蛋白质浓度测定——考马斯亮蓝染色法(实验报告)
实验 考马斯亮蓝法测定蛋白质含量
实验五考马斯亮蓝法测定蛋白质含量一、实验目的1.掌握考马斯亮蓝染色法定量测定蛋白质含量的原理与方法2.熟练分光光度计的使用和操作方法。
二、实验原理考马斯亮蓝G250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种，它与蛋白质的疏水微区相结合，这种结合具有高敏感性。
它在酸性溶液中呈棕红色，最大光吸收峰在465nm，当它与蛋白质结合形成复合物时，其最大吸收峰改变为595nm。
考马斯亮蓝G-250—蛋白质复合物呈蓝色，在一定范围内，595nm下光密度与蛋白质含量呈线性关系，故可以用于蛋白质含量的测定。
考马斯亮蓝结合法是近年来发展起来的蛋白质定量测定法，本方法具有操作方便、快速、干扰因素少的特点。
离心机的使用说明： 1.要离心的离心管和管套要称重，重量不等时将水加在管套里。
2．离心管的放置是对角线放置，要求必须对称。
3. 先将离心机转速旋钮恢复到零刻度后，再定时间，定好时间后缓慢旋转转速旋钮，使离心机均匀的提速到预定转速。
分光光度计的使用说明： 1.接通电源开关，预热20min后，再选择须用的单色光波长。
2.放入已加入溶液的比色皿，盖上样品室盖，推动试样架拉手，使对照比色皿（溶液装入4／5高度，置第一格）置于光路上，调节100％透射比按钮，使吸光度值A=0.00。
3.推动试样架拉手，使样品比色皿置于光路上，读出吸光度值。
4.测量完毕，取出比色皿，洗净后置于乙醇溶液中浸泡脱色。
5.电源开关置于“关”，拔下电源插头。
三、试剂与器材：1. 试剂：（1）0.9％NaCl：9g NaCl溶解在1L的容量瓶中。
（2）标准蛋白质：称取50mg结晶牛血清蛋白定溶于50ml容量瓶里。
（3）染液：考马斯亮蓝G-250 0.5g，溶于250mL95%乙醇，再加入500mL85％(W／V)磷酸，保存于棕色瓶中，称为母液。
取150 mL然后加蒸馏水定容到1000mL，保存于棕色瓶中，备用。
2.器材：试管；吸管10mL、l5mL、lmL、0.1mL；722分光光度计四、操作方法1.标准曲线的制备取6支试管，按下表加入各试剂：以各管相应标准蛋白质含量（mg）为横坐标、A595为纵坐标，绘制标准曲线。
蛋白质含量测定实验报告
一、实验目的1. 理解并掌握考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的原理和操作步骤。
2. 学习使用分光光度计进行比色分析。
3. 通过实验，掌握蛋白质含量测定的实际操作，提高实验技能。
二、实验原理考马斯亮蓝法是一种快速、简便的蛋白质定量方法。
该法基于蛋白质与考马斯亮蓝G-250染料的结合，蛋白质含量与染料结合程度呈线性关系。
通过测定溶液在特定波长下的吸光度，可以计算出蛋白质的含量。
实验原理：蛋白质分子中的肽键在碱性条件下能与考马斯亮蓝G-250染料发生结合，形成有色的复合物。
该复合物在特定波长下有特征性吸收峰，其吸光度与蛋白质含量呈线性关系。
三、实验材料1. 蛋白质标准品（如牛血清白蛋白）。
2. 考马斯亮蓝G-250染料。
3. 6.0mol/L NaOH溶液。
4. 双蒸水。
5. 分光光度计。
6. 试管、移液器、吸管等实验器材。
四、实验步骤1. 标准曲线制作：将不同浓度的蛋白质标准品配制成溶液，分别加入考马斯亮蓝G-250染料，在特定波长下测定吸光度，绘制标准曲线。
2. 样品处理：取待测样品，按照一定比例稀释，加入考马斯亮蓝G-250染料，在特定波长下测定吸光度。
3. 数据处理：根据标准曲线，计算待测样品中的蛋白质含量。
五、实验结果与分析1. 标准曲线制作：根据实验数据，绘制标准曲线，得出线性方程。
2. 样品处理：取待测样品，按照一定比例稀释，加入考马斯亮蓝G-250染料，在特定波长下测定吸光度。
3. 数据处理：根据标准曲线，计算待测样品中的蛋白质含量。
实验结果显示，待测样品中的蛋白质含量为XX g/L。
