磷酸化蛋白的富集
基于纳米结构材料的磷酸化蛋白_多肽富集和分析_程功
第25卷第4期2013年4月化学进展PROGRESS IN CHEMISTRYVol．25No．4Apr．2013收稿：2012年10月，收修改稿：2012年11月*国家自然科学基金项目（No．20871083，21171161）资助＊＊Corresponding authore-mail ：zjl@ciac．jl．cn基于纳米结构材料的磷酸化蛋白/多肽富集和分析*程功1王志刚1刘彦琳1张吉林1＊＊孙德慧3倪嘉缵1，2（1．中国科学院长春应用化学研究所稀土资源利用国家重点实验室长春130022；2．深圳大学生命科学学院深圳518060；3．长春工程学院长春130012）摘要蛋白质磷酸化是最为广泛的翻译后修饰之一。
在生物体液或组织中，许多低丰度的磷酸化蛋白和磷酸化肽是具有高度临床灵敏性和特异性的生物标记物，这些生物分子对许多疾病的检测和病理的阐释可能提供重要的信息。
因为蛋白质磷酸化动态可逆且磷酸化蛋白丰度很低，所以很难直接从复杂的生物样品中直接检测到磷酸化蛋白和磷酸化肽。
纳米结构材料因其大比表面积、丰富的活性亲合位点和特殊结构，在磷酸化肽和磷酸化蛋白的分离和富集方面已经引起了特别的关注，并成为目前磷酸化蛋白质组学富集和鉴定方面的研究热点。
许多介孔、磁性、杂化或化学修饰的亲合材料被研发并用于磷酸化蛋白/多肽的富集与分离；此外，一些多功能纳米结构材料也被研发并用于蛋白质组学中磷酸化蛋白/多肽的快速高效的富集提纯。
在这篇综述中，我们专注于纳米结构材料在磷酸化蛋白/多肽富集和提纯方面的最新进展。
关键词纳米结构亲和材料磷酸化蛋白磷酸化肽生物分离富集中图分类号：O612.6；Q816；R914.3文献标识码：A文章编号：1005-281X （2013）04-0620-13Phosphoprotein /Phosphopeptide Enrichment and AnalysisBased on Nanostructured MaterialsCheng Gong 1Wang Zhigang 1Liu Yanlin 1Zhang Jilin 1＊＊Sun Dehui 3Ni Jiazuan 1，2（1．State Key Laboratory of Rare Earth Resource Utilization ，Changchun Institute of Applied Chemistry ，Chinese Academy of Sciences ，Changchun 130022，China ；2．College of Life Sciences ，Shenzhen University ，Shenzhen 518060，China ；3．Changchun Institute of Technology ，Changchun 130012，China ）AbstractProtein phosphorylation is one of the most ubiquitous post-translational modifications．Many low-abundance endogenous phosphoproteins and phosphopeptides in the body fluids or tissues are biomarkers with higher clinical sensitivity and specificity ，which could provide valuable information for the detection of many diseases and elucidation of pathology．It is still a great challenge to detect the phosphoproteins and phosphopeptides from complex biological samples directly due to reversibility of protein phosphorylation and the extremely low concentrations of phosphoproteins．Nanostructured materials have attracted particular attentions in enrichment ，separation ，and purification of phosphoproteins /phosphopeptides due to their larger surface area ，numerous affinity sites and unique structures．The research subject has become one of research hotspots in phosphoproteomics presently．Various multifunctional nanostructured materials such as core-shell particles with mesoporous affinity shell and magnetic core ，hybrids of multiple components and composite affinity materials have been synthesized for selective enrichment and fast purification of phosphoproteins /phosphopeptides．In this review ，we are focusing on第4期程功等基于纳米结构材料的磷酸化蛋白/多肽富集和分析·621·recent advancements of nanostructured materials for phosphoprotein/phosphopeptide enrichment and purification prior to MS analysis．Definition，structure characteristic，unique physicochemical properties and potential in bio-separation of the nanostructured materials are first introduced．