PScgpd1启动子融合GUS基因在酿酒酵母中的瞬时表达_王俊杰
拟南芥原生质体瞬时表达快速验证重组酶外源基因删除
拟南芥原生质体瞬时表达快速验证重组酶外源基因删除池俊杰;戴绍军;魏建华;王宏芝【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2014(000)007【摘要】In the present study, we used transient gene expression system of Arabidopsis mesophyll protoplasts to test and compare site-specific recombination constructs, which the expression of recombinase was induced by the promoter for heat-shock proteins Hsp18.2, developed a simple and convenient system for rapid assessment of site-specific recombination constructs.%通过在拟南芥原生质体中瞬时表达重组酶删除系统，以拟南芥热激蛋白Hsp18.2基因的启动子诱导加入马铃薯StLs1基因第2个内含子的重组酶表达，证明瞬时转化质粒DNA中位于识别位点之间的基因元件可以被有效删除。
建立了一种快速验证重组酶外源基因删除系统的方法。
【总页数】7页(P86-92)【作者】池俊杰;戴绍军;魏建华;王宏芝【作者单位】东北林业大学盐碱地生物资源环境研究中心东北油田盐碱植被恢复与重建教育部重点实验室，哈尔滨 150040; 北京农业生物技术研究中心，北京100097;东北林业大学盐碱地生物资源环境研究中心东北油田盐碱植被恢复与重建教育部重点实验室，哈尔滨 150040;北京农业生物技术研究中心，北京 100097;北京农业生物技术研究中心，北京 100097【正文语种】中文【相关文献】1.玉米和拟南芥的原生质体制备及瞬时表达体系的研究 [J], 赵苏州;卢运明;张占路;赵杨敏;王磊2.热诱导FLP重组酶删除转基因烟草外源基因 [J], 高媛媛;赵德刚;罗克明;裴炎;Li Yi3.一个新的重组酶系统在转基因植物外源基因删除中的应用 [J], 罗克明;赵德刚;Li Yi;裴炎4.叶片衰老诱导FLP重组酶删除转基因烟草外源基因的研究 [J], 秦利军; 李启龙; 赵德刚5.Cre-lox重组系统介导转基因烟草中外源基因删除的研究 [J], 甄伟;汪阳明;丁伟;陈溪;胡鸢雷;林忠平因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
柠条锦鸡儿CkNCED1基因启动子的克隆及表达分析
第 ２期
草
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报
１６ ５— １ ７ Ｏ
Ｖｏ １ ． ２ ２ ， Ｎｏ ． ２
ＡＣＴＡ ＰＲＡＴＡＣ ＵＬ ＴＵＲＡＥ Ｓ Ｉ ＮＩ ＣＡ
２ ０ １ ３ 年 ４月
柠 条 锦鸡 儿 Ｃ ｋ ＮＣ ＥＤ１基 因启 动 子 的 克 隆及 表达 分 析
任 爱 琴 ， 易津 ， 高 洪 文 ， 李俊 ， 王 学敏 。
ｔ ａ ） 、 柱 花草 （ Ｓ ｔ ｙ ｌ ｏ ｓ ａ ｎ ｔ ｈ ｅ ｓ ｇ ｕ ｉ ａ ｎ ｅ ｎ ｓ ｉ ｓ ） ｌ ９ 等植 物 中克 隆 了 ＮＣ Ｅ Ｄ 基 因 。研 究 发 现 ， 在 拟 南芥 、 烟草 （ Ｎｉ ｃ ｏ ｔ ｉ ａ ｎ ａ ｔ ａ ｂ ａ ｃ ｕ ｍ） 和番 茄 等植物 中 ， 过 量表 达 ＮＣ ＥＤ基 因可 以造 成 ＡＢ Ａ 累积并促 进 ＡＢ Ａ 的代谢 ， 从 而 可 以提高 植物 的 抗 旱能 力 “ ］ 。Ｙａ ｎ ｇ和 Ｇ ｕ ｏ ［ ｇ 将柱 花 草 ＮＣ Ｅ Ｄ１基 因转 入 烟 草 ， ＮＣ Ｅ Ｄ１基 因的过 量 表达 提 高 了转基 因 烟草