六、实验讨论1. 实验过程中，应注意操作规范，避免污染和误差。
2. 在制作标准曲线时，应选择合适的浓度范围，保证线性关系良好。
3. 待测样品的稀释倍数应根据实际浓度选择，以保证在检测范围内。
4. 在测定吸光度时，应注意仪器校准和操作，避免误差。
七、实验总结本次实验通过考马斯亮蓝法测定了待测样品中的蛋白质含量，实验结果准确可靠。
蛋白质含量的测定考马斯亮蓝染色法
1 2
洗涤
用洗涤液洗涤染色后的蛋白质样品，去除多余的 染料。
测量
使用分光光度计测量蛋白质样品的吸光度值。
3
结果计算
根据标准曲线和吸光度值计算蛋白质含量。
04
结果分析
数据记录与整理
数据记录
在实验过程中，应详细记录每个实验 组的吸光度值，包括空白对照组。
数据整理
将实验数据整理成表格，包括实验组 别、吸光度值以及相应的波长等。
VS
药物研发
在药物研发过程中，考马斯亮蓝染色法可 用于评估药物对蛋白质表达的影响，为新 药研发提供实验依据。
未来发展方向与挑战
技术优化
随着科学技术的不断发展，考马斯亮蓝染色法需要不断优化和完善， 以提高检测的灵敏度和特异性。
应用领域拓展
随着蛋白质组学研究的深入，考马斯亮蓝染色法的应用领域将进一 步拓展，为生命科学和医学研究提供更多支持。
蓝色与黄色
考马斯亮蓝染色后呈蓝色，与未结合蛋白质的黄色形成鲜明对比，便于观察和 检测。
颜色深浅与浓度正相关
随着蛋白质浓度的增加，染色后样品的颜色逐渐加深，通过比色法可测定出不 同浓度下的光密度值，进而计算出蛋白质浓度。
03
实验步骤
样品准备
样品收集
蛋白质提取
选择具有代表性的样品，确保样品新 鲜、无污染。
05
应用与展望
在生物学领域的应用
蛋白质表达分析
考马斯亮蓝染色法常用于检测细胞或组织中蛋白质的表达水平，有助于研究生物体的生 理和病理过程。
蛋白质分离与鉴定
通过考马斯亮蓝染色法对蛋白质进行染色，可以方便地对蛋白质进行分离和鉴定，为蛋 白质组学研究提供技术支持。
在医学领域的应用
生化综合实验报告--测定蛋白质含量的三种方法及其比较
①容量瓶②试管及试管架
③恒温水浴槽④吸量管
⑤分光光度计⑥电热套
⑦锥形瓶⑧比色皿
(3)紫外吸收法
试剂:
样品蛋白溶液:准确称样品蛋白质,配制成一定浓度的溶液。
器材:
①紫外分光光度计②容量瓶
③试管、试管架④吸量管
⑤锥形瓶⑥比色皿
4．实验方法步骤及注意事项
双缩脲法
标准曲线的绘制:
取12支试管分成两组，按下表平行操作，绘制标准曲线。
实验远没有我想象的那样简单，要想做好一个实验，容不得半点马虎。综合实验正是这培养了我们的耐心、恒心和信心，让我们的思维和创造力得到了大幅度的提高，让我们的科学素养有了很大的飞越。真真正正变学生的被动学习为主动学习，激发了我们的学习热情，不管实验成功或是失败，我们都能从中获得很多从其它地方得不到的知识，让我们获益匪浅！
若样品中含有大量吸收紫外线的物质，会出现较大的干扰。
5.实验数据处理方法
双缩脲法
试
剂
0
1
2
3
4
5
样品1
样品2
O．D540
0
0.021
0.052
0.160
0.316
0.345
0.08
0.029
标准蛋白质浓度(mg/ml）
0
1
2
3
4
5
X
Y
考马斯亮蓝染色法
试
剂
0
1
2
3
4
5
样品1
样品2
蛋白质浓度（ug/ml）
样品测定:
①制备样品的蛋白质提取液。
②取出两份1.0 ml样品液。操作同标准曲线，测定样品的OD值，平行两份
计算:
实验考马斯亮蓝测蛋白质含量
实验考马斯亮蓝测蛋白质含量本实验旨在研究一种蛋白质染色测定的方法，即考马斯亮蓝法测定蛋白质含量。
该方法基于蛋白质对酸碱滴定指示剂颜色变化的影响，使用考马斯亮蓝G-250作为染料，通过疏水作用与蛋白质相结合形成蛋白质染料复合物，再通过比色测定吸光值来测定蛋白质含量。
标准曲线的制作包括取7支试管，加入不同浓度的标准蛋白溶液和考马斯亮蓝试剂，摇匀后放置20分钟，再用分光光度计比色测定吸光值A595nm，以A595nm为纵坐标，标准蛋白质浓度为横坐标，绘制标准曲线。
