经紫外光处理的双孢蘑菇中维生素D2和麦角甾醇的含量——以HPLC及液

•56 •嘉兴学院学报J o u r n a l o f J i a x i n g U n i v e r s i t y第29卷第6期2017年11月Vol.29 No.62017.1110. 3969/i.issn. 1671-3079. 2017. 06. 011经紫外光处理的双孢蘑菇中维生素D2和麦角甾醇的含量—以HPIC及液-质联用法分析童梦楠，徐紫玉，陆梦梦，伍娇凤，屠婕红(嘉兴学院医学院，浙江嘉兴314001)摘要：通过建立一种食用菌中维生素D£和麦角甾醇的提取及检测方法，来定量测定经UV-B照射后 栽培的双孢蘑菇中维生素1)£和麦角甾醇的含量.经检测，双孢蘑菇中维生素1)£的含量随着UV-B照射时间的延长显著增加，照射3min、5min、10 min、20 m in和30 m in时，维生素D2的含量分别为2.28即-呂—1、6.22叫-呂—1、14.40叫-呂—1、18.98叫-呂—1和23.35叫-呂—1(干重）.该方法稳定、操作简便，适用于同时测定食用菌中维生素仏和麦角甾醇的含量.该研究为综合评估食用菌中维生素1)2活性化合物提供了一种有效的技术手段，为探讨将UV-B照射后的双孢蘑菇作为维生素D£食物来源补充剂的可能性提供了科学依据.关键词：双孢蘑菇；含量测定；维生素1)2;麦角甾醇；HPLC中图分类号：S646 文献标志码：A文章编号：1671-3079(2017)06-0056-06HPLC and UPLC-MS/MS Analysis of the Contents of Vitamin D2 and Ergosterol in Agaricus Bisporus After UV TreatmentTong M cngnan,Xu Ziyu,Lu M cngmcng，W u Jiaofcng，Tu Jichong(C ollege of M edicine，Jiaxing University，Jiaxing，Zhejiang314001 )Abstract：A m eth od for extraction an d detection of vitam in D2an d ergosterol in ed ible fun gi is established in order to quantitatively determ ine th e contents of them in cultivated Agaricus bisporus after UV-B irradiation.The results show thatw ith th e prolong of thcUV-B irradiation，th e con ten t of vitaminD2inAgaricus bisporus rises significantly.After UV-B treat­m en t of3m in， 5m in，10m in，20 m in an d30m in，th e vitaminD2contents inAgaricus bisporus arc2.28 /乂g•g—1，6.22 pg•g—1，11. 10/ig•g—1，18.98pg•g—1an d23.35pg•g—1respectively.This m eth od is stable an d easy to b e carried ou t sothat it is s uitable for th e con ten t determ ination of both vitam in D2 a n d ergosterol at th e sam e tim e.This study provides an ef­fective tech n iq ue for th e com prehensive evaluation of th e active com poun ds of vitam in D2in ed ible fungi，ic basis for probing in to th e possibility of using UV-B irradiated Agaricus