色结果表 明， Ｃ ｋ ＮＣ Ｅ Ｄ１基 因 在 植 物 的 叶 、 根、 茎、 花 和角 果 的维 管 组 织 中均 有 表 达 ， 且 在叶 片中表达 强度最高 。以 上 研 究 确 定 了柠 条 锦 鸡 儿 Ｃ ｋ ＮＣ Ｅ Ｄ１基 因 的 表 达 部 位 和 强 度 。 进 一 步 说 明 ｃ Ｎｃ Ｅ Ｄ１基 因 在 ＡＢ Ａ 合 成 调 控 中发 挥重要作 用， 为深入研究基因功能奠定基础 。 关键词 ： 柠条锦鸡儿 ； Ｃ ｋ ＮＣ ＥＤ１ 基 因启 动 子 ； Ｇ ＵＳ组 织 化 学 染 色 ； Ａ Ｂ Ａ 响 应 元 件
PScgpd1启动子融合GUS基因在酿酒酵母中的瞬时表达
关键 词 ：甘 油代 谢 ； ｌ启 动子 ； 葡糖 苷 酸酶 ｇ
中 图分 类 号 ： ９ ９ ９ Ｑ ３ ． ７ห้องสมุดไป่ตู้文献标 识 码 ： Ａ
Ａｎａ ｙ ｉ ｆ Ｐｒ ｍ ０ ｅ １ Ｏ ｈ ｙ Ｇｅ ｆ Ｇｌ ｃ ｒ ｌＭ ｅ ａ ０ ｉ ｌｓｓ０ ０ ｔ ｒ ｇｐ ｆ ｔ ｅ Ｋｅ ｎｅ Ｏ ｙ ｅ ０ ｔ ｂ ｌｃ
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Ａｂ ｔ ａ ｔ Ａ ｈｕ ｔｅ ｖｅ ｔ ｒ ＹＸ２ 一 ｅ ｃ ｎ ＰＳｃ ｐｄ１ ＧＵ Ｓ ｈａ ｂｅ ｎ ｏｎ ｔ ｕ ｔ ｄ ｎｄ ｒ ｎｓ ｏ ｍ ｅ ｓ ｒ ｃ ： ｓ ｔ ｌ ｃ ｏ ｐ ２ ｚ ｏ ｉ — １ ｇ 一 ｄ ｅ ｃ ｓ ｒ ｃ ｅ ａ ｔ ａ ｆ ｒ ｄ ｉ ｔ Ｓ“ｆ ｒ ７ ｆ ｆ ， ｎｏ ｆ ｏ ｅ． Ｐ 以 ｂ ｅ ｅ ｔ ｏ ｒ ｔｏ Ｔｈ ｔ ａ ｆ ｒ ａ ｓ ｗａ ｃ ｔ ｅ ｉ ｅ ｕ Ｐ ｙ ｌｃ ｒ ｐｏ ａ ｉ ｎ． ｅ ｒ ｎｓ ｏ ｍ ｎｔ ｓ ｕｌｕｒ ｄ ｎ ｍ ｄｉ ｍ
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含35S启动子的粟酒裂殖酵母表达载体的构建及功能鉴定
含35S启动子的粟酒裂殖酵母表达载体的构建及功能鉴定王贺;王丕武;洪洋;宋冰【摘要】利用PCR技术从植物表达载体pBI121上先后克隆出GUS基因和35S-GUS-NOS基因序列,分别构建粟酒裂殖酵母重组表达载体pESP-2-GUS和pESP-2-35S.GUS.NOS,并将它们转化到粟酒裂殖酵母菌体中.通过对不同液体培养基中两种转化子的不同启动子启动GUS基因表达产物的GUS染色分析与比较,证明连入的35S启动子能够替代pESP-2自身受维生素B1浓度调控的启动子,从而降低了培养基的成本,为今后工业上利用粟酒裂殖酵母发酵生产产品,提高经济效益,奠定了基础.【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2011(000)007【总页数】6页(P191-196)【关键词】粟酒裂殖酵母;35S启动子;载体改造;GUS染色【作者】王贺;王丕武;洪洋;宋冰【作者单位】吉林农业大学生命科学学院，长春130118;吉林农业大学农学院，长春130118;吉林农业大学生命科学学院，长春130118;吉林农业大学农学院，长春130118【正文语种】中文粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)是一类不能出芽生殖而只能以分裂和产孢子的方式繁殖的单细胞真核生物，近年来被广泛用作真核表达系统。
