白地霉脂肪酶的双水相萃取和反胶团提取
酶的主要提取方法及其优缺点
酶的主要提取方法及其优缺点生物工程09-1班杨桠楠0901*******1、有机溶剂沉淀是利用酶与其他杂质在有机溶剂中的溶解度不同，通过添加一定量的某种有机溶剂，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离的。
优点：1）分辨率比盐析法高2）沉淀不需脱盐3）溶剂易蒸发，沉淀易离心缺点：1）有机溶剂易燃、易爆，对安全要求较高。
2）对某些具有生物活性的大分子容易引起变性失活，操作需在低温下进行。
沉淀析出后要尽快分离，尽量减少有机溶剂对酶活力的影响。
2、等电点沉淀是利用两性电解质在等电点时溶解度最低，以及不同的两性电解质有不同的等电点这一特性，通过调节溶液的pH值，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离的优点：1）大多数蛋白质的pI都在偏酸性范围内2）无机酸（如磷酸、盐酸、硫酸）价格较低3）无需除掉多余酸即可进行下一步纯化缺点：1）酸化时，容易引起蛋白质失活3、有机聚合物沉淀法(复合沉淀法)是在酶液中加入某些物质，使它与酶形成复合物而沉淀下来，从而使酶与杂质分离的。
优点：1）操作条件温和，不易引起生物大分子变性。
2）沉淀效能高，使用少量的PEG即可沉淀相当多的生物大分子。
3）沉淀后有机聚合物容易去除。
4、盐析沉淀法利用不同蛋白质在不同的盐浓度条件下溶解度不同的特性，通过在酶液中添加一定浓度的中性盐，使酶或杂质从溶液中析出沉淀，从而使酶与杂质分离常用的盐析剂: 硫酸铵优点：1）盐析能力强。
2）在水中溶解度最大（25℃时为4.1mol/L）。
而温度系数最小（对温度不敏感）。
3）价格便宜。
浓度高时也不会引起蛋白质和酶生物活性的丧失，抽提效果好。
缺点：1）缓冲能力差2）NH4＋的存在干扰蛋白质的测定3）得到的样品欲继续纯化时，需花一定时间脱盐。
5、双水相萃取技术是用两种不相溶的亲水性高分子聚合物水溶液，如聚乙二醇（PEG）和葡聚糖（Dextran）进行萃取。
由于形成的两相均有很高的含水量（达70%〜90%），故称“双水相”系统。
生物工程实验---双水相萃取糖化酶
双水相萃取糖化酶一、实验目的1、了解双水相萃取在生物活性物质提取中的重要作用与意义，及其与传统溶媒萃取技术的异同。
2、加深对分配系数K 、相比R 、收率Y 等基本概念的认识及相图的制作，掌握液液萃取中基本实验技术。
二、实验原理双水相萃取技术是分离纯化蛋白质混合物等生物大分子的有效方法。
双水相系统通常是由水溶性的两种聚合物组成或一种水溶性聚合物与一种盐组成，相对于传统溶剂萃取来说，双水相萃取的最大优势在于双水相体系可为生物活性物质提供一个温和的活性环境，因而可在萃取过程中保持生物物质的活性和构象，而且双水相技术具有处理量大、能耗低、易连续化操作和工程放大等优点。
生物大分子在双水相上相和下相的浓度比被定义为分配系数（K=Cb/Ct ）。
在双水相系统中有许多因素影响分配系数，包括系统本身的因素如系统组成、聚合物分子量、聚合物浓度、盐和离子强度、pH 等，以及目标产物的性质如疏水作用、电荷、分子量等，通过大量实验研究可以获得特定蛋白质和生物大分子的最适宜分离的相系统和最优分配的。
糖化酶亦称淀粉α-1，4葡萄糖苷酶。
这类酶作用于淀粉分子末端，从淀粉非还原性末端顺次切开α-1，4糖苷键，生成葡萄糖。
它们也能作用于支链淀粉的α-1，6键，但速度较慢，因此分解产物全部为葡萄糖，作用结果使糖的还原能力迅速增高。
本实验选用PEG400-(NH4)2SO4为双水相系统，从发酵液中萃取糖化酶。
表观分配系数bt C C K =相比bt V V R =收率RKRK C V C V C V Y bb t t tt +=+==1上、下相酶总量上相酶总量式中: C b 、C t 分别为下、上相酶浓度（活性）；V b 、V t 分别为下相、上相的体积。