样品的测定包括取一支试管，加入未知浓度的蛋白质溶液、蒸馏水和考马斯亮蓝试剂，摇匀后放置20分钟，再比色测定吸光值A595nm，对照标准曲线求得蛋白质的浓度。
需要注意的是，该方法适用范围为0.01-1.0mg蛋白质/ml，不同蛋白质之间差异大，标准曲线线性差，且高浓度的Tris、EDTA、尿素、甘油、蔗糖、丙酮、硫酸铵和去污剂时测定有干扰。
缓冲液浓度过高时，改变测定液pH值会影响显色。
考马斯亮蓝染色能力强，比色杯不洗干净会影响光吸收值，不可用石英怀测定。
1、染料本身的两种颜色形式的光谱有重叠，因此与蛋白质结合的染料增加会导致试剂背景值不断降低。
当蛋白质浓度较大时，标准曲线会稍有弯曲，但直线弯曲程度很轻，不会影响测定结果。
2、测定工作应在蛋白质染料混合后2分钟开始，力争1小时内完成。
否则，蛋白质一染料复合物可能会发生凝集沉淀，影响测定结果。
实验报告应绘制标准曲线，并将实验结果与其他蛋白质测定方法进行比较分析。
思考题：1、考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的原理是通过蛋白质与染料结合后产生的颜色变化来测定蛋白质含量。
2、Bradford法的优点是灵敏度高，测定快速、简便，只需要加一种试剂。
干扰物质相对于其他方法较少。
缺点是不同蛋白质测定时有较大的偏差，仍有些物质干扰此法测定，标准曲线也有轻微的非线性。
在操作时，不可使用石英比色皿，应使用塑料或玻璃比色皿，并立即用少量95%的乙醇荡洗，以洗去染色。
蛋白质浓度的测定
实验九蛋白质浓度的测定(四)──考马斯亮蓝染色法目的要求学习考马斯亮蓝（Coomassie Brilliant Blue）法测定蛋白质浓度的原理和方法。
实验原理考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质―染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。
考马斯亮蓝G―250存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。
它和蛋白质通过范德华力结合，在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律（Beer’s law）。
此染料与蛋白质结合后颜色有红色形式和蓝色形式，最大光吸收由465nm变成595nm，通过测定595nm 处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。
蛋白质和染料结合是一个很快的过程，约2min即可反应完全，呈现最大光吸收，并可稳定1h，之后，蛋白质―染料复合物发生聚合并沉淀出来。
蛋白质―染料复合物具有很高的消光系数，使得在测定蛋白质浓度时灵敏度很高，在测定溶液中含蛋白质5µL/ml时就有0.275光吸收值的变化，比Lowry法灵敏4倍，测定范围为10－100µg蛋白质，微量测定法测定范围是1－10µg蛋白质。
此反应重复性好，精确度高，线性关系好。
标准曲线在蛋白质浓度较大时稍有弯曲，这是由于染料本身的两种颜色形式光谱有重叠，试剂背景值随更多染料与蛋白质结合而不断降低，但直线弯曲程度很轻，不影响测定。
此方法干扰物少，研究表明：NaCl，KCl，MgCl2，乙醇，（NH4）2SO4无干扰。
强碱缓冲液在测定中有一些颜色干扰，这可以用适当的缓冲液对照扣除其影响。
Tris，乙酸，2―巯基乙醇，蔗糖，甘油，EDTA及微量的去污剂如Triton X―100，SDS，玻璃去污剂有少量颜色干扰，用适当的缓冲液对照很容易除掉。
但是，大量去污剂的存在对颜色影响太大而不易消除。
试剂与器材一、试剂考马斯亮蓝试剂：考马斯亮蓝G―250 100mg溶于50ml95%乙醇中，加入100ml85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000ml，滤纸过滤。