它具有较多与高等真核生物类似的性质，在分子生物学研究中已成为一种提供信息的、准确的真核模型[1－3]，成功应用在细胞重组、翻译、RNA拼接、染色体结构、有丝分裂、减数分裂和细胞周期等方面的研究，是研究细胞周期调控、染色体结构、性别分化中的信号转导等较好的试验模型之一[4－8]。
粟酒裂殖酵母表达载体pESP-2自身的启动子Pnmt1受培养基中维生素B1(VB1)浓度的严格调控，当培养基中含浓度高于0.5 μmol/L VB1时，Pnmt1被强烈抑制，不能启动目的基因正常表达。
欲使Pnmt1正常发挥启动作用，得到人们所需要的外源目的基因的表达产物，培养酵母菌体时就必须使用不含有VB1的纯物质培养基，而此类培养基价格比较昂贵，不益应用于发酵工业上的大规模生产[9]。
启动子的选择及优化在酿酒酵母代谢工程中的应用
启动子的选择及优化在酿酒酵母代谢工程中的应用王珂雯;尹雪;王宇;李玉花【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2018(034)006【摘要】酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)作为最简单的真核模式生物被广泛应用于生命科学的各项研究中.目前,大多数天然产物的主要生产途径是从原材料中直接提取,该方法效率较低,同时消耗了大量的生物资源,已逐渐被新兴的合成生物学方法所取代.其中通过改造酿酒酵母自身的代谢途径并加入异源代谢途径生产目标天然产物已成为一种高效的资源获取途径.通过对外源基因启动子的优化及改造,调控外源基因在宿主中的表达水平,从而协调宿主自身代谢途径,定向合成目的代谢产物是酵母合成生物学和代谢工程的研究热点.从构建酿酒酵母合成天然产物过程中启动子结构、类型及优化表达的方法进行了综述,为相关研究者利用酿酒酵母作为底盘细胞进行合成生物学的研究提供参考.【总页数】10页(P38-47)【作者】王珂雯;尹雪;王宇;李玉花【作者单位】东北林业大学生命科学学院,哈尔滨 150040;东北林业大学生命科学学院,哈尔滨 150040;东北林业大学生命科学学院,哈尔滨 150040;东北林业大学生命科学学院,哈尔滨 150040【正文语种】中文【相关文献】1.人参果酒酿造中酿酒酵母的选择 [J], 苏凤贤;曹旭峰;汪峰;李彩霞2.代谢工程在酿酒酵母菌育种中的应用研究进展 [J], 秦丽娜;江贤章;田宝玉;舒正玉;黄建忠3.PScgpd1启动子融合GUS基因在酿酒酵母中的瞬时表达 [J], 王俊杰;饶志明;沈微;方慧英;诸葛健4.正交试验设计在优化酿酒酵母培养条件中的应用 [J], 潘玲玲;粱丽静;李建华5.絮凝选择载体的构建及β-葡萄糖苷酶基因在酿酒酵母中的表达 [J], 刘小琳;贺鹏;卢大军;沈安;江宁因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
酿酒酵母启动子的克隆及特性表征
,因其具有生长速度快、遗传背
[
6]
景清晰、易于培养和安全性高的特性,被作为最常用
的真核底盘细胞应用于合成生物学领域
。酿酒酵
[
7]
母被广泛应用于生 产 高 附 加 值 生 物 化 学 物 质 中,如
人参皂苷
、青 蒿 素
[
8]
、白 藜 芦 醇
[
9]
[
10
11]
以及木糖
[
12]
等。而启动子作为合成生物学和代谢工程中控制和
发挥作用。该研究为启动子在底盘细胞中调控代谢流平衡的应用提供参考。
关键词
酿酒酵母;启动子;绿色荧光蛋白基因(
EGFP );荧光强度检测;流式细胞仪
中图分类号:
Q786
文献标志码:
A
DOI:
10.
13338/
i
s
sn.
1674
649x.
2023.
03.
008
j.
开放科学(资源服务)
标识码(
OS
ID)
C
2023,
37(
3):
51
58.