物料衡算：加入的原液总酶活=上相酶活×上相体积+下相酶活×下相体积三、实验仪器与药品仪器：天平 恒温水浴 离心机 液相混合器 刻度试管 吸管 酸式滴定管等 药品：糖化酶 PEG400、(NH 4)2SO 4、2%可溶性淀粉、0.15M NaOH 、1M H 2SO 4四、实验步骤（一）、PEG400-(NH 4)2SO 4双水相系统相图的制作1.配制40％的硫酸铵溶液（已经配好）。
双水相体系提取纯化酶
双水相体系提取纯化酶双水相体系提取(DSE)是一种利用二元混合物的形态和相分离的性质而实现的技术，其应用于纯化酶的方法被广泛研究。
双水相体系提取可以优化植物细胞壁和多糖膜对植物细胞外酶和内酶的分选，从而实现酶纯化。
由于双水相体系提取的优点，其在植物细胞外酶和内酶纯化领域有着广泛的应用前景。
双水相体系提取的基本原理是利用不同溶剂的二元混合物形态，以实现分离或处理植物细胞壁及其内酶的目的。
当二元混合物遇到有机溶剂时，可以分离成不同的相；其中一种相是固体，主要由植物细胞壁组成；另一种相是液态，主要由细胞内酶组成。
双水相体系提取可以从固体和液态相中分离出植物细胞壁和内酶，实现酶纯化。
双水相体系提取的主要技术步骤有两个：植物细胞处理和双水相体系提取。
第一步通常是将植物细胞破碎处理，以获得固态粉末。
此外，还可以在破碎处理前使用酶分解，以及利用溶剂萃取，来获得植物细胞的分离物。
接下来，双水相体系提取可以加入有机溶剂或其他添加剂，如离子交换剂或某种特定酶，以改善细胞外及细胞内酶的分离效果。
以此为基础，利用相分离和沉淀特性，就可以有效提取植物细胞外及细胞内酶。
双水相体系提取是一种简单可行的酶纯化方法，可以用于植物细胞外及细胞内酶的精细结构研究和性能研究。
其优点在于对植物细胞外和内酶的有效分离，抗酶活性的可控，以及反应时间短。
同时，双水相体系提取只需要简单的设备，也可以节省成本。
由于双水相体系提取技术的优点，使其应用于纯化内酶和细胞外酶方面具有广泛的潜力。
从应用前景来看，双水相体系提取将得到广泛的使用。
一方面，双水相体系提取的细胞壁及内酶分离效率高；另一方面，可以控制酶活性过程，以实现有效的酶纯化，也可结合溶剂萃取，以获得更优的纯化效果。
此外，双水相体系提取的有机溶剂也可以作为植物抗酶活性剂，这将有助于改善酶纯化的效果。
总之，双水相体系提取是一种提取植物细胞外和内酶的高效、有效的酶纯化方法，具有广泛的应用前景。
因此，它可能会成为植物酶纯化的重要途径，在未来的研究工作中将发挥重要作用。
双水相萃取荣昌猪肉脂肪酶及酶学特性研究的开题报告
双水相萃取荣昌猪肉脂肪酶及酶学特性研究的开题报告题目：双水相萃取荣昌猪肉脂肪酶及酶学特性研究摘要：脂肪酶是一类催化脂肪水解的酶，可广泛应用于食品、医药、化妆品等工业。
本研究以荣昌猪肉为材料，利用双水相萃取技术提取脂肪酶，并对提取获得的酶进行酶学特性分析。
实验结果表明，双水相萃取法提取的荣昌猪肉脂肪酶优于传统方法。
该酶的最适温度为50°C，最适pH值为7.5，具有较高的热稳定性和耐酸碱性。
本研究的成果有望为荣昌猪肉脂肪酶的应用提供理论依据和实验支持。
研究背景：脂肪酶是一类广泛存在于动、植物和微生物中的酶，具有催化脂肪水解的特性。
在食品、医药、化妆品等工业中，脂肪酶被广泛应用于油脂加工、饼干生产、药物制剂等方面。
荣昌猪肉是一种优质的猪肉品种，其脂肪酶在实际应用中表现出较高的活性和稳定性。
因此，探究荣昌猪肉脂肪酶的提取和酶学特性对其应用具有重要意义。
研究内容：本研究将以荣昌猪肉为材料，采用双水相萃取技术提取脂肪酶。
通过对提取获得的酶进行酶学特性分析，包括最适温度、最适pH值、热稳定性和耐酸碱性等方面的研究。
同时，与传统提取法进行对比，评估双水相萃取法对荣昌猪肉脂肪酶的提取效果。
