瘤是浆细胞癌变形成的恶性增殖性疾病。患 者血清中也出现 同抗体分子结构类似的球蛋白。因此，将具有抗体 活性及化学结构与抗体相似的球蛋白统称为 免疫球蛋白 (immunoglobulin，Ig)。 显然，Ig是化学结构上的概念，而抗体是生物学功能上的概 念。也 就是说，所有抗体均是Ig，但并非所有Ig分子都具有抗体活性。由 于病原微生物是含有 多种抗原决定簇的抗原物质，因此这些抗体制 剂也是多种抗体的混合物.故称多克隆抗体， 即针 对多种抗原决定 簇的抗体。这些抗体制剂在应用过程中经常发生非特异性交叉反应 而出现假阳 性结果，必须经多次吸收试验才能得到所谓的精制单价 血清，用于临床病原学诊断，如痢疾杆菌 属诊断血清和沙门氏菌属 诊断血清等。虽然称为精制单价血清，但仍然难免出现假阳性结果; 而且其产量很低.很难满足临床治疗和诊断上的需要。
抗体制药最新PPT课件
第三节 杂交瘤细胞系的建立
一、免疫B淋巴细胞的制备
1. 抗原 凡是能具有抗原性质的物质均可制备单 克隆抗体，抗原可以是全病毒、亚单位 或纯化分子，也可以是蛋白质、多糖、 脂类等
用于制备单克隆抗体的抗原在理论上讲， 纯度要求就可以不高，也可以使混合抗 原
2. 免疫
动物的选择 目 前 常 用 的 骨 髓 瘤 细 胞 系 来 自 BALB/c 小 鼠和Lou大鼠 免疫方法 A. 体内免疫法 B. 脾内免疫法 C. 体外免疫法
所有抗体混合
31 2 4
BA LB /c
1234
脾脏 淋巴結 B 細胞
31 2 4
二、杂交瘤及杂交瘤技术
细胞杂交的含义包括同一细胞的自融合 或是在诱导物的作用下不同细胞间的融 合 淋巴细胞通过融合剂的作用和肿瘤细胞 形成融合的杂交细胞称杂交瘤细胞 通过肿瘤细胞和淋巴细胞的融合，用于 某些细胞特性的研究和生产所期望的免 疫分子，称为杂交瘤技术
二、 骨髓瘤细胞的选择
在B淋巴细胞杂交瘤技术中，主要是用多 发性骨髓瘤细胞作为亲本细胞，这种细 胞是来自骨髓造血细胞的一种肿瘤，分 泌单一抗体的浆细胞，并且衰变成不表 达自身抗体或部分表达 常见的骨髓瘤亲本细胞系有Sp2/0，NS-1， Y3，YB2
三、 免疫脾细胞的制备
经免疫的BABL/c小鼠或Lou大鼠，摘眼 球、断颈等方法处死后，无菌摘取脾脏， 研磨制取B淋巴细胞悬液，经氯化铵破碎 红细胞后，洗涤并调整到（1～5）X107 个／ml浓度备用
六、杂交瘤细胞的克隆和建株
1. 杂交瘤细胞的克隆化
2. 杂交瘤细胞系建株
七、单克隆抗体的制备
1. 动物体内诱生法
2. 体外培养法
八、单克隆抗体生产的一般流程
生物化学4抗体制药ppt课件
2. Fv与单链抗体（single chain Fv，ScFv ）
（1）Fv （可变区片断）
VL、VH非共价键结合（单价） 完整抗体的1/6 基因工程重组生产 易解离
（2）ScFv
常用连接肽：(Gly4Ser)3
优点： • 分子量小（1/6），免疫原性低 • 容易进入瘤体组织 • 无Fc，免疫诊断成像清晰，本底低 • 单链容易改造 • 可采用大肠杆菌大量生产
骨髓瘤细胞： 自身不合成或不分泌任何免疫球蛋白分子或片断。 HGPRT-（次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶）
融合过程： 取脾细胞（1*108）与骨髓瘤细胞（2*107~3*107）
进行混合，在PEG作用下诱导它们融合，时间控制在 2min以内，然后用培养液将PEG融合液缓慢稀释 。
HAT选择性培养基培养
动物细胞核苷酸合成两条途径：
全合成途径、补救合成途径
氨基喋呤（Aminopterine，A）为四氢叶酸的结构类似物，能够和 二氢叶酸还原酶（能够将二氢叶酸还原生成四氢叶酸）发生不可逆结 合，阻止了四氢叶酸（核苷酸生物合成的甲基供体）的生成。从而阻 断了阻断GMP、TMP的生物合成。
GMP、TMP的补救合成途径：
离心或过滤
IgG
亲和层析
超滤
4.3 基因工程抗体
互补性决定区 (CDR， complementar ity determinant region) 骨架区（FR, frame region）