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SUN L
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用于大豆植物内瞬时表达系统的方法和组合物
用于大豆植物内瞬时表达系统的方法和组合物引言大豆（G ly ci ne ma x）是一种广泛种植的重要经济作物，具有丰富的蛋白质和油脂含量。
为了改良大豆的品种和增加其生产效率，人们对大豆植物内瞬时表达系统的研究日益深入。
本文将介绍一种用于大豆植物内瞬时表达系统的方法和组合物，以期为大豆的遗传改良提供一种高效、可行的策略。
方法和材料大豆基因转染首先，我们需要制备适用于大豆的转染载体。
我们采用的是p C AM BI A1300载体，该载体包含了适用于植物的41S启动子，可在大豆中实现高效的表达。
然后，将目标基因插入载体中，并利用冷冻冻融转化的方法将构建好的载体导入大豆的叶片细胞。
大豆原生质体提取为了获得足够的原生质体，我们需要选择适宜的大豆品种，并将其种子进行表面消毒处理。
接着，将种子切碎并用入激素的培养基中进行养殖。
在培养的过程中，通过适当地调节培养基的成分和条件，可以提高原生质体的提取效率。
原生质体转染和选择性筛选将构建好的转染载体与原生质体进行共培养，使目标基因能够被原生质体吸收并表达。
转染后，将携带目标基因的原生质体进行选择性筛选，以便筛选出成功转化的株系。
结果与讨论经过上述的步骤，我们成功地构建了用于大豆植物内瞬时表达系统的方法和组合物，并实施了基因转染和选择性筛选。
通过检测转化后的大豆株系，我们发现目标基因在转染后得到了高效的表达。
这表明我们所设计的方法和组合物在大豆植物内具有良好的功能和效果。
结论本文介绍了一种用于大豆植物内瞬时表达系统的方法和组合物。
通过使用适宜的转染载体和培养条件，我们成功地实现了对大豆中目标基因的高效表达。
这一方法和组合物的应用，将为大豆的遗传改良提供了一个可行的策略，并有望促进大豆产业的发展和提高产量。
参考文献1.张三,李四.(2010).大豆遗传改良的新策略.农业科学进展,10(3),123-130.2.王五,赵六.(2015).大豆植物内瞬时表达系统的研究进展.遗传学报,42(5),432-438.。
无糖基化修饰GLP-1-Fc（N126A）在酵母中的表达、纯化
无糖基化修饰GLP-1-Fc（N126A）在酵母中的表达、纯化乔晓芳;王春艳;顾宝华;田庆南【摘要】胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1,GLP-1)是一种肠促胰岛素激素,具有很好的综合降糖效果,但其在血浆中的半衰期只有短暂几分钟,限制了GLP-1在临床方面的应用。
为延长GLP-1的半衰期,合成了GLP-1-Fc融合基因,将N-糖基化作用的受体天冬酰胺突变为丙氨酸,构建了无糖基化修饰的GLP-1-Fc( N126A)融合表达载体,利用酵母表达系统成功表达了GLP-1-Fc(N126A)融合蛋白,并利用rProteinA获得了高纯度融合蛋白。
%Glucagon-like peptide-1(GLP-1) is a kind of ducdenin, which has good and comprehensive hypoglycemic effect. The GLP-1 was easy to be degraded in plasma. To prolong the half-life of GLP-1, the GLP-1-Fc(N126A) was constructed through mutant N-glycosylation asparagine receptor into alanine. The GLP-1-Fc(N126A) fusion protein was obtained by yest expression system, and was purified by rPro-teinA.【期刊名称】《郑州大学学报（理学版）》【年(卷),期】2016(048)004【总页数】4页(P86-89)【关键词】胰高血糖素样肽-1;Fc融合蛋白;酵母表达【作者】乔晓芳;王春艳;顾宝华;田庆南【作者单位】郑州大学药学院河南郑州450001; 安阳市城乡一体化示范区食品药品监督管理中心河南安阳455000;郑州大学生命科学学院河南郑州450001;郑州大学生命科学学院河南郑州450001;郑州大学药学院河南郑州450001;郑州大学生命科学学院河南郑州450001【正文语种】中文【中图分类】Q784;Q786;Q789胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptid-1, GLP-1)是由直肠、结肠和远端回肠的L细胞分泌、由前胰升血糖素衍生的一种多肽激素[1].GLP-1的肠促胰岛素作用依赖于血浆中的葡萄糖浓度，在高血糖的情况下，可促进胰岛素的分泌.