研究意义：本研究将探究较为优化的荣昌猪肉脂肪酶提取技术，并对提取获得的酶进行酶学特性分析。
通过研究不同条件下酶的性质和功能，提高了对酶的认识和应用程度，有望为荣昌猪肉脂肪酶的应用提供理论依据和实验支持。
同时，本研究也对脂肪酶提取技术和酶学特性分析有一定的推广应用价值。
研究方法：采用双水相萃取技术提取荣昌猪肉脂肪酶，并对提取获得的酶进行酶学特性研究，包括最适温度、最适pH值、热稳定性和耐酸碱性等方面的分析。
同时，与传统提取法进行对比，评估双水相萃取法对荣昌猪肉脂肪酶的提取效果。
预期成果：本研究将探究荣昌猪肉脂肪酶的提取技术和酶学特性，有望获得如下成果：1.较为优化的荣昌猪肉脂肪酶双水相萃取技术；2.荣昌猪肉脂肪酶的最适温度、最适pH值、热稳定性和耐酸碱性等酶学特性；3.与传统提取法对比，评估双水相萃取法对荣昌猪肉脂肪酶的提取效果。
双水相萃取法提取发酵液中碱性蛋白酶的研究
双水相萃取法提取发酵液中碱性蛋白酶的研究
作者：刘天一李长森张浩东宋翔枫徐璐张晓宇
来源：《世界家苑·学术》2017年第06期
摘要：目的采用双水相萃取法提取高产菌株SD发酵液中碱性蛋白酶，考察相关条件对萃取的影响，并对该法提取发酵液中碱性蛋白酶的工艺条件进行探索。
方法碱性蛋白酶高产菌株SD8液体发酵培养，采用高聚物聚乙二醇（PEG）-硫酸铵体系进行双水相萃取。
整个过程包括单因素试验、正交试验和酶的浓缩提纯试验三个部分，考察了PEG分子量，PEG浓度，硫酸铵浓度以及pH对萃取的影响；进一步采用正交试验，探索最佳萃取条件及不同因素之间的相互影响；对获得的提取物采用超滤的手段进行浓缩和纯化，去除PEG并测定浓缩液的酶活及回收率。
结论单因素实验确定选择PEG1500，其他因素以PEG浓度2096，硫酸铵10%饱和度，pH 7 5，碱性蛋白酶的提取效果较好；正交试验结果表明以上因素的影响主次顺序为体系pH值、PEG浓度和硫酸铵浓度；纯化实验显示，超滤去除聚乙二醇的方法可行，纯化效果较好。
本试验的成果对于碱性蛋白酶的生产以及科学研究有着一定的借鉴意义。
关键词：双水相萃取法；碱性蛋白酶；分配系数；活性回收率。
双水相萃取酶的工艺流程
双水相萃取酶的工艺流程双水相萃取酶是一种生物工艺方法，用于从微生物菌株中提取酶。
双水相萃取酶的工艺流程包括以下几个主要步骤：挑选菌株、培养微生物、收获微生物发酵产物、裂解细胞壁、萃取酶、纯化酶等。
首先，在双水相萃取酶的工艺流程中，挑选菌株是非常重要的。
菌株的选择应该具有高产酶量、对底物的选择性高、生长速度快等特点。
一般来说，可以通过从土壤、水体、植物等不同环境样品进行采集、分离和筛选菌株，以获得具有理想特性的微生物菌株。
其次，对挑选出的菌株进行培养。
培养条件包括适宜的温度、pH值、氧气含量等，以最大限度地促进微生物的生长和产酶。
接着，通过发酵的方式可以收获微生物产生的酶。
发酵是将已培养好的微生物菌株加入到适宜的发酵基质中，通过发酵罐等设备进行培养，促进微生物的生长和产酶。
在发酵过程中，需要注意对温度、pH值、氧气含量等因素的控制，以保证酶的产生和质量。
随后，裂解细胞壁是将经过发酵得到的微生物细胞破碎，以释放酶。
通常采用机械方法或化学方法进行细胞壁的破裂，以获得细胞内的酶。
之后，进行酶的萃取。
双水相的特点在于其相互不混溶，通常利用两种互相不混溶的溶剂作为两相。
通常使用的有机溶剂有正己烷、二甲苯、氯仿等，水相中添加表面活性剂，可以增加两相的亲和力。
这样通过搅拌、超声波处理等方法，酶可以从水相转移到有机相中。
最后，对萃取到有机相中的酶进行纯化。
一般通过膜分离、离心、透析、柱层析等方法进行酶的纯化，以获得高纯度的酶制剂。
综上所述，双水相萃取酶的工艺流程主要包括挑选菌株、培养微生物、收获微生物发酵产物、裂解细胞壁、酶的萃取和纯化等步骤。
这种工艺流程具有操作简便、提取效率高、产品纯度高等优点，因此在生物制药和食品工业等领域具有较广泛的应用前景。
