质粒小量提取
质粒小量抽提
质粒小量抽提1、UNIQ-10柱式质粒小量抽提试剂盒（上海生工）(1)将过夜培养的菌液12000rpm离心15s，彻底去除上清；加500μl 1×STE（或1×PBS）重悬菌体，12000rpm离心15s，彻底去除上清；(2)加入100μl Solution I，用枪头或振荡器充分悬浮细菌；注1：如果不能够充分悬浮，呈现团块状，会使得细菌裂解不完全，降低产量；注2：此时可先将ddH2O放入60℃水浴进行预热。
(3)加入200μl Solution II，立即温和混匀（倾斜45°角，顺一个方向，慢慢旋转离心管），使细菌裂解，室温放置2min；注1：不能剧烈混合，否则会出现基因组DNA污染。
加入溶液Solution II进行裂解的时间，不要超过5min，以溶液由浑浊变清，同时变粘为裂解完全的标志；注2：天气冷时，Solution II中的SDS会析出，故需要将其预热至清澈无沉淀。
(4)加入350μl Solution III，立即上下颠倒5~10次，使之充分中和，室温放置5min；注：如果混有RNA，说明RNaseA处理不彻底，请减少菌体用量或加入Solution III 后室温延长放臵时间5-10min。
(5)12000rpm，离心10min；注：离心后溶液应为澄清的，如果还混有微小蛋白悬浮物可再次离心，并延长离心时间，待完全沉淀蛋白后再取上清到吸附柱中。
实际试验中，可以在室温以最高速（16000rpm）离心10-15min。
(6)将步骤(5)中上清转移到套放于2.0-ml收集管内的UNIQ-10柱中，室温放置2min，8000rpm室温离心30s；注：不要吸取到沉淀，否则会出现基因组DNA和蛋白质污染。
(7)弃收集管中的废液，将UNIQ-10柱放入同一收集管中，吸取500μl Wash Solution到UNIQ-10柱，10000rpm室温离心1min；(8)重复步骤(7)；(9)弃收集管中的废液，将UNIQ-10柱放入同一收集管中，12000rpm室温离心2min，以彻底去除Wash Solution；注：将离心后的UNIQ-10柱放入恒温箱中50℃干燥5min，或自然晾干10min，有助于酒精的挥发，提高DNA的洗脱效率。
小量提取质粒
Protocol小量提取质粒DNA：1. 准备：灭1.5 ml离心管、牙签、试管。
准备溶液STET（加溶菌酶）、异丙醇、1×TEwith RNase（pH8.0）。
灭过菌的试管每根分2 ml培养液2. 连接产物转化涂板，放于37 ℃中培养12－18 h，取出，挑取单克隆，放于试管中，于37 ℃摇床培养8-12 h。
3. 将摇好的菌到入灭好的1.5 ml离心管中，离心8000 rpm，30 s。
4. 弃上清，到扣于吸水纸上控干。
5. 加入250 μl STET(STET: Lysozyme 10:1)，震荡重悬。
6. 置于100 ℃中煮1.5－3 min（时间视菌量而定），离心13500 rpm，5 min。
7. 用灭好菌的牙签挑去管底粘稠状蛋白。
8. 加250 μl异丙醇，颠倒混匀后，离心13500 rpm，5 min。
9. 去上清，放于吸水纸上控干，约10 min左右。
10. 加TE （TE: RNase 1000:1）20-50μl（视沉淀量而定）。
中量提取质粒DNA：1. 准备：灭菌：1.5 ml EP管，烧瓶，50 ml离心管。
准备溶液：P1、P2、P3、异丙醇、5 M 盐酸胍、1×TE（pH 8.0）、new wash。
2. 从培养好的平板上挑取单克隆，烧瓶置于37 ℃摇床培养12-18 h。
3). 将培养好的菌液到入灭好50 ml离心管中，离心4500 rpm，5 min。
4). 弃上清，控干。
加1.5 ml P1（P1: RNase 100:1）震荡重悬，加1.5 ml P2颠倒混匀（操作轻缓。