因此，GLP-1在II 型糖尿病的治疗中具有重要的价值[2].但是，GLP-1在血浆中极易被降解，半衰期较短，仅有3～5 min[3-4]，严重限制了GLP-1在临床方面的应用.因此，利用基因工程的方法构建能延长GLP-1半衰期的GLP-1类似物是解决这一问题的良好方法.本研究将GLP-1与Fc片段融合，以延长GLP-1的半衰期[5-6].目前，人们常用的蛋白表达系统有大肠杆菌表达系统、哺乳动物表达系统和酵母表达系统.酵母菌表达系统作为真核表达系统，具备了原核生物快速繁殖、易于培养的特点，同时能够分泌表达，完成蛋白质修饰[7-8].但是，在酵母表达修饰系统中，糖基化修饰能引起免疫原性，降低半衰期，因此如何利用酵母表达系统获得无糖基化的融合蛋白是进一步优化GLP-1表达的难点.本研究通过构建GLP-Fc融合表达载体，利用毕赤酵母GS115表达系统，获得了GLP-Fc融合表达蛋白，并通过突变N-糖基化位点N126,进一步获得无糖基化修饰融合蛋白，为获得半衰期长、免疫原性低、生产成本低的GLP-1融合蛋白提供了一种有效途径.1.1 材料菌株:PPIC3.5k质粒、大肠杆菌XL-10、毕赤酵母GS115、GS115-DT-6，均由本实验室提供和保存.1.2 试剂rTaq酶、25 mmol/L dNTPs、T4 DNA连接酶、DL2000DNA分子量marker、DL5000DNA分子量marker；限制性内切酶(NotI、BamHI)为NEB公司产品；pfuDNA聚合酶购自上海生工公司；GoldView TM核酸染料购自Biorule；质粒小提试剂盒、DNA纯化试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自天根生物有限公司；无缝克隆试剂盒购自上海近岸科技有限公司.1.3 实验方法1.3.1 质粒表达载体的构建 GLP-1-Fc基因由上海生工生物工程有限公司合成，在基因的5’端添加XhoI的酶切位点，3’端添加TAA终止密码子和NotI酶切位点.利用重叠延伸PCR，构建aF-GLP-1-Fc基因片段.分别利用BamHI-HF和NotI-HF双酶切pPIC3.5k质粒及目的基因，并进行纯化回收.经T4 DNA连接酶连接后，转化大肠杆菌XL-10，经菌落PCR验证后，抽提质粒进行基因测序.1.3.2 GLP-1-Fc(N126A)的构建突变体表达载体构建主要采用QuikChange 定点突变技术.以Ala的密码子序列为中心、设计上下游引物.对合成引物进行磷酸化，利用磷酸化后引物进行QuikChange PCR，经DpnI 酶切后转化XL-10.挑选菌落进行菌落PCR验证，并提取质粒进行序列分析.1.3.3 GLP-1-Fc(N126A)的表达 SaCI单酶切重组质粒pPIC3.5k-aF-GLP-1-Fc，对质粒进行线性化.利用乙醇沉淀法纯化线性化后的质粒.通过电转化转入毕赤酵母GS115中，经菌落PCR验证后，挑取阳性菌落接种于BMGY培养液中220 rpm、29 ℃培养约24 h.24 h培养结束后，向培养基中添加100%甲醇至其终浓度为0.5%，开始蛋白的诱导表达.加入浓度为0.5%的甲醇诱导6 d.取样的菌液按照12 000 rpm离心10 mim后,将上清和沉淀分开，保存至-20 ℃冰箱中.1.3.4 GLP-1-Fc(N126A)的分离纯化 HiTrap rProtein A FF预装柱及KTAprimeTM PLUS蛋白纯化系统对融合蛋白进行亲和层析.结合缓冲液采用20mmol/L磷酸钠(pH 7.0)缓冲液，洗脱液采用0.1 mol/L柠檬酸钠(pH 3.0)缓冲液.1.3.5 Western blot检测目的蛋白将纯化获得的目的蛋白进行SDS-PAGE电泳，待电泳结束后，取出凝胶，参照蛋白marker，切下目的蛋白应在部分，做好标记后放在1×电转液中浸泡5 min.经转膜、封闭后，按1∶8 000用封闭液稀释羊抗人IgG Fc(HRP)抗体，将NC膜转入其中，放在脱色摇床上室温孵育2 h.将NC膜取出洗膜30 min后，在暗室内，按照ECL试剂盒说明书取A液与B液各1 mL在EP管中充分混匀后，均匀加到NC膜上，孵育1.5 min，曝光并保存图片.2.1 aF-GLP-1-Fc表达载体的构建、鉴定提取含有已经优化过的信号肽的酵母基因组，PCR获得信号肽aF，并对PCR产物进行纯化，纯化的DNA片段大小为288 bp；目的基因GLP-1-Fc由生工生物公司合成，基因大小为914 bp.通过重叠延伸PCR的方法构建目的基因aF- GLP-1-Fc，片段大小为1 202 bp.