试验一考马斯亮蓝G-250染色法蛋白质定量
考马斯亮蓝G-250染色法是一种常用的蛋白质定量方法，具有灵敏度高、操作简 便、结果准确可靠等优点。该方法基于蛋白质与染料考马斯亮蓝G-250之间的特 异性结合，通过比色法可实现对蛋白质的定量检测。
试验原理
蛋白质与染料的结合
考马斯亮蓝G-250是一种阴离子染料，在酸性条件下可与蛋白质中的碱性氨基酸（如精氨酸、赖氨酸等）发生静 电相互作用，形成蛋白质-染料复合物。该复合物在595nm波长处有最大吸收峰，且吸光度与蛋白质浓度成正比。
避免染色液溅到皮肤和眼睛。
改进建议
优化染色条件
可以尝试调整染色液的pH值、离子 强度等条件，以提高染色的灵敏度和 特异性。
增加标准品数量
在制作标准曲线时，可以增加标准品 的数量，以覆盖更广泛的蛋白质浓度 范围，提高定量的准确性。
引入内标法
通过添加内标物，可以校正实验操作 过程中可能引入的误差，提高结果的 可靠性。
06
注意事项与改进建议
注意事项
样品处理
确保样品中无干扰物质，如去 污剂、还原剂等，以避免影响
染色结果。
标准曲线制作
制作标准曲线时，应使用与待测 样品相同或相似的蛋白质作为标 准品，以确保结果的准确性。
染色液配制
考马斯亮蓝G-250染色液应新 鲜配制，避免长时间存放导致 试剂失效。
操作规范
在操作过程中，应遵循实验室安 全规范，佩戴防护眼镜和手套，
标准品测定
将不同浓度的标准品与考马斯亮蓝G250染液混合，静置一定时间后，在 分光光度计上测定吸光度。
样品测定
样品处理
将待测蛋白质样品进行适当稀释 和处理，以获得适合测定的浓度
范围。
样品测定
实验考马斯亮蓝测蛋白质含量
实验7 考马斯亮蓝考G-250染色法测定蛋白质含量一、目的1、学习一种蛋白质染色测定的方法2、掌握考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的基本原理和方法二、原理蛋白质的存在影响酸碱滴定中所用某些指示剂的颜色变化，从而改变这些染料的光吸收。
在些基础上发展了蛋白质染色测定方法。
涉及的指示剂有甲基橙、考马斯亮蓝、溴甲酚绿和溴甲酚紫。
目前广泛使用的染料是考马斯亮蓝。
考马斯亮蓝G-250在酸性溶液中为棕红色，其所含疏水基团在酸性条件下与蛋白质的疏水区具有亲和力，通过疏水作用与蛋白质相结合，形成蓝色的蛋白质染料复合物，在595nm处有最大吸光度，在一定的蛋白质浓度范围内，蛋白质染料符合物在595nm处的吸光度与蛋白质杭亮成正比，因此可用于蛋白质含量测定。
反应2—5分钟即呈最大光吸收，至少稳定1小时。
在0.01—1.0 mg蛋白质/ml范围内均可。
该法操作简便迅速，消耗样品量少，但不同蛋白质之间差异大，且标准曲线线性差。
高浓度的Tris、EDTA、尿素、甘油、蔗糖、丙酮、硫酸铵和去污剂时测定有干扰。
缓冲液浓度过高时，改变测定液pH值会影响显色。
考马斯亮蓝染色能力强，比色杯不洗干净会影响光吸收值，不可用石英怀测定。
三、材料、试剂与器具（一）试剂1、染色液：取考马斯亮蓝G-250 100mg溶于50ml 95%乙醇中，加100ml 85%磷酸，加水稀释至1升。
棕色瓶保存，该染色液可保存数月，若不加水可长期保存，用前稀释。
2、标准蛋白溶液：0.5mg/ml牛血清白蛋白。
3、未知浓度的蛋白质溶液用酪蛋白配制，浓度控制在10—30mg/ml（二）器具1、试管及试管架2、移液管（1ml,5ml）3、可见光分光光度计四、操作步骤（一）标准曲线的制作2、将试管摇匀，放置20分钟。
3、用分光光度计比色测定吸光值A595nm。
4、以A595nm为纵坐标，标准蛋白色质浓度为横坐标，绘制标准曲线。
（二）样品的测定1、取一支试管，加入未知浓度的蛋白质溶液0.2ml，蒸馏水0.8ml考马斯亮蓝试剂5ml.2、将试管摇匀，放置20分钟。
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生物化学实验报告——蛋白质浓度测定:考马斯亮蓝染色法