浅谈双水相在糖化酶提取中的应用 - 终改
双水相萃取技术在糖化酶纯化工业中的应用糖化酶作为发酵行业中将淀粉转化为葡萄糖的重要物质，在酒类、果葡糖浆、有机酸、味精等生产工业中有着不可替代的地位。
是最重要的也是我国产量最大的工业酶制剂产品之一[1]。
仅在石家庄就有东泉生物制品有限公司、兴达酶制剂有限公司、胜利酶制剂厂等多家糖化酶的生产厂家，但他们在糖化酶的提取纯化中普遍采用硫酸铵盐析法，其只能得到含菌体、盐类、杂蛋白及其他固形物的粗酶液。
而且粗品中残余大量硫酸铵，不能满足食品级酶的质量要求。
双水相萃取体系的显著优点是传质和分相速度快,原料成本低,所使用有机溶剂无毒或低毒、粘度低、易回收处理、操作简便,同时该体系温和的环境也不会引起生物物质的损伤和破坏。
将其用于生物物质的分离和纯化的研究,国内外刚刚起步,但对酶制剂已表现出良好的分离性能。
世界上主要的糖化酶生产厂大约有31家,多分布于英日等国,其中丹麦的NOVO公司被认为是世界最大的糖化酶酶制剂公司。
他们采用的是添加无机絮凝剂，如硫酸铝、碱式氯化铝、氯化铁、锌盐等能在水中形成各种氢氧化物凝胶体，以实现双水相分离的方法（也可添加有机高分子絮凝剂，如聚苯乙烯磺酸、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚丙烯酞胺等）。
糖化酶的双水相萃取过程分为三部分:(1)萃取和平衡, (2)上下相的分离(3)多聚物的分离。
萃取一般在混和沉降罐中进行。
混和沉降罐装有溢流装置, 溢流装置由两相密度差决定,由于体系的表面张力很低, 所以分配能在几分钟达到平衡, 而且界面张力很小, 则界面能低, 搅拌时只需要较小的剪切力就能得到很高的悬浮液, 能耗小。
在萃取达到平衡后, 两相一般经过重力沉降或离心分离。
离心分离常用的一般是碟片式离心机。
离心机完成了相与相的分离后, 要把酶中的多聚物除去。
葡糖糖淀粉酶是我国最大、最重要的酶制剂产品之一。
产葡糖淀粉酶的菌株多有报道，如红曲霉、黑曲霉、米根霉等。
国外率先使用双水相萃取从技术克服了盐析法、等电点沉淀法和有机溶剂沉淀法在分离过程中容易发生蛋白质变性，导致蛋白分离提取的收率和效率相对较低的缺点。
双水相酶萃取系统
（19）中华人民共和国国家知识产权局
（12）实用新型专利
（10）申请公布号
CN203048918U
（43）申请公布日 2013.07.10（21）申请号CN201320003536.X
（22）申请日2013.01.06
（71）申请人山东轻工业学院
地址250353 山东省济南市长清西部新城大学科技园大学路3501号山东轻工业学院（72）发明人董永胜
（74）专利代理机构
代理人
（51）Int.CI
权利要求说明书说明书幅图
（54）发明名称
双水相酶萃取系统
（57）摘要
本实用新型涉及一种双水相酶萃取系统，
属于生物分离工程技术领域，其用于解决酵母细
胞内的苯丙氨酸解氨酶分离的生产问题。
双水相
酶萃取系统包括细胞匀浆液储罐、双水相体系溶
液储罐、萃取罐、一级分离罐、二级分离罐、混
合罐、无机盐溶液储罐、产品储罐、流量阀、定
量泵。
在酶的分离过程中采用了两级分离，在每
级分离过程中采用两个分离罐循环使用的方法，
使酶的萃取与分离能够连续进行。
该系统生产周
期短，设备利用率高，可用于粘红酵母细胞内的
苯丙氨酸解氨酶的提取，能使酶的纯度和产率得
到提高。
法律状态
法律状态公告日法律状态信息法律状态
2013-07-10授权授权
2015-03-11专利权的终止专利权的终止
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生物技术通报
ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＢＵＬＬＥＴＩＮ
２００７ 年第 １ 期
白地霉脂肪酶的双水相萃取和反胶团提取