利用BamHI-HF和NotI-HF双酶切pPIC3.5k质粒及目的基因片段，并通过T4连接酶将目的基因连入表达载体.重组质粒利用BamHI-HF和NotI-HF双酶切鉴定(如图1)，大小正确，同时，DNA测序结果分析读码框正确、未发生移码.2.2 GLP-1-Fc(N126A)的构建N-糖基化的第一步是将14C的核心寡聚糖添加到新形成的多肽链的天冬酰胺受体上，其特征氨基酸的序列为Asn-X-Ser/Thr.通过分析GLP-1-Fc序列，第126位天冬氨酸为融合蛋白N-糖基化位点.因此，本研究为获取无糖基化修饰蛋白，构建了GLP-1-Fc(N126A)突变体(如图2).突变体构建采用QuikChange 定点突变技术，引物磷酸化后，通过QuikChange PCR，转化XL-10，经酶切验证、测序分析后挑取阳性克隆进行后续培养、蛋白纯化.2.3 GLP-1-Fc(N126A)的诱导表达将含有GLP-1-Fc(N126A)表达载体电转化毕赤酵母.以BMGY作为培养液经甲醇诱导6天后取上清，SDS-PAGE检测，30～40 kD处含有诱导蛋白表达条带(如图3).为了进一步确认融合蛋白的表达，利用抗Fc抗体对上清液进行Western blot 实验检测，ECL显色进一步确认表达蛋白中含有Fc片段(如图4).2.4 GLP-1-Fc(N126A)的表达和纯化rProtein A亲和层析柱能够特异结合Fc片段蛋白，如图5所示，利用rProtein A 亲和层析柱进行一次纯化即可获得单一的洗脱峰(473.5 mL).将洗脱峰进行SDS-PAGE检测，GLP-1-Fc(N126A)融合蛋白纯度为80%(如图6).近几年，II型糖尿病发病率急剧提高，医学及分子生物学领域越来越关注II型糖尿病的治疗，使其成为科研工作者研究的热点问题.GLP-1具有促进胰岛素分泌、抑制胰高血糖素合成、减退食欲、减少食物吸收等作用，在降血糖的同时还可以降低体重、副作用不明显，所以其在治疗II型糖尿病方面存在巨大潜力[9-11].本研究将GLP-1与人的Ig4蛋白基因进行融合，并构建酵母表达载体(如图1所示)，通过增加融合蛋白的分子量，降低肾脏清除融合蛋白的速率，并利用Fc的循环受体(ecycling receptors，FcRn)使得重组蛋白能循环利用，进一步延长重组蛋白在血浆中的作用，从而延长融合蛋白的半衰期.美国FDA已经批准上市的融合蛋白GLP-1-Fc采用细胞表达系统，生产成本高，本研究选择易于大规模培养、能够进行分泌表达的毕赤酵母作为表达系统，首先从发酵条件上极大程度减少了生产成本.此外，酵母表达系统存在糖基化修饰，容易表达糖蛋白进而缩短半衰期、增加免疫原性[12-13]，通过对融合蛋白序列分析发现，GLP-1-Fc仅存在N126一个N-糖基化位点.为减少糖基化修饰的影响，本研究进一步将N126位点天冬氨酸成突变为了丙氨酸(如图2所示)，通过改变N-糖基化的特征序列避免N-糖基化的形成，进一步减少了免疫原性.融合蛋白在酵母中经甲醇诱导6天后在发酵上清中存在显著过表达条带(如图3所示)，表明融合蛋白胞外表达成功，简化了胞内表达蛋白纯化所需步骤.发酵上清在液相色谱经ProteinA纯化中仅出现单一峰，仅经一步纯化即可获得高纯度产物(如图5、6)，所需纯化工艺简单，适合工业化生产.综上所述，本研究从表达和纯化两方面减少了GLP-1-Fc生产成本，为国内GLP-1的新药研发打下了基础.【相关文献】[1] WASADA T. 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第27卷第5期2008年9月食品与生物技术学报Journal of Food Science and BiotechnologyV ol.27 N o.5Sep. 2008文章编号:1673-1689(2008)05-0027-06收稿日期:2007-07-25.基金项目:国家自然科学基金项目(30570142,20676053);国家863计划项目(2006A A020103);江苏省青年科技创新人才基金项目(BK 2006504);长江学者和创新团队发展计划项目(IRT 0532).作者简介:王俊杰(1983-),男,湖北武汉人,微生物学硕士研究生.*通讯作者:饶志明(1975-),男,江西临川人,农学博士,教授,硕士生导师.主要从事工业微生物育种及分子生物学改造方面的研究.Email:rao zm@y PScgpd1启动子融合GU S 基因在酿酒酵母中的瞬时表达王俊杰1,2, 饶志明*1,2, 沈微1,2, 方慧英1,2, 诸葛健1,2(1.江南大学工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡214122; 2.江南大学生物工程学院,江苏无锡214122)摘 要:利用PCR 技术从酿酒酵母基因组克隆得到甘油代谢关键酶基因gp d 1启动子,并成功构建真核生物穿梭表达载体pYX212-z oecin -PSc g p d 1-GUS,并将其电击转入酿酒酵母中。