混匀后可见溶液澄清粘稠），加1.5 ml P3颠倒混匀（P2和P3之间反应时间不要超过5 min。
混匀后可见絮状沉淀）。
5. 将溶液分装到1.5 ml管中，离心13500 rpm，5 min。
6. 将每管上清分到两管中，在新管中加入750 μl异丙醇，颠倒混匀多次，离心13500 rpm，5 min。
碱裂解法质粒小量提取_文档
一碱裂解法质粒小量提取试验原理：碱裂解法是较常用的提取的方法。
其优点是收获率高，适于多数的菌株，所得产物经纯化后可满足多数的DNA重组操作。
十二烷基磺进行质粒的小量制备。
十二烷基磺酸钠（SDS）是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性。
用SDS处理细菌后，会导致细菌细胞破裂，释放出质粒DNA 和染色体DNA，两种DNA在强碱环境都会变性。
由于质粒和主染色体的拓扑结构不同，变性时前者虽然两条链分离，却仍然缠绕在一起不分开；但后者完全变性分甚至出现断裂，因此，当加入pH4.8的酸性乙酸钾降低溶液pH值，使溶液pH值恢复较低的近中性水平时，质粒的两条小分子单链可迅速复性恢复双链结构，但是主染色体DNA则难以复性。
在离心时，大部分主染色体与细胞碎片，杂质等缠绕一起被沉淀，而可溶性的质粒DNA留在上清夜中。
再由异丙醇沉淀、乙醇洗涤，可得到纯化的质粒DNA。
碱裂解法提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析等。
仪器与主要试剂主要试剂：溶液I：50 mmol/L葡萄糖10 mmol/L EDTA25 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)溶液II：200 mmol/L NaOH 1% SDS溶液III：3 mol/L NaAc (pH4.8)溶液酚氯仿异丙醇（25：24：1）95%乙醇%70乙醇TE缓冲液：10 mmol/L Tris-HCl ,pH 7.5 1 mmol/L EDTARNaseA方法：1．将大肠杆菌菌落挑取一环接种在含有2毫升加入抗菌素的LB液体培养基的10毫升试管里，37℃振培过夜，16～18小时2．转移以上菌液1.5毫升于EP管中，8000rpm离心30秒3．小心去除上清，并用吸水纸吸干残余液体，再将沉淀物在振荡器上振匀4．加入溶液I 100μl，盖紧EP管盖，翻转数次，冰上放置10分钟5．加入溶液II 200μl，温和翻转EP管5次(可观察到溶液逐步由混浊变为透明)，冰上放置5分钟6．加入溶液III 150μl，将EP管盖紧后累累来回翻转23次，混匀后冰上放置20分钟7．12000rpm离心15分钟8．将上清转移到另一个EP管中(吸取时不可吸入底部的沉淀)。
质粒DNA的小量快速提取(碱裂解法) S2517实验室 第三组
Tris-HCl：三（羟甲基）氨基甲烷；氨丁三醇；缓血酸铵；三羟甲基氨基 甲烷。在这里，Tris缓冲液主要是做核酸和蛋白质的溶剂。
EDTA：四乙酸二氨基乙烷（二氨基乙烷四乙酸），又叫托立龙、依 地酸。EDTA 是一种重要的络合剂。EDTA用途很广，可用作彩色感 光材料冲洗加工的漂白定影液，染色助剂，纤维处理助剂，化妆品添 加剂，血液抗凝剂，稳定剂，合成橡胶聚合引发剂，EDTA是螯合剂 的代表性物质。能和碱金属、稀土元素和过渡金属等形成稳定的水溶 性配合物。在这里主要作用是降低细胞膜的稳定性。
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溶液二的作用是使细菌细胞壁破裂释放内容物，核酸和蛋白质在碱 性条件下变性。溶液需要新鲜配制。
溶液三的作用是使pH恢复中性，质粒DNA复性，而染色体DNA与 蛋白质-SDS复合物形成白色沉淀。溶液三使用前需用冰预冷。
2.实验中加入酚-氯仿、无水乙醇、70%乙醇和RNaseA的作用分别 是什么？