bisporus as a supplem ent of dietary vitaminl)2.Key word s：Agaricus bispous;con ten t determ ination;vitaminl)2;ergosterol;HPLC维生素D具有广泛的生物学效应，缺乏维生素D除了能够导致小儿徇偻病及成人软骨病外，还与心血管疾病、代谢综合征、自身免疫疾病、感染和癌症等相关联.3]阳光诱导表皮7-去氢胆甾醇转化为维生素D3是人体维生素D的主要来源，由于户外活动日趋减少的生活方式，以及增加使用防晒霜和冬季低紫外线照射等原因，全球超过十亿人患有维生素D缺乏症.[4]食物是维生素D的另一重要来源，但富含）3的食物仅限于海鱼、黄油和其他个别动物产品，食用菌被认为是极少的非动物性收稿日期：2016-06-24基金项目：浙江省分析测试科技计划项目（2015C37048);嘉兴学院重点S R T项目（851715068)作者简介：童梦楠（993—)，女，浙江宁波人，嘉兴学院医学院药学系121班学生.网络出版时间：2017-10-24 13: 35: 04 网络出版地址：http：//：k cm s/detail/33.m3.Z.20m024.1335.022.htm l童梦楠，徐紫玉，陆梦梦，等：经紫外光处理的双孢蘑菇中维生素1)2和麦角甾醇的含量•57 •维生素D的食物来源，但其存在形式麦角甾醇本身很难被人体吸收利用，只有接受紫外线照射后，才能合成大量维生素.因此，探究栽培食用菌采摘后或在生长后期采用紫外线处理以增加食用菌产品的营养价值，对于寻找除了海鱼外，维生素D的其他食物来源具有重要的意义.[57]本文通过建立双孢蘑菇中维生素和麦角甾醇的H P L C、液-质联用分离分析方法，鉴定和定量分析经U V-B照 射后栽培的双孢蘑菇中维生素）2和麦角甾醇的含量变化，筛选紫外光照射条件，为研究高维生素的食用菌功能性食品奠定基础.1仪器与材料Agilent 1200型高效液相色谱仪（安捷伦公司）W a t e r s I C T P r e m ie r X E液-质联用仪（美国 W aters公司）C R YO D O S-50型冷冻干燥机（西班牙艾提艾斯科学医药公司）3-30K型低温高速离心机（德国S IG M A公司）R E52-99旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）K Q-500D E数控超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）灵巧粉碎机（D J-04B，上海淀久中药机械有限公司）.维生素D2对照品（100155-201207，纯度99 %，中国食品药品检定研究院）麦角甾醇对照品(111845-201403,纯度99 %，中国食品药品检定研究院）双孢蘑菇（嘉兴“天天农展会”蘑菇种植基地新鲜采摘）甲醇、乙腈（色谱纯，M e rc k公司）其余试剂均为分析纯；水（用作H P L C或 U P L C-M S/M S流动相的水均由饮用水经超纯水机处理而得）.2方法与结果2.1 U V-B照射处理新鲜采摘的双孢蘑菇，切成约5 m m厚的切片，置于托盘上单层排列.U V光源以固定的光谱输出（为285〜350 nm)安装在离双孢蘑菇片10〜11 c m处，给予设定剂量的辐照度（16 W/m2)，在室温下分别照射0 m in、3 m in、5 m in、10 m in、20 m in和30 m in，以上处理的每份样品为400 g.粉碎成糊状，立即在一 70 °C冷冻干燥，所有的制备步骤避光操作.样品粉末置于棕色瓶中，一20 °C 下密封保存.2. 2对照品溶液精密称取麦角甾醇和维生素D2对照品各25 m g，分别置于100 m l棕色量瓶中，加80 m l甲醇 超声助溶1m in后，再用甲醇定容，制成质量浓度为250 •m l1的对照品储备溶液.2.3超声辅助提取制备供试品溶液取双孢蘑菇冻干粉末4 g，精密称定，置于250 m l棕色圆底烧瓶中，分别用正戊烷80 m L、80 m L、50 m l超声提取三次，15 C下超声处理10 m in，4 C下4000 r.min1离心分离15 m in，合并 有机层置另一 250 m L棕色圆底烧瓶中，用旋转蒸发仪除去溶剂，残渣加甲醇3.0 m L复溶，超声辅助溶解1m in，4 C下3(00 r •min1离心10 m in，分取上清液，经微孔滤膜过滤后进行色谱质谱分析.2. 