Vk1
一、嵌合抗体（chimeric antibody）
将鼠源单克隆抗体 可变区和人抗体恒定区 连接起来的抗体。
根据Ig的类和亚类以及用途选择不同的纯化方法： • 体外诊断试剂IgG类-----沉淀处理+亲和层析 • IgM类------沉淀处理+凝胶过滤 • 体内诊断试剂或治疗用药-----亲和层析+阴离子交换层析
4.抗体制药
放射性核素标记单抗进行肿瘤显像，做免疫 定位诊断。
CD3单抗作为免疫抑制剂对器官移植免疫排 斥有抑制作用。
以单克隆抗体作为载体的药物对肿瘤进行定 向治疗。
单克隆抗体
➢ McAb在免疫导向疗法中存在的问题
A、McAb均是鼠源性抗体，应用于人体内可产生人抗鼠抗 体（HAMA），加速了排斥反应，在人体内的半衰期只有 5~6h，维持有效药物作用靶组织时间；
抗体制药
第一节 概述
1890年Behring和北里柴三郎发现 白喉抗毒素,建立了血清疗法,开创了 抗体制药。
1937年Tiselius用电泳法将血清蛋
白分离为白蛋白、α、β、γ球蛋白，并
证明抗体活性主要存在于γ球蛋白组分。
抗体制药
抗体是指能与相应抗 原特异性结合具有免疫功 能的球蛋白。
抗体的产生：机体免 疫系统受抗原刺激后，B 淋巴细胞被活化增殖和分 化为浆细胞，由浆细胞合 成和分泌的球蛋白。
抗体制药
5类在结构和功能上不同的Ig
由长寿的T细胞和B细胞记忆
➢ 注射抗原 → IgM → IgG（>10d，IgM↓）
初级免疫反应
➢IgA：唾液、肺、肠道等的分泌液。 ➢IgE：存在于已结合抗原的组织中。 ➢IgD：成熟的B淋巴细胞表面。
抗体制药
抗体药物
● 至2000年底，在美国药品市场上生物技术药物 有76种，其中抗体药物有15种。
1
抗原決定基
● 若有许多抗原決定基，则需许多株 B 細胞分別生产许多抗体。
Y
B
2
B
3
12
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B
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抗原
单克隆抗体
1 3
2 4
m m
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CD3单抗作为免疫抑制剂对器官移植免疫排 斥有抑制作用。
以单克隆抗体作为载体的药物对肿瘤进行定 向治疗。
单克隆抗体
➢ McAb在免疫导向疗法中存在的问题
A、McAb均是鼠源性抗体，应用于人体内可产生人抗鼠抗 体（HAMA），加速了排斥反应，在人体内的半衰期只有 5~6h，维持有效药物作用靶组织时间；
抗体制药
第一节 概述
1890年Behring和北里柴三郎发现 白喉抗毒素,建立了血清疗法,开创了 抗体制药。
1937年Tiselius用电泳法将血清蛋
白分离为白蛋白、α、β、γ球蛋白，并
证明抗体活性主要存在于γ球蛋白组分。
抗体制药
抗体是指能与相应抗 原特异性结合具有免疫功 能的球蛋白。
抗体的产生：机体免 疫系统受抗原刺激后，B 淋巴细胞被活化增殖和分 化为浆细胞，由浆细胞合 成和分泌的球蛋白。
抗体制药
5类在结构和功能上不同的Ig
由长寿的T细胞和B细胞记忆
➢ 注射抗原 → IgM → IgG（>10d，IgM↓）
初级免疫反应
➢IgA：唾液、肺、肠道等的分泌液。 ➢IgE：存在于已结合抗原的组织中。 ➢IgD：成熟的B淋巴细胞表面。
抗体制药
抗体药物
● 至2000年底，在美国药品市场上生物技术药物 有76种，其中抗体药物有15种。
1
抗原決定基
● 若有许多抗原決定基，则需许多株 B 細胞分別生产许多抗体。
Y
B
2
B
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B
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抗原
单克隆抗体
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抗 体 制