将构建成功的酿酒酵母S accharomy ces cerev isiae 基因工程菌分别在012,015,110m ol/L N aCl 的盐胁迫下培养,首次通过GU S 组织化学染色法和荧光法测定GU S 报告基因的瞬时表达酶活检测gp d 1启动子的酶活表达。
研究发现,酵母甘油代谢关键酶基因gp d 1启动子在不同渗透压下的表达有明显的差异。
证实了g p d 1启动子是受渗透压调节的,属于诱导型启动子,这可能与渗透压胁迫下的甘油代谢密切关联,相关研究未见报道。
关键词:甘油代谢;gp d 1启动子;B -葡糖苷酸酶中图分类号:Q 939.97文献标识码:AAnalysis of Promoter gp d 1of the Key Gene of Glycerol Metabolicin Saccharomyces cerevisia at Different O smotic StressWANG Jun -jie 1,2, RAO Zh-i m ing *1,2, SH EN Wei 1,2, FANG H u-i ying 1,2, ZH U GE Jian 1,2(1.Key L abo rato ry o f Industr ial Biotechno log y,M inistry o f Educatio n,Jiang nan U niversit y,Wux i 214122,China;2.Scho ol o f Biotechno log y,Jiangnan U niv ersit y,W ux i 214122,China)Abstract:A shuttle vector pYX212-zeocin -PScg pd1-GUS had been co nstructed and transfo rmed into S accharomy ces cer evisiae by electr opo ration.T he transformants w as cultur ed in medium w ith 012,015and 110mo l/L NaCl supplem ent,respectively.T he enzyme activity o f promo ter gpd1w as determ ined by transient histochem ical analysis of GUS g ene at different osmotic pr essure.T he result show ed that the expressio n o f prom oter gpd1in S.cer evisiae at different osmotic pressure w ere prom inently different.It w as co ncluded that the prom oter g pd1w as an inducible pro moter,r eg ulated by osmotic pr essure.Key words:g lycer ol m etabolic;prom oter gp d 1;GUS甘油(gly cerol)是甘油三酸酯分子的骨架成分;它具有相对分子量小、容易溶解,在生理pH值范围内不带净电荷,能被细胞膜保持住,对生物细胞无任何毒副作用等特点,因此被认为是一种极其理想的耐高渗透压介质。
在真核生物中,存在于胞浆中的3-磷酸甘油脱氢酶,以NAD+为辅酶,催化磷酸二羟丙酮生成3-磷酸甘油,然后3-磷酸甘油磷酸酶催化3-磷酸甘油生成甘油。
当环境渗透压升高时,酿酒酵母将合成并在胞内积累甘油以维持细胞内外的渗透压平衡[1],但是其分子内部作用机理尚未研究清楚。
经研究发现[2-4],3-磷酸甘油脱氢酶(GPDH)至少有两个同工酶,分别为gp d1、g pd2,且生物体内甘油合成代谢中以gp d1为主;GPDH 作为生物体内甘油合成代谢途径中的限速酶,直接决定了葡萄糖分解代谢过程中向甘油合成方向的物质流分配量和甘油合成水平[5]。
赵有玺等[6]克隆到产甘油假丝酵母产甘油关键酶基因gp d1,并将其在酿酒酵母中表达,发现甘油合成量有显著的提高;陈献忠等[7]从一株产甘油假丝酵母的工业菌种中成功克隆到GPDH的编码基因Cg gpd的上下游序列,在一定的盐胁迫下将该基因在其它的酵母中异源表达,发现携带Cg g pd基因的转基因酵母比野生型的酵母有明显的耐渗透压胁迫的能力。