酚——变性蛋白质； 氯仿——萃取溶液中的酚； 无水乙醇（2倍体积）——沉淀质粒DNA； 70%乙醇——洗涤质粒DNA沉淀，除去沉淀中的盐分； RNase A—— 对RNA有水解作用
2.氨苄西林 100 mg/mL。
3.溶液一 50 mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris-HCl (pH 8.0) , 10mmol/L EDTA (pH 8.0)。
4.溶液二 （新鲜配制） 0.2mol/L NaOH , 1％ SDS。 5.溶液三 0.5mol/L醋酸钾60 mL , 冰醋酸11.5 mL ，H2O 28.5 mL。 6.酚/氯仿 将酚和氯仿等体积混合，用Tris-HCl平衡至pH 7.6 ， 置于 棕色瓶中4℃保存。 7.TE缓冲液（pH 8.0) 10mol/L Tris-HCl (pH 8.0) , 1mmol/L EDTA 8.RNase A (10 mg/mL)。 9.70%乙醇、无水乙醇。
质粒DNA的小量制备
质粒DNA的小量制备准备工作：细菌培养：挑取单菌落，接种到3-5ml适宜的液体培养基(如氨苄青霉素抗性的标准LB培养基)中，37℃震荡培养过夜。
注：（1）最好在细菌的对数生长晚期时提取。
过早则质粒得率太低，过晚则会有杂菌污染，或得到的质粒杂质太多，影响其后的酶切、电泳等处理；（2）某些严紧型质粒(如pBR322)需要在进入对数生长中期后，在细菌培养物中加入氯霉素继续培养，以提高产量。
具体步骤：1、细菌的收获：将1.5ml菌液倒入微量离心管中，12000g离心30秒，吸去培养液。
上清要务必吸取干净，否则会影响质粒的质量。
必要时可以离心2次。
2、将细菌沉淀重悬于150μl用冰预冷的溶液Ｉ中，加入1/50体积RNaseA贮存液，剧烈振荡，使之完全分散。
溶液Ｉ：50mmol/L葡萄糖，25mmol/LT ris•Cl(pH8.0)，10mmol/LEDT A(pH8.0)不含DNA酶的RNaseA：10mg/ml，TE配制，煮沸15~30min，-20℃分装贮存注：（1）溶液Ｉ高压蒸气灭菌后，贮存于4℃；（2）葡萄糖可以由NaCl代替，以利于储存；但提取大于15kb的质粒，应将细菌悬于等渗蔗糖溶液中，并用溶菌酶处理；（3）务必使细菌沉淀完全分散，以利于碱液作用充分；（4）震荡时可以在离心管中加入牙签或枪头，提高效率；（5）配制RNaseA贮存液时，煮沸时间不宜过长或过短；（6）溶液Ｉ每2个月重新配制1次。
3、加200μl溶液Ⅱ，颠倒混匀。
溶液Ⅱ：0.2mol/LNaOH，1%SDS注：（1）若菌体裂解得充分，则溶液会变得很粘稠；（2）不要剧烈震荡，否则会混入基因组DNA；（3）每2个月重新配制1次。
4、加150μl用冰预冷的溶液Ⅲ，轻微震荡混匀溶液Ⅲ：5mol/Ｌ乙酸钾60ml，冰乙酸11.5ml，水28.5ml注：（1）所配成的溶液对钾是3mol/L，对乙酸根是5mol/L，pH4.8左右；（2）尽量不要有大的块状沉淀，以利于下步离心；（3）每1个月重新配制1次，并分装贮存于小口瓶中。
质粒小提的原理和提取过程中的注意事项
质粒小提的原理和提取过程中的注意事项质粒小提是一种常用的实验方法，用于从细菌中提取质粒DNA。
其原理和提取过程中有一些注意事项，下面是详细介绍。
质粒小提的原理：质粒小提的原理是利用离心法将大量细菌聚集在一起，然后使用碱解液溶解细菌细胞壁和膜，将质粒DNA释放到溶液中。
接下来，通过加入特定的盐和有机溶剂，将质粒DNA与其他细胞成分分离开来。
最后，通过离心将质粒DNA沉淀下来，即完成了质粒小提。
质粒小提的提取过程中的注意事项：1.使用无菌操作：在整个提取过程中，确保使用无菌操作，以防止外源性DNA的污染。
使用无菌平台和器具，并且在实验室操作台上清洁表面。
2.选择适当的细菌培养基：选择适当的培养基和条件来培养细菌，以获得最佳的质粒DNA产量。