4液质联用鉴定化合物双孢蘑菇中维生素D2和麦角甾醇通过与对照品比较进行鉴定，选择的样本进行超高效液相色谱-质谱分析，结果见表1.液-质条件：色谱柱为Waters Acquity U P LC B E H-C18柱（100 m m X2.1 m m，1. 7;_im)流动相为甲醇：2 mmol •L1乙酸铵（90 :10)流速0. 2 m L •mim1 ;柱温为25 C;进样量5 p L;电喷雾离子化源（E S I)毛细管电压4000 V;脱溶剂气温度350 C，脱溶剂气流量9. 00L*m i m S雾化器（氮气）压力为275.8 k p a;数据采集模式Centroid;扫描时间0.2 s.•58 •嘉兴学院学报第29卷第6期表1维生素1)2和麦角甾醇的鉴别组分保留时间/min定性离子实测质量数/I)a洗脱方式维生素I)22.95[2M+NH,]+810. 7265等度麦角甾醇4.61[M+CH3COONH,]+474.3473等度根据维生素D2和麦角甾醇的保留时间以及它们各自的[2M+N H J或[M+C H^O O N H,] 进行定性确定，结果见图1和图2.咖]*100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 ' 600 ' 650 700 750 800 850 900 950 ' 1000 '图1维生素I)2的ESI+质谱图100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 1000 ^图2麦角甾醇的ESI+质谱图童梦楠，徐紫玉，陆梦梦，等：经紫外光处理的双孢蘑菇中维生素1)2和麦角甾醇的含量•59 •2. 5定量分析色谱条件[9]色谱柱：八忍丨1^乂）?){18(4.6爪爪乂150爪爪，5,仰）；流动相：乙腈：甲醇=50:50;检测波长：265 n m和282 nm(265 n m项下主要检测维生素D2,282 n m项下主要检测麦角甾醇）；柱温：30 °C;流速：1m L.mim S进样量：10 ;_i L;洗脱方式：等度洗脱.2.6 H P L C定量方法学考察2.6.1 线性范围和检测限（LO D)依次精密量取对照品储备液1m L、3 m L、5 m L、7 m L、11m L、13m L、15m L分别置于50m L量瓶中，用甲醇稀释至刻度，按“2. 5”色谱条件，进样10pL 进行测定.[10]以峰面积Y为纵坐标，浓度X为横坐标进行线性回归.按信噪比（S/N = 3)、（S/N = 10)分别确定检测限浓度和定量限浓度.2. 6. 2重复性试验取经U V-B照射5 m in的双孢蘑菇样品，按“2. 3”方法处理，平行制备6份同 一浓度的样品溶液，分别进样10丨丄，记录峰面积，计算含量平均值和R SD.2. 6. 3稳定性试验取样品测定项下溶液，按“2. 5”色谱条件，分别在时间为0h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h和24 h进样测定（=3)，期间样品室温避光下放置，记录峰面积，计算R SD.2. 6. 4加样回收试验精密称取6份U V-B照射5 m in的冻干样品粉末2 g，分别置于100 m L棕色 容量瓶中，分别精密加人对照品溶液1m L(维生素D2浓度为45;g •m L、麦角甾醇浓度为65 fg*m L1)，另取3份测定本底值.按“2. 3”项下制备供试品溶液，进行色谱分析，测得峰面积代人回归方程，计算结果U =6)见表2.表2维生素1)2和麦角甾醇的线性方程、相关系数、回收率及检测限等组分维生素I)2麦角甾醇线性回归方程Y = 24.35X+ 5.8921Y = 12.88 X+ 17.496r0.99990.9997线性范围/g•mL—13〜755〜75LO D/g•mL—10.4 1.LOQ々g•mL—11.346回收率/%99.1〜100.288.20—102.3RSD/%重复性1.30.87稳定性0.690.862.7经U V-B处理后双孢蘑菇中维生素D2和麦角甾醇的含量分析根据标准曲线分别测定经U V-B照射0 m in、3 m in、5 m in、10 m in、20 m in和30m in后，双抱 蘑菇中维生素D2和麦角甾醇的含量.