药 第四章 抗体制药1
学习内容（一）
1、抗体制药概述 2、单克隆抗体制备的基本过程。 3、基因工程抗体。
第一节 概 述
♠1890年Behring和北里柴三郎发现白喉抗毒素, 建立了血清疗法,开创了抗体制药。
♠ 1937年Tiselius用电泳法将血清蛋白分离为白 蛋白、α、β、γ球蛋白，并证明抗体活性主要 存在于γ球蛋白组分。
1、抗原与动物免疫 制备特定抗原的单克隆抗体，首先要制备用于 免疫的适当抗原，再用抗原进行动物免疫。 有的抗原可以用化学合成：地高辛 多数抗原物为混合物须经免疫、筛选、克隆化。
为使杂交瘤细胞稳定，免疫动物和骨髓瘤细胞 供体同一品系动物进行免疫。
目前常用的骨髓瘤细胞系多来自BALB/c小 鼠和 LOU大鼠，因此免疫动物也采用相应的品 系。
第二节 McAb及制备
一、 McAb
1、McAb定义
是由一个杂交瘤细胞及其后代所产生的针对一个 抗原决定簇的高度特异性和专一性的抗体。
2、McAb怎样产生？
是将抗体产生细胞与具有无限增殖能力的骨髓瘤 细胞相融合，通过有限稀释法及克隆化使杂交瘤 细胞成为纯一的单克隆细胞系而产生的。
二、McAb的制备
♠70年代中期，日本利根川进证实了Ig的基因结 构，获得1987年的the Nobel prize。
抗体？ 是指能与相应抗原特异性结合具有免疫功 能的球蛋白。 抗体的产生？ 机体免疫系统受抗原刺激后，B淋巴细胞被 活化增殖和分化为浆细胞，由浆细胞合成 和分泌的球蛋白。
20世纪60年代发现多发性骨髓瘤是浆细胞 癌变形成的恶性增殖性疾病。病人血清中 出现同抗体结构类似的球蛋白， 统称为免 疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）。所以Ig 是化学结构的概念，而抗体是生物学功能 的概念。
一般再采脾细胞前3日由静脉注射最后一次抗 原，刺激B细胞分裂。
脾内免疫法即在麻醉下直接将0.1～0.2ml抗原 注入脾脏进行免疫。细胞抗原需105个，可溶 性抗原需10μg。
体外免疫法用于不能采用体内免疫的情 况下，如制备人源性单克隆抗体；免疫 源性极弱，易引起免疫抑制。
优点：需抗源量少，免疫期短，干扰因 素少。
软琼脂法：在培养液中加入0.5%的琼脂糖凝胶，细胞 分裂后形成小球样团块，由于培养基是半固体状态， 可用吸管吸出，移入96孔板培养。
4、杂交瘤细胞与抗体性状的鉴定
杂交瘤细胞鉴定：染色体分析。它是鉴 定的客观指标，了解分泌抗体的能力。 单抗进行Ig类和亚类鉴定： 用羊或兔抗Ig不同类或亚类抗体，进行 免疫扩散或ELISA鉴定。 亲和力、特异性、纯度、分子量测定。
免疫方法
采用体内免疫法和体外免疫法。 体内免疫法适用于免疫原性强、抗原量较
多时应用，一般用8～12周龄雌性鼠。 颗粒性抗原（如细菌细胞抗原）的免疫原
性强，可不加佐剂，直接注入腹腔10个细胞进 行初次免疫，间隔1～3周，再追加免疫1～2次。
可溶性抗原按每只小鼠10～100 μg抗原与福氏 完全佐剂等量混合后注入腹腔内，进行初次免 疫，间隔2～4周，再用不加佐剂原抗原追加免 疫1～2次。
杂交瘤细胞与抗体性状的鉴定—染色体分析 正常鼠的脾细胞染色体数：40，全部为端着丝粒。 小鼠骨髓瘤细胞染色体：SP2/0细胞为62~68，NS-1 为54~64，大多数为非整倍性，有中部和亚中部着丝 点。
杂交瘤细胞的染色体数目：接近两亲本细胞染色体数 目的总和，在结构上多数为端着丝粒染色体外，还应 出现少数标志染色体。
3、筛选阳性克隆与克隆化
筛选阳性克隆常用检测方法： 免疫酶技术、免疫荧光技术、放射免疫技 术等。 克隆化是指单个细胞通过无性繁殖而获得 细胞集团的整个培养过程。
常用的克隆化方法：有限稀释法和软琼脂法。
有限稀释法：把杂交瘤细胞悬液稀释后，加入到96孔 板，使每孔中在理论上只含有一个细胞。第一次克隆 化时也要应用HT培养液，以后的克隆化可用不含HT 的RPMI 1640培养液。
多克隆抗体 polyclonal antibody
指由不同B细胞克隆产生的针对抗原物质中多种抗原 决定簇的多种抗体混合物。如:免疫血清（含多种特异 性抗体）。 实际意义： （1）预防、治疗感染性疾病，