选择含有适当选择抗生素的培养基，以确保只有含有目标质粒的细菌生长。
3.对细菌进行预处理：在提取过程之前，对细菌进行适当的预处理是很重要的。
通常，细菌应该处于对质粒DNA产生最佳条件的生长阶段。
此外，使用良好的细菌培养方法，以确保质粒DNA在细菌中的稳定和延长拷贝数。
4.合理选择裂解液：选择适当的裂解液可以有效地裂解细菌细胞壁和膜，释放质粒DNA。
常用的裂解液包括碱、酶和界面活性剂。
根据不同的细菌类型和质粒特性，选择合适的裂解液方法。
5.应用适当的离心条件：离心是质粒小提过程中一个非常重要的步骤，可以将质粒DNA与其他组分分离开来。
确定适当的离心速度和离心时间，以确保质粒DNA能够沉淀下来，并且去除其他细胞残留物。
6.保存提取的质粒DNA：提取到的质粒DNA需要正确保存，以避免降解和污染。
使用无菌的保存管和适当的缓冲液，如TE缓冲液，在低温（通常-20°C）下保存质粒DNA。
以上是质粒小提的原理和提取过程中的注意事项的详细介绍。
在操作过程中要严格控制操作条件，以获得高质量的质粒DNA。
1_质粒的小量提取
质粒的小量提取（碱裂解法）1.取过夜培养的菌液1ml于1.5ml EP管中，4℃，12000rpm离心5min，弃上清；再加1ml菌液，12000rpm离心5min，弃上清；如此反复操作，收集菌体2~3次；并用枪头吸尽剩余培养基。
2.加预冷的溶液I 150μl，用枪头混匀，放到冰上。
3.加新配置的溶液II 300μl，轻柔混匀4~5次（不可剧烈震荡，防止DNA断裂）；放置于冰上至清亮，一般不超过5min。
4.加预冷溶液III 225μl，形成絮状沉淀，反复颠倒，彻底混匀；冰浴10min，使之充分沉淀。
5.4℃，12000rpm，离心10min，将上清约600μl转至新EP管（注意不要吸走沉淀）。
6.加600μl酚:氯仿:异戊醇，抽提5min；4℃，12000rpm离心5min，取上清约400μl~500μl，转至新EP管。
7.加500μl氯仿:异戊醇，抽提10min，4℃，12000rpm离心10min，取上清约300μl转至新EP管。
8.加2倍体积-20℃预冷的无水乙醇，混匀后，-20℃静置1h。
9.4℃，12000rpm离心15min，弃上清。
10.沉淀用1ml 70% 乙醇洗涤，12000rpm离心6min；并将沉淀在室温中晾干。
11.加20μl无菌水回溶（如不进行酶切，PCR等后续实验，可用TE回溶，以长期保存质粒DNA）。
12.加入1μl Rnase，37℃温育10min；13.0.8%琼脂糖凝胶电泳。
溶液的配制【LB培养基】胰蛋白胨10g/L酵母提取物5g/LNaCl 10g/L琼脂（固体时加入） 1.5g/100ml【Tris-HCl】：1M，Ph=8.0；MW：121.14灭菌Tris 121.14gH2O 800mlHCl 调pH=8.0H2O 定容至1000mlTotal：1000ml【NaOH】：10M，MW：40NaOH 200gH2O 450mlH2O 定容至500mlTotal：500ml【EDTA】：0.2M，pH=8.0，MW：372.24灭菌EDTA 74.448gH2O 800mlNaOH 5ml，调pH=7.6H20 定容至1000mlTotal：1000ml【SDS】：10%灭菌SDS 10gH2O 定容至100mlTotal：100ml【溶液I】灭菌葡萄糖0.49gTris-HCl（1M，pH=8.0） 1.25mlEDTA（0.2M，pH=8.0） 2.5mlH2O 定容至50mlTotal：50ml【溶液II】：现用现配ddH2O（先加） 1.32mlSDS（10%）150μlNaOH（10M）30μlTotal：1.5ml【溶液III】：在通风橱中进行灭菌KAc 14.7g冰乙酸 5.75mlH2O 