按“2.3”项下配制供试品溶液，“2.5”项下色谱条件测定经U V-B照射不同时间后各样品中维生素D2和麦角甾醇的含量，结果见表3和图3,其中麦角甾醇和维生素D2含量与紫外辐射时间关系见图4.表3UV-B照射不同时间样品中维生素1)2与麦角甾醇含量测定结果（=3)编号123456照射时间/m in035102030维生素1)2浓度/g• m L-10 2.94159.6512.6515.57维生素D2含量//_ig • g-1 (干重）0 2.28 6.22144 018.9823.35麦角甾醇浓度/g• m L-1344133.6132.2732.3128.041 6.46麦角甾醇/g• g—1(干重)51.6350.4248.4248.4 742.072470• 60 •嘉兴学院学报第29卷第6期由上可知，新鲜采摘的双孢蘑菇，未经U V -B 照射时，没有检测到维生素D 2，经U V - B 照射3〜 30 m in 内，维生素02的含量随着照射时间的延长 而增加；而在照射20 m in 以上时，麦角甾醇的含量 则显著降低.3讨论3.1紫外照射光源的选择试验中比较了 U V -B (280〜315nm )、U V -A (315〜400 nm )、U V -C (200〜280 nm )作为照 射光源时，对维生素D 2含量的影响，发现双孢蘑 菇暴露于U V -B 下更有利于形成维生素02.但若长 时间（>60min )暴露于U V -B 下，会产生光甾醇 2 (Lum isterol 2)和速甾醇 2 (Tachysterol 2)等 光解产物，反而使维生素D 2含量下降，因此， U V -B 照射时间最长设计为30 min .5l '〇15时间/min图3双孢蘑菇提取物及对照品的HPLC 图谱a . 未经紫外处理的双孢蘑菇超声辅助提取物；b . 经紫外处理5 m in 的双孢蘑菇超声辅助提取物;c . 维生素D 2对照溶液；d .麦角留醇对照溶液；------------------------------- e .空白溶液''''15 ' ' ' 'i''注：1-维生素D 2 ;2-麦角甾醇时间/min5050505 2075207521i 1«1^11習5 0 57 5 2n y l u /l f j -^'f f 0 50 5201715121005050505201715121075. 2nw i s t r 语i/迴雪童梦楠，徐紫玉，陆梦梦，等：经紫外光处理的双孢蘑菇中维生素1)2和麦角甾醇的含量•61•3.2色谱条件的优化定量分析时，比较了甲醇-乙腈、甲醇-水、乙腈-水不同比例组成的流动相体系对目标物检测的影响.结果表明，乙腈对维生素）2的洗脱能力小于甲醇，如乙腈：甲醇分别为50 :50和80 :20时，维生素的保留时间分别为9. 48 m in和12. 06 min.根据分离情况和保留时间合适程度，同时对柱 温、进样量、检测波长等其他色谱分离条件进行优化，最后确定“2. 5”项下所述色谱条件，使被分析成分之间得到很好的分离，获得较满意的检测结果.4结论本实验建立的RP—H P L C法结合液-质联用方法鉴定并定量检测双孢蘑菇中维生素D2及麦角甾 醇的含量，具有操作简便、灵敏度高等特点，为评估紫外光诱导双孢蘑菇中维生素前体物质的转化过程提供了一种可靠的分析手段，采用的样品前处理和分析方法，不仅适用于双孢蘑菇，也适用于 其他食用菌中维生素D2原光解产物的准确检测.经检测，在本实验设定的U V-B照射条件下可以使双孢蘑菇中维生素D2的含量显著提高，照射30 m in时维生素D2的含量达到23. 35丨g •g1(干 重）按照人体400丨g*day1的需求量，每日只要服用约15g该双孢蘑菇粉，可基本满足人体对维生素D的需求，为食用菌作为维生素D2食物来源的补充剂提供了有力的科学依据.参考文献：[丄]CALVO M S，W HITING S J. 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