无内毒素质粒小量提取试剂盒使用说明

5、 加 入 上 清 1/5 体 积 的 冰 上 预 冷 的 内 毒 素 清 除 剂 ， 振 荡 混 匀 ， 溶 液 变 浑 浊 ， 冰 浴 2min 至 溶 液 变 清 亮 。

6、37 ℃ 水 浴 5min, 不 时 振 荡 ，溶 液 又 变 浑 浊 。12000rpm 室 温 离 心 5min ， 溶 液 应 分 为 两 相 ， 上 层 水 相 含 质 粒 DNA， 下 层 油 相 含 内 毒 素 。

无内毒素质粒小量提取试剂盒使用说明 货 号 ： D1140 规 格 ： 50T/100T 保存：常温干燥保存，复检期为一年。 试剂盒内容：
试剂盒组成 RNase A
内毒素清除剂 溶 液 P1 溶 液 P2 溶 液 P3 结合液 漂洗液 洗脱液 吸附柱 收集管 说明书
7、 将 含 质 粒 DNA 的 上 层 水 相 转 移 至 新 管 ， 弃 下 层 油 相 ， 注 意 不 要 吸 入 油 状 相 。 重 复 步 骤 5-7 三 次 。
8、 加 入 600ul 的 结 合 液 ， 分 混 匀 后 加 入 吸 附 柱 中 ， 室 温 放 置 2min， 12000rpm 离 心 1min， 倒 掉 收 集 管 中 的 废 液 ， 将 吸 附 柱 重 新 放 回 收 集 管 中 。 如果溶液量多可分多次加入。
3、向 离 心 管 中 加 入 200ul 溶 液 P2，温 和 地 上 下 翻 转 6-8 次 使 菌 体 充 分 裂 解 。 注 意 ： 混 匀 一 定 要 温 和 ， 以 免 污 染 细 菌 基 因 组 DNA， 此 时 菌 液 应 变 得 清 亮 粘 稠 ， 作 用 时 间 不 要 超 过 5 min， 以 免 质 粒 受 到 破 坏 。
9、 向 吸 附 柱 中 加 入 700ul 漂 洗 液 (使 用 前 请 先 检 查 是 否 已 加 入 无 水 乙 醇 )， 12000rpm 离 心 1min， 弃 废 液 ， 将 吸 附 柱 放 入 收 集 管 中 。
10、 向 吸 附 柱 中 加 入 500ul 漂 洗 液 ， 12000rpm 离 心 1min， 弃 废 液 ， 将吸附柱放入收集管中。
13、 为 了 增 加 质 粒 的 回 收 效 率 ， 可 将 得 到 的 洗 脱 液 重 新 加 入 吸 附 柱 中 ， 室 温 放 置 2min， 12000rpm 离 心 1min。
注意事项:
1. 使 用 前 请 先 检 查 溶 液 P2、 P3 和 结 合 液 是 否 出 现 混 浊 ， 如 有 混 浊 现 象 ， 可 在 37℃ 水 浴 中 加 热 几 分 钟 ， 待 溶 液 恢 复 澄 清 后 再 使 用 。
DNA 产 物 应 保 存 在 -20℃ ， 以 防 DNA 降 解 。
3. 质 粒 DNA 浓 度 ＞ 1mg/ml 时 清 除 内 毒 素 效 率 降 低 。 由 于 质 粒 DNA 本 身 的 性 质 ， 清 除 过 程 可 导 致 部 分 质 粒 DNA 丢 失 ，但 内 毒 素 却 能 得 到 最 大 限 度 清 除。
相关试剂：
M1070 D2000 plus DNA Ladder
D1010 6× DNA Loading Buffer
T1060 50× TAE 缓 冲 液
T1050 5× TBE 缓 冲 液
G8142 GoldView II 型 核 酸 染 色 剂 (5000× )
4、 向 离 心 管 中 加 入 200ul 溶 液 P3， 立 即 温 和 地 上 下 翻 转 6-8 次 ， 充 分 混 匀 ， 此 时 会 出 现 白 色 絮 状 沉 淀 。 12000rpm 离 心 10 min， 用 移 液 器 小心地将上清转移到另一个干净的离心管中，尽量不要吸出沉淀。注意：溶 液 P3 加 入 后 应 立 即 混 合 ， 避 免 产 生 局 部 沉 淀 。 如 果 上 清 中 还 有 微 小 白 色 沉 淀，可再次离心后取上清。
11、 12000rpm 离 心 2min， 将 吸 附 柱 敞 口 置 于 室 温 或 50℃ 温 箱 放 置 数 分钟，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，否则漂洗液中的乙醇会影响后 续 的 实 验 如 酶 切 、 PCR 等 。
12 、 将 吸 附 柱 放 入 一 个 干 净 的 离 心 管 中 ， 向 吸 附 膜 中 央 悬 空 滴 加 50-200ul 经 65 ℃ 水 浴 预 热 的 洗 脱 液 ，室 温 放 置 2min ，12000 rpm 离 心 1min 。
4. 所 有 溶 液 应 用 无 内 毒 素 的 高 纯 水 配 制 ，所 有 器 械 材 料 均 应 不 含 内 毒 素 ， 玻璃器皿可高温烘烤，非挥发性水溶液可高压处理。
5. DNA 浓 度 及 纯 度 检 测 ： 得 到 的 质 粒 DNA 纯 度 与 样 品 保 存 时 间 、 操 作 过 程 中 的 剪 切 力 等 因 素 有 关 。 得 到 的 DNA 可 用 琼 脂 糖 疑 胶 电 泳 和 紫 外 分 光 光 度 计 检 测 浓 度 与 纯 度 。 DNA 应 在 OD 260 处 有 显 著 吸 收 峰 ，OD 260 值 为 1 相 当 于 大 约 50μ g/ml 双 链 DNA、 40μ g/ml 单 链 DNA。 OD 260 /OD 280 比 值 应 为 1.7-1.9， 如 果 洗 脱 时 不 使 用 洗 脱 缓 冲 液 ， 而 使 用 去 离 子 水 ， 比 值 会 偏 低 ， 因 为 pH 值 和 离 子 存 在 会 影 响 吸 光 值 ， 但 并 不 表 示 纯 度 低 。
2. 洗 脱 缓 冲 液 体 积 不 应 少 于 50ul， 体 积 过 小 影 响 回 收 效 率 ； 洗 脱 液 的