如：破伤风抗毒素血清 抗破伤风， 副作用：超敏反应
（2）临床诊断， 如：肥达氏反应 -- 伤寒、副伤寒 缺点：特异性差。
体外免疫法：用4～8周龄BALB/c小鼠的脾 脏制成单细胞悬液，再加入适当抗原使其
浓度达0.5～5μg/ml,在5% CO237 C 下培养 4～5天,再分离脾细胞,进行细胞融合。
2、细胞融合与杂交瘤细胞的选择性培养
细胞融合的方法 脾细胞（1×108） 骨髓瘤细胞（2～3×107）混合 聚乙二醇诱导下融合，2分钟，然后用培 养液将融合液缓慢稀释。
抗原 免疫
传统抗血清 所有抗体混合
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BA LB /c
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脾脏 淋巴結 B 细胞
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单克隆抗体 monoclonal antibody，McAb
1975年Kohler和Milstein首先利用B淋巴细胞杂 交瘤技术制备出单克隆抗体。 单克隆抗体具有高度特异性、均一性、来源稳 定、可大量生产等特点，为抗体制备和应用提 供了全新的手段，还促进了基础和临床医学的 发展。
用于细胞融合的骨髓瘤细胞应具有融合率高，自身不 分泌抗体，所产生的杂交瘤细胞分泌抗体能力强，长 期稳定。 细胞融合后可产生多种融合 脾-脾、脾-瘤、瘤-瘤融合细胞 如何去除脾-瘤以外的融和细胞？
选择性培养 －脾-瘤培养基为HAT培养液。 次黄 嘌呤(H)氨甲喋呤(A)胸腺嘧啶(T)配制。 A阻断DNA合成。
P25
PEG的相对分子质量和浓度越大，其促融和率越 高。但其黏度和对细胞的毒性也随之增大。常用 浓度为40%~50%，相对分子质量4000为佳。相对 分子质量在400~6000，浓度在10%~60%范围内 的PEG都能使细胞发生融合。为了提高融合率， 在PEG 溶液中加入DMSO，以提高细胞接触的紧 密性，增加融合率。但必须严格限制接触时间。
抗 体 制
药 第四章 抗体制药1
学习内容（一）
1、抗体制药概述 2、单克隆抗体制备的基本过程。 3、基因工程抗体。
第一节 概 述
♠1890年Behring和北里柴三郎发现白喉抗毒素, 建立了血清疗法,开创了抗体制药。
♠ 1937年Tiselius用电泳法将血清蛋白分离为白 蛋白、α、β、γ球蛋白，并证明抗体活性主要 存在于γ球蛋白组分。
1、抗原与动物免疫 制备特定抗原的单克隆抗体，首先要制备用于 免疫的适当抗原，再用抗原进行动物免疫。 有的抗原可以用化学合成：地高辛 多数抗原物为混合物须经免疫、筛选、克隆化。
为使杂交瘤细胞稳定，免疫动物和骨髓瘤细胞 供体同一品系动物进行免疫。
目前常用的骨髓瘤细胞系多来自BALB/c小 鼠和 LOU大鼠，因此免疫动物也采用相应的品 系。
第二节 McAb及制备
一、 McAb
1、McAb定义
是由一个杂交瘤细胞及其后代所产生的针对一个 抗原决定簇的高度特异性和专一性的抗体。
2、McAb怎样产生？
是将抗体产生细胞与具有无限增殖能力的骨髓瘤 细胞相融合，通过有限稀释法及克隆化使杂交瘤 细胞成为纯一的单克隆细胞系而产生的。
二、McAb的制备
♠70年代中期，日本利根川进证实了Ig的基因结 构，获得1987年的the Nobel prize。
抗体？ 是指能与相应抗原特异性结合具有免疫功 能的球蛋白。 抗体的产生？ 机体免疫系统受抗原刺激后，B淋巴细胞被 活化增殖和分化为浆细胞，由浆细胞合成 和分泌的球蛋白。
20世纪60年代发现多发性骨髓瘤是浆细胞 癌变形成的恶性增殖性疾病。病人血清中 出现同抗体结构类似的球蛋白， 统称为免 疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）。所以Ig 是化学结构的概念，而抗体是生物学功能 的概念。
一般再采脾细胞前3日由静脉注射最后一次抗 原，刺激B细胞分裂。