溶解后定容至50mlTotal：50ml【TE】Tris-HCl（1M，pH=8.0）10μlEDTA（0.2M，pH=8.0）5μl无菌水983μlTotal：1ml【酚:氯仿:异戊醇】(静置过夜后使用)Tris饱和酚、三氯甲烷、异戊醇，体积比：25:24:1【氯仿:异戊醇】(静置过夜后使用)三氯甲烷、异戊醇，体积比：24:1【Rnase】10mg/ml-20℃保存【Loading Buffer】：6XEDTA（pH=8.0）30mM甘油36%(v/v)二甲苯青FF 0.05%(w/v)溴酚蓝0.05%(w/v)4℃保存【TBE】：5XTris 27g硼酸13.75gNa2EDTA 2.325gH2O 溶解后定容至500mlTotal：500ml以下溶液需要121℃，20min高温高压灭菌：1M Tris-HCl，0.2M EDTA（灭菌后室温保存）溶液I，溶液III。
小提质粒
质粒DNA的小量提取溶液配制配置储液（两周用量，小提）1. 10N NaOH 20ml:8g NaOH溶于16ml单蒸水，定容到20ml,注意橡胶塞保存。
2. LB培养基500ml:450ml单蒸水+蛋白胨5g+酵母浸提物2.5g+NaCl5g,混匀，加入10N NaOH 调PH至7.0，定容至500ml,分装，用于养细菌3. 0.9%NaCl 30ml4. 3M NaAc 10ml，调节PH至5.25. 甘油：用于保种6. 2-5高压灭菌7. 5MLiCl 25ml(4°C保存)8. 0.5M葡萄糖20ml（4°保存，避免长菌）9．0.5M Tris-Cl PH 8.0 30ml ：1.815gTris碱溶于24ml单蒸水，震荡后加入10N NaOH调节PH至8.0，然后定容至30ml.10. 0.5M EDTA 用10N NaOH调PH至8.0 （约2.6ml,EDTA不易溶解，起初乳白色，加入NaOH可助溶逐渐呈透明，故溶液还是乳白色时所测PH一般不准）11. 10%SDS 40ml反应吸热，故先加水再加试剂，SDS为强去污剂，使用时戴口罩，注意避风。
12. 5M NaAc 30ml 反应吸热，注意试剂是否带有结晶水。
13.无水乙醇-20°C保存14. 50×TAE 50ml15.氨苄青霉素1000×，超净台内配置（一）LB培养基每1000 mL加分析纯NaCl 10 g，蛋白胨10 g，酵母粉5 g，用ddH2O配制，再用10 M NaOH调pH至7.4（100 mL一般加450 µL，亦可不调），高压灭菌冷却后使用。
固体培养基加入琼脂粉1.5%琼脂粉。
10 M（或N）NaOH配制方法是称200 g NaOH加300 mLddH2O，搅拌充分溶解后定容至500 mL。
（二）溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ溶液Ⅰ：葡萄糖50 mmol/L，EDTA 10 mmol/L，Tris-HCl 25 mmol/L，pH至8.0。
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质粒DNA的小量制备
方法
1.接种一个质粒菌落到5ml LB（含相关抗生素）培养液中,37℃摇床生长至饱和状态（过夜）。
2.取1.5m1菌液高速离心20秒 (或6000转/分)。
3.垂悬沉淀在1O0ul GTE溶液中，室温5分钟。
4.加2O0ul NaOH/SDS溶液，混匀置冰浴5分钟。
5.加3M KAC或3M NaAc l5Oul，旋涡混匀，置冰上5分钟。
6.高速离心3分钟，转移0.4m1上清到另一微型离心管中，加0.8m195%乙醇或无水乙醇或0.6倍体积异丙醇，置室温15~20分钟。
7.高速离心3分钟，弃上清，沉淀用70%乙醇洗一次高速离心弃上清，沉淀置37℃孵箱使乙醇挥发。
8.每管加30ul TE或SDW溶解沉淀后，封口，或加RNaseA消化RNA后再纯化，置-20℃备用。
9．用1%的琼脂糖凝胶电泳提取液，于凝胶成像系统观察结果。