pH 值 对 洗 脱 效 率 也 有 影 晌 ，若 需 要 用 水 做 洗 脱 液 应 保 证 其 pH 值 在 8.0 左 右 (可 用 NaOH 将 水 的 pH 值 调 至 此 范 围 )， pH 值 低 于 7. 0 会 降 低 洗 脱 效 率。

有 机 化 合 物 。 内 毒 素 清 除 剂 可 最 大 限 度 地 除 去 内 毒 素。 从 1-5ml 大 肠 杆 菌 LB 培 养 液 中 ，可 快 速 提 取 5-15μ g 高 纯 度 质 粒 DNA，提 取 率 达 85-90%。使 用 本 试 剂 盒 提 取 的 质 粒 DNA 纯 度 高 ，可 直 接 用 于 细 胞 转 染 等 要 求 较 高 的 实 验 ， 以 及 其 他 各 种 常 规 操 作 ， 包 括 酶 切 、 PCR、 测 序 、 连 接 和 转 化 等 试 验 。
D1140-50T 300ul 20ml 10ml 10ml 10ml 30ml 15ml 10ml 50 个 50 个 1份
D1140-100T 500ul 40ml 20ml 20ml 20ml 60ml
15ml× 2 20ml
100 个 100 个
1份
产品说明：
本试剂盒采用碱裂解法裂解细胞，根据离心吸附柱在高盐状态下特异性 地 结 合 溶 液 中 的 DNA 的 原 理 特 异 性 提 取 质 粒 DNA。 离 心 吸 附 柱 中 采 用 的 硅 基 质 材 料 能 高 效 、 专 一 地 吸 附 DNA， 可 最 大 限 度 去 除 杂 质 蛋 白 及 细 胞 中 其 他
使用前请先在漂洗液中加入无水乙醇， 加入体积请参照瓶体上的标签。 溶 液 P1 在 使 用 前 先 将 试 剂 盒 中 提 供 的 RNaseA 全 部 加 入 ， 混 匀 ， 置 于 2-8℃ 保 存 。 如 非 指 明 ， 所 有 离 心 步 骤 均 为 使 用 台 式 离 心 机 在 室 温 下 离 心 。
操作步骤:
1、取 1-5ml 细 菌 培 养 物 ，12000rpm 离 心 1min，吸 除 上 清（ 菌 液 浓 度 较 低 时 可 多 次 离 心 收 集 到 一 个 离 心 管 中 ）。
2、 向 留 有 菌 体 沉 淀 的 离 心 管 中 加 入 200μ l 溶 液 P1(请 先 检 查 是 否 已 加 入 RNaseA） ， 使 用 移 液 器 或 旋 涡 振 荡 器 彻 底 悬 浮 细 菌 细 胞 沉 淀 。 注 意 ： 如果菌块未彻底混匀，会影响裂解导致质粒提取量和纯度偏低。