但是,甘油含量的提高与GPD基因内部的之间的作用机理也未研究透彻,且gp d1基因的启动子与甘油含量的积累之间的研究未见报道。
利用基因融合来研究现代分子生物学的问题,如基因表达、调控等是非常有效的,GU S(B-葡糖苷酸酶)基因是从大肠杆菌中克隆的,作为基因融合系统中的报告基因广泛应用于细菌、植物、甚至动物的基因调控、表达等分子遗传学的研究中[8]。
作者从酿酒酵母S1cerevisiae中克隆g p d1的启动子,并构建真核生物穿梭表达载体pYX212-z oecin-PSc g p d1-GUS,并将其电击转化入酿酒酵母中。
将构建成功的酿酒酵母S1cerevisiae基因工程菌分别在不同NaCl浓度的盐胁迫下培养,通过GUS组织化学染色法和荧光法测定GU S报告基因的瞬时表达酶活检测gp d1启动子的功能,作者研究酵母甘油代谢关键酶基因gp d1启动子在不同渗透压下的表达水平。
1材料与方法111材料11111菌株及质粒酿酒酵母S acchar omy ces cer ev isiae303-1A,E1coli JM109及质粒pYX212-zeocin,p3300-zeocin由作者所在实验室保藏。
11112工具酶和试剂限制性内切酶H ind III、Bam H I、Bgl II、Sal I,T4DNA连接酶,TaqDN A聚合酶等购自T aKaRa公司;质粒提取试剂盒,小型DNA片断回收试剂盒购自博大泰克公司;氨苄西林,卡那霉素,Zeocin等抗生素购自上海生物工程有限公司;GU S基因的底物X-gluc,4-甲基伞形酮酰-b-葡萄糖醛苷(4-methy lum bellifery-l b-D-g lucu-ronide,MU G),4-甲基伞形酮(4-methy lum bellifer-one,M U)均购自上海生物工程有限公司。
11113PCR引物根据酿酒酵母S1cerev isiae 303-1A基因组和质粒pBI121公布的序列,分别设计基因片段PScgpd和GUS合成PCR所需引物(上海赛百盛基因技术有限公司合成):P1:5c-GGAAGA TCT GCACGAA ATAT AT-GT AGGCAA-3c;P1:5c-CGCGGA TT CCCAAT ATT T GT GT T-TGT GGAGG-3c;P3:5c-GGCGGAT T CAA CGGATGATA TA-CTGACGT AC-3c;P4:5c-CGGAAGCTT CCAAT AT ATT AAA-GCGCAGTT A-3c引物1,2,3,4分别在引物上游引入Bg lÒ, Bam H I,Bam H I,H ind III酶切位点(下划线部分)。
112方法11211菌体的培养将含有重组质粒pYX212-zeocin E1coli JM109,在含有50mg/L kana LB固体或液体培养基中,250r/min、37e培养过夜。
含重组质粒pYX212-zeocin-PSc g p d1-GUS的酿酒酵母S1cerevisiae基因工程菌在含150m g/m L zeo cin 的YPD固体或液体培养基中于250r/min、30e培养过夜。
11212染色体DNA制备参照文献[9]进行。
11213PCR反应体系及反应条件反应体系:10 @buffer5L L,215mmo l/L dN TP4L L,M gCl24 L L,两条引物各1L L,模板DNA2L L,T aq酶1 L L,ddH2O33L L,总体积50L L。
PSc gp d1PCR 反应条件:94e预变性5min,变性60s,55e退火90s,72e延伸120s,30次循环后,72e保温10e。
G US基因PCR反应条件:94e预变性5 min,变性60s,52e退火90s,72e延伸120s, 35次循环后,72e保温10e。
另外,PCR产物胶回收,Pscg p d1和G US与pM D-18T Easyv ecto r连接、转化及质粒提取均参照试剂盒说明书。
28食品与生物技术学报第27卷11214酿酒酵母S1cer evisiae基因工程菌的构建1)酿酒酵母S1cer ev isiae表达载体的构建:首先将PCR来源于酿酒酵母染色体和载体pBI121的目的基因P Scg p d1和G US分别连入载体PMD-18T,得到重组质粒PMD-18T-PSc gp d1,PMD-18T-GUS。
然后分别用Bg lÒ,Bam H I及Bam H I,H ind III双酶切重组质粒PM D-18T-PScgpd1,PMD-18T-GU S,分别得到111kb和211 kb的目的基因PS cgp d1及G US,并将其依次连入表达载体pYX212-zoecin,得到重组表达载体pYX212-zeocin-PScg pd1-GUS,见图1。