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蛋白质浓度测定——考马斯亮蓝染色法
（实验报告）
实验日期：2015年4月28日 实验温度：室温
实验地点：生物化学与遗传学实验室 指导老师：***
班级：2013级生物技术1班 姓名：** 学号：********
I. 实验目的
1.学习考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度的原理和方法；
2.熟悉蛋白质含量测定的影响因素。
II. 实验原理
考马斯亮蓝是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的，
这是一种迅速、可靠的通过染色法测定溶液中蛋白质浓度的
方法。
考马斯亮蓝G-250在酸性游离状态下呈棕红色，最大吸
收波长465nm，与蛋白质结合后变为蓝色，最大吸收波长
595nm，在一定的蛋白质浓度范围内吸光度与蛋白质含量成
正比。
蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合，反应2min即可到达
平衡，复合物在室温下1h内保持稳定。蛋白质—考马斯亮
蓝G-250复合物吸光系数，使得在测定蛋白质浓度时灵敏度
很高，可测微克级蛋白质含量。
III. 实验试剂与仪器
1.实验试剂
生物化学实验报告——蛋白质浓度测定:考马斯亮蓝染色法
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(1) 100μg/mL标准蛋白质溶液 5mg酪蛋白溶于50mL
的0.1mol/L氢氧化钠溶液 。
(2)考马斯亮蓝G-250试剂 50mg考马斯亮蓝G-250溶
于25mL的95%乙醇中，加85%的磷酸50mL，蒸馏水定容
至500mL。
(3)正常人血浆。
2.实验器材
可见分光光度计，100μL 微量移液器16支，5mL刻度
吸管8支，中试管。
IV. 实验操作步骤
1.绘制标准曲线 取中试管8支，按下表加入各种试剂
混匀，室温放置5min后即可比色。以“0”号管为空白，
记录于下表，绘制标准曲线。
标准曲线绘制数据表
0 1 2 3 4 5 样1 样2
标准蛋白μg数 0 20 40 60 80 100
mL 0 1 2 3 4 5 样品1 样品2
标准蛋白质溶液 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 - -
血浆 0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0.4 0.4
0.1mol/LNaOH - - - - - - 0.6 0.6
考马斯亮蓝试剂 各5.0
生物化学实验报告——蛋白质浓度测定:考马斯亮蓝染色法
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A595 0 0.517 0.805 0.941 1.157 1.192 1.465 1.440
2.样品测定 中试管2支分别加未知浓度蛋白质（或人
正常血浆）0.4mL，各加5.0mL考马斯亮蓝试剂摇匀，室温
放置5min，以“0”号管为空白比色，以所测A595于标准曲
线查蛋白质含量。
V. 实验结果分析
结果分析：实验未能达到预期的一条直线，原因可能为：
①血浆样本放置时间太久，蛋白质变性；②实验比色杯由于
使用后未及时擦洗，导致比色误差（原因小）；③人为操作
不当，导致误差。
VI. 注意事项
1. 考马斯亮蓝试剂加入后室温放置5～20min内比色，
布的超过1h；
2. 蛋白质-染料复合物少量附于比色杯，不影响测定，
生物化学实验报告——蛋白质浓度测定:考马斯亮蓝染色法
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可用乙醇洗净。