王俊华 １ 杨洁 １ 付建红 ２ 吴娜 １
（ １ 新 疆 大 学 生 命 科 学 与 技 术 学 院 ， 乌 鲁 木 齐 ８３００４６； ２ 新 疆 农 业 科 学 院 微 生 物 资 源 重 点 实 验 室 ， 乌 鲁 木 齐 ８３００００）
积 ／下 相 体 积 ； 分 配 系 数 Ｋ＝上 相 萃 取 物 浓 度 ／下 相 萃 取
物 浓 度 ； 萃 取 率 Ｃ＝ＲＫ／（ １ ＋ＲＫ） ［５］ 。
１．３．４ 反胶团提取法 取相同体积的酶液和拌 ５ｍｉｎ 后 于 ３ ０００ｒ／ｍｉｎ 离 心
１０ｍｉｎ， 测 定 上 、下 相 酶 活 力 和 总 蛋 白 含 量 （ ２８０ｎｍ， ７５２ 型 紫 外 分 光 光 度 计 ） ， 计 算 脂 肪 酶 的 提 取 率 Ｓｆ［６］。
低 温 脂 肪 酶 活 力 单 位 定 义 为 ： １ｍｌ 酶 液 ， 于 ３５℃，
ｐＨ７．５ 的条件下， 水解脂肪每分钟产生 １μｍｏｌ 的脂肪酸，
以 μ／ｍｌ 表示。
纯化倍数定义为： 纯化后的比活力／纯化前的比活
力。
１．３． ３ 双 水 相 萃 取 法 双 水 相 体 系 在 ２２℃按 重 量 配
参考文献 １ 王俊华， 杨洁， 付建红， 等．低温脂肪酶酶学性质初探， 中国科协
２００５ 年 学 术 年 会 论 文 集． ２００５， ４５９～４６４． ２ Ｔｅｒｓｔａｐｐｅｎ ＧＣ， Ｇｅｅｒｔｓ ＡＪ， Ｋｕｌａ ＭＲ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ａｐｐｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ，
１９９２， １６： ２２８～２３５． ３ 张 艳 红 ， 王 小 芬 ， 王 俊 华 ， 等．生 物 技 术 世 界 ， ２００６， １４（ ２） ： ４９～５０． ４ Ｔｅｒｓｔａｐｐｅｎ ＧＣ， Ｇｅｅｒｔｓ ＡＪ， Ｋｕｌａ ＭＲ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ａｐｐｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ， １９９２， １６： ２２８～２３５． ５ 余 红 英 ， 孙 远 明 ， 王 炜 军 ， 等．化 学 世 界 ， ２００３， １１： ５６９～５７４． ６ 杨 善 升 ， 陆 文 聪 ， 包 伯 荣 ， 等．化 学 工 程 师 ， ２００４， １０３（ ４０） ： ３７～４０． ７ 于 艳 春 ， 纪 建 业 ， 褚 莹 ， 等．河 南 师 范 大 学 学 报（ 自 然 科 学 版） ， １９９９， ２７（ ２） ： ４９～５０． ８ 谷 磊 ， 白 姝 ， 孙 彦．化 工 进 展 ， １９９８， ５： １９～２４．
双水相萃取和反胶团提取蛋白质是近些年来发展起来的技术， 由于可以保护蛋白质使之不易变性， 同 时易于工业化连续生产， 因而常用于酶的纯化。
双 水 相 萃 取 是 依 据 物 质 在 两 相 间 的 选 择 性 分 配 ， 当 物 质 进 入 双 水 相 体 系 后 ， 由 于 表 面 性 质 、电 荷 作 用 和 各 种 力 （ 如 疏 水 键 、 氢 键 和 离 子 键 等 ） 的 存 在 和 环 境 因 素 的 影 响 ， 使 其 在 上 、 下 相 中 的 浓 度 不 同 ［２］。 Ｔｅｒｓｔａｐｐｅｎ 等 人 利 用 表 面 活 性 剂 组 成 的 双 水 相 系 统 对 脂 肪 酶 进 行 纯 化 ， 发 现 所 有 来 源 于 原 核 生 物 的 脂 肪 酶 都 可 以 采 用 此 体 系 进 行 分 离［３］。Ｑｕｅｉｒｏｚ 等 人 研 究 发 现 ｐＨ、离 子 强 度 、聚 乙 二 醇 （ ＰＥＧ） 分 子 量 和 盐 的 类 型 将 影 响 酶 的 分 离［３］。