脾内免疫法即在麻醉下直接将0.1～0.2ml抗原 注入脾脏进行免疫。细胞抗原需105个，可溶 性抗原需10μg。
体外免疫法用于不能采用体内免疫的情 况下，如制备人源性单克隆抗体；免疫 源性极弱，易引起免疫抑制。
优点：需抗源量少，免疫期短，干扰因 素少。
软琼脂法：在培养液中加入0.5%的琼脂糖凝胶，细胞 分裂后形成小球样团块，由于培养基是半固体状态， 可用吸管吸出，移入96孔板培养。
4、杂交瘤细胞与抗体性状的鉴定
杂交瘤细胞鉴定：染色体分析。它是鉴 定的客观指标，了解分泌抗体的能力。 单抗进行Ig类和亚类鉴定： 用羊或兔抗Ig不同类或亚类抗体，进行 免疫扩散或ELISA鉴定。 亲和力、特异性、纯度、分子量测定。
免疫方法
采用体内免疫法和体外免疫法。 体内免疫法适用于免疫原性强、抗原量较
多时应用，一般用8～12周龄雌性鼠。 颗粒性抗原（如细菌细胞抗原）的免疫原
性强，可不加佐剂，直接注入腹腔10个细胞进 行初次免疫，间隔1～3周，再追加免疫1～2次。
可溶性抗原按每只小鼠10～100 μg抗原与福氏 完全佐剂等量混合后注入腹腔内，进行初次免 疫，间隔2～4周，再用不加佐剂原抗原追加免 疫1～2次。
杂交瘤细胞与抗体性状的鉴定—染色体分析 正常鼠的脾细胞染色体数：40，全部为端着丝粒。 小鼠骨髓瘤细胞染色体：SP2/0细胞为62~68，NS-1 为54~64，大多数为非整倍性，有中部和亚中部着丝 点。
杂交瘤细胞的染色体数目：接近两亲本细胞染色体数 目的总和，在结构上多数为端着丝粒染色体外，还应 出现少数标志染色体。
3、筛选阳性克隆与克隆化
筛选阳性克隆常用检测方法： 免疫酶技术、免疫荧光技术、放射免疫技 术等。 克隆化是指单个细胞通过无性繁殖而获得 细胞集团的整个培养过程。
常用的克隆化方法：有限稀释法和软琼脂法。
有限稀释法：把杂交瘤细胞悬液稀释后，加入到96孔 板，使每孔中在理论上只含有一个细胞。第一次克隆 化时也要应用HT培养液，以后的克隆化可用不含HT 的RPMI 1640培养液。
多克隆抗体 polyclonal antibody
指由不同B细胞克隆产生的针对抗原物质中多种抗原 决定簇的多种抗体混合物。如:免疫血清（含多种特异 性抗体）。 实际意义： （1）预防、治疗感染性疾病，
如：破伤风抗毒素血清 抗破伤风， 副作用：超敏反应
（2）临床诊断， 如：肥达氏反应 -- 伤寒、副伤寒 缺点：特异性差。
体外免疫法：用4～8周龄BALB/c小鼠的脾 脏制成单细胞悬液，再加入适当抗原使其
浓度达0.5～5μg/ml,在5% CO237 C 下培养 4～5天,再分离脾细胞,进行细胞融合。
2、细胞融合与杂交瘤细胞的选择性培养
细胞融合的方法 脾细胞（1×108） 骨髓瘤细胞（2～3×107）混合 聚乙二醇诱导下融合，2分钟，然后用培 养液将融合液缓慢稀释。
抗原 免疫
传统抗血清 所有抗体混合
31 2 4
BA LB /c
1234
脾脏 淋巴結 B 细胞
31 2 4
单克隆抗体 monoclonal antibody，McAb
1975年Kohler和Milstein首先利用B淋巴细胞杂 交瘤技术制备出单克隆抗体。 单克隆抗体具有高度特异性、均一性、来源稳 定、可大量生产等特点，为抗体制备和应用提 供了全新的手段，还促进了基础和临床医学的 发展。
用于细胞融合的骨髓瘤细胞应具有融合率高，自身不 分泌抗体，所产生的杂交瘤细胞分泌抗体能力强，长 期稳定。 细胞融合后可产生多种融合 脾-脾、脾-瘤、瘤-瘤融合细胞 如何去除脾-瘤以外的融和细胞？
选择性培养 －脾-瘤培养基为HAT培养液。 次黄 嘌呤(H)氨甲喋呤(A)胸腺嘧啶(T)配制。 A阻断DNA合成。
P25
PEG的相对分子质量和浓度越大，其促融和率越 高。但其黏度和对细胞的毒性也随之增大。常用 浓度为40%~50%，相对分子质量4000为佳。相对 分子质量在400~6000，浓度在10%~60%范围内 的PEG都能使细胞发生融合。为了提高融合率， 在PEG 溶液中加入DMSO，以提高细胞接触的紧 密性，增加融合率。但必须严格限制接触时间。