和 表 面 活 性 剂 在 蛋 白 质 表 面 形 成 一 层“水 壳 ”， 使 蛋 白 质 避 免 与 有 机 溶 剂 直 接 接 触 而 得 到 有 效 的 保 护［４］。
本研究对双水相萃取脂肪酶和反胶团提取脂肪酶的各种因素做了探讨， 采用正交实验进一步优化了
实验条件， 并对两种方法进行了比较， 从而选择白地霉脂肪酶最优的提取方法。
３ 结论
通过对影响双水相萃取和反胶团提取脂肪酶的 各种因素进行分析， 并通过正交实验进一步优化实 验 方 案 ， 实 验 表 明 ： 在 ＰＥＧ 浓 度 １５％ ， （ ＮＨ４） ２ＳＯ４ 浓 度 ２２．５％， ｐＨ８．０ 的 条 件 下 进 行 双 水 相 萃 取 ， 脂 肪 酶 的 纯 化 倍 数 达 到 最 大 ； ＣＴＡＢ 浓 度 １５０ｍｍｏｌ／Ｌ， 在 相 体 积 比 ４／２， 水 相 ｐＨ８．０， 提 取 温 度 ４０℃的 条 件 下 进 行反胶团提取， 脂肪酶的比活力达到最大。通过这 两种方法提取脂肪酶的比较， 反胶团提取会造成脂 肪酶的比活力有一定程度的降低， 而双水相萃取可 以使脂肪酶的纯化倍数达到 ７．５。
收稿日期： ２００６－０７－３１ 基金项目： 新疆维吾尔自治区自然科学基金和新疆农科院微生物资源重点实验室项目 作者简介： 王俊华（ １９８２－） ， 女， 硕士研究生， 研究方向： 生化制药， 电话： １３５７９９０２８０５， 电子信箱： ｗａｎｇｊｈ２８＠１６３．ｃｏｍ 通讯作者： 杨洁（ １９６３－） ， 女， 硕士生导师， 从事食品与生物化学教学与科研，电话： １３１３９８８４２２５， 电子信箱： ｙａｎｇｊｉｅ２３４＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｍ
１３４
生物技术通报 Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ
２００７ 年第 １ 期
反胶团是溶解在有机溶剂中的表面活性剂自发形成的纳米级聚体。表面活性剂的极性尾在外与非极
性的有机溶剂接触， 而极性头则排列在内形成一个极性核， 此极性核具有溶解极性物质的能力。极性核溶
入 水 后 就 形 成 了“水 池 ”， 当 反 胶 团 体 系 与 蛋 白 质 溶 液 相 混 合 时 ， 蛋 白 质 就 溶 于 反 胶 团 的“水 池 ”中 。 由 于 水
Ａｂｓ ｔｒａ ｃｔ： Ｓｏｍｅ ｆａｃｔｏｒｓ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｗｏ－ｐｈａｓｅ ｓｙｓｔｅｍ ａｎｄ ｒｅｖｅｒｓｅ ｍｉｃｅｌｌｅｓ ｗｅｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｐａｐｅｒ． Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｗａｓ ｇａｉｎｅｄ． ＰＥＧ １５％ ， （ ＮＨ４） ２ＳＯ４ ２２．５％ ， ｐＨ８．０ ｗａｓ ｔｈｅ ｂｅｓｔ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｗｏ－ｐｈａｓｅ ｓｙｓｔｅｍ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ， ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｇｏｔ ｔｏ ７．５． Ｉｎ ｔｈｅ ｃａｓｅ ｏｆ ｔｈａｔ ＣＴＡＢ １５０ｍｍｏｌ／ Ｌ， Ｖｏ／ Ｖｗ４／ ２， ｐＨ８．０， ４０℃ ， ｌｉｐａｓｅ ｗａｓ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ｒｅｖｅｒｓｅ ｍｉｃｅｌｌｅｓ， ｉｔｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｇａｉｎｅｄ ｔｈｅ ｂｅｓｔ ｂｕｔ ａｌｓｏ ｌｏｓｅ ｔｏ ｓｏｍｅ ｅｘｔｅｎｔ．
图 １ 双水相萃取正交实验分析图
２ 结果与讨论
２．１ 双水相萃取法提取脂肪酶
为 优 化 双 水 相 萃 取 的 条 件 ， 以 分 配 系 数 为 指 标 做 三 因 素 三 水 平 的 正 交 实 验 。 由 表 １ 和 图 １ 可 知 ， ＰＥＧ
浓 度 １５％， 硫 酸 铵 浓 度 ２２．５％， ｐＨ８．０ 为 最 优 的 双 水 相 萃 取 的 条 件 ， 脂 肪 酶 的 分 配 系 数 达 到 最 大 。
表 １ 双水相萃取正交实验表
种于液体发酵培养基中摇床培养， 离心， 取上清即得到
粗 酶 液 ， ４℃贮 存 备 用 。 （ 本 试 验 所 用 菌 种 产 生 的 脂 肪 酶
为胞外酶）
１．３．２ 脂 肪 酶 活 性 测 定 方 法 低 温 脂 肪 酶 活 力 的 测
定 ： 参 照 国 标 ＧＢ／Ｔ ６０１－ ２００２。
２．２ 反胶团法提取脂肪酶
为 优 化 反 胶 团 提 取 脂 肪 酶 的 条 件 ， 以 脂 肪 酶 比 活 力 为 指 标 做 四 因 素 三 水 平 的 正 交 实 验 。正 交 实 验 结 果
２００７ 年第 １ 期
王俊华等： 白地霉脂肪酶的双水相萃取和反胶团提取
１３５
见 表 ２ 和 图 ２， 可 知 ＣＴＡＢ 浓 度 １５０ｍｍｏｌ／Ｌ， 相 体 积 比 ４／２， 水 相 ｐＨ８．０， 提 取 温 度 ４０℃为 最 优 的 反 胶 团 提取的条件， 脂肪酶的比活力达到最大。
摘 要： 对影响双水相萃取和反胶团提取脂肪酶的各种因素进行了探讨， 并通过正交实验进一步优化提取条件， ＰＥＧ 浓 度 １５％，（ ＮＨ４） ２ＳＯ ４ 浓 度 ２２．５％， ｐＨ８．０ 的 条 件 下 进 行 双 水 相 萃 取 ， 脂 肪 酶 纯 化 倍 数 达 到 ７．５ 倍 ； ＣＴＡＢ 浓 度 １５０ｍｍｏｌ／ Ｌ， 相体积比 ４／ ２， 水相 ｐＨ８．０， 温度 ４０℃的条件下进行反胶团提取， 脂肪酶的比活力达到最大， 但其比活力稍有下 降， 约为原来的 ０．９ 倍。
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制 。体 系 总 质 量 为 １０ｇ， 酶 液 量 为 ２ｇ。称 取 一 定 量 ＰＥＧ
溶 液 和 （ ＮＨ４） ２ＳＯ４， 不 足 部 分 以 水 补 充 。 离 心 （ ３ ０００ｒ／ ｍｉｎ， ５ｍｉｎ） 分 相 。读 出 上 、下 相 体 积 ， 分 别 测 定 上 下 相 酶
活力和总蛋白含量。有关计算公式为： 相比 Ｒ＝上相体
关键词： 脂肪酶 双水相 反胶团 提取
Ｌｉｐａｓｅ Ｅｘｔｒ ａｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｔｗｏ－ｐｈａｓｅ Ｓｙｓｔｅｍ ａｎｄ Ｒｅｖｅｒ ｓｅ Ｍｉｃｅｌｌｅｓ
Ｗａｎｇ Ｊｕｎｈｕａ１ Ｙａｎｇ Ｊｉｅ１ Ｆｕ Ｊｉａｎｈｏｎｇ２ Ｗｕ Ｎａ１
（ １Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｘｉｎｊｉａｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｕｒｕｍｑｉ ８３００４６； ２Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｒｙ， Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ｓｃｉｅｎｃｅ ｏｆ Ｘｉｎｊｉａｎｇ， Ｕｒｕｍｑｉ ８３００００）