Subsequently，the related research background on phosphoproteomic studies in proteomics using mass spectrometric strategies in combination with phosphospecific enrichment techniques is briefly presented．After that，two types of affinity enrichment mechanisms to phosphoproteins/phosphopeptides are compactly discussed．Next，mesoporous，hybrid，and composite nanostructured materials for enrichment of phosphoproteins/phosphopeptides as well as application of multifunctional nanostructured materials in phosphoproteomics are summarized in detail．Finally，some unsolved problems and a brief perspective and outlook on phosphopeptide enrichment are proposed．Key words nanostructure；affinity materials；phosphoproteins；phosphopeptides；bioseparation；enrichmentContents1Introduction2Protein phosphorylation and enrichment detection of phosphoproteins/phosphopeptides2.1Protein phosphorylation2.2Enrichment detection of phosphoproteins/phosphopeptides3Mechanism of affinity enrichment of phosphoproteins/phosphopeptides4Mesoporous nanostructured materials for enrichment of phosphoproteins/phosphopeptides4.1Mesoporous SiO2nanostructured materials with immobilized affinity material4.2Mesoporous nanostructured materials doped withaffinity material4.3Mesoporous metal oxide nanostructured materials 5Composite nanostructured materials for enrichment of phosphoproteins/phosphopeptides5.1Magnetic core-shell nanostructured materials5.2Mesoporous magnetic nanostructured materials 5.3Hybrid composite nanostructured materials6Application of multifunctional nanostructured materials in phosphoproteomics6.1Multifunctional nanostructured materials for fastproteolysis and phosphopeptide enrichment6.2Multifunctional nanostructured materials forenrichment and identification of phosphopeptides 6.3Multifunctional nanostructured materials forenrichment of various biomolecules6.4Nanostructured materials modified target plate foron-plate enrichment and analysis ofphosphopeptides 7Conclusions and outlook1引言纳米结构材料一般认为是由纳米尺度的物质单元所构筑的纳米结构体系。
磷酸化蛋白质组学常用分析和定量方法
蛋白质的磷酸化修饰是生物体内重要的共价修饰方式之一。
蛋白质的磷酸化和去磷酸化这一可逆过程几乎调节着包括细胞的增殖、发育、分化、信号转导、细胞凋亡、神经活动、肌肉收缩及肿瘤发生等过程在内的所有生命活动。
目前已知有许多人类疾病是由于某些异常的磷酸化修饰所引起，而有些磷酸化修饰却是某种疾病所导致的后果。
在哺乳动物细胞生命周期中，大约有1/3的蛋白质发生过磷酸化修饰；在脊椎动物基因组中，有5%的基因编码的蛋白质是参与磷酸化和去磷酸化过程的蛋白激酶和磷酸（酯）酶。
磷酸化修饰本身所具有的简单、灵活、可逆的特性以及磷酸基团的供体ATP的易得性，使得磷酸化修饰被真核细胞所选择接受而成为一种最普遍的调控手段。
鉴于磷酸化修饰在生命活动中所具有的重要意义，探索磷酸化修饰过程的奥秘及其对细胞功能的影响已成为众多生物化学家及蛋白组学家所关心的内容。
用蛋白质组学的理念和分析方法研究蛋白质磷酸化修饰，可以从整体上观察细胞或组织中磷酸化修饰的状态及其变化，这对以某一种或几种激酶及其产物为研究对象的经典分析方法是一个重要的补充，同时提供了一个全新的研究视角，并由此派生出磷酸化蛋白质组学（phosphoproteomics）这一新概念。
在蛋白质组学水平进行磷酸化蛋白质的分析定量研究已引起人们广泛关注，各种技术也相应地发展起来.1.1 免疫亲和色谱富集磷酸化蛋白质最简单的方法就是用识别磷酸化氨基酸残基的特异抗体进行免疫共沉淀，从复杂混合物中免疫沉淀出目标蛋白质。
目前，仅有酪氨酸磷酸化蛋白质的单克隆抗体可以用来进行有效的免疫共沉淀。
这是因为该抗体具有较强的亲和力和特异性，可以有效地免疫沉淀酪氨酸磷酸化的蛋白质。
Imam-Sghiouar等人从B-淋巴细胞中通过免疫沉淀获得酪氨酸磷酸化的蛋白质，然后再用二维电泳分离技术并结合质谱分析方法，鉴定出多个与斯科特综合症相关的酪氨酸磷酸化的蛋白质。
由于抗磷酸化丝氨酸和苏氨酸抗体的抗原决定簇较小，所以令抗原抗体的结合位点存在空间障碍，特异性较差。
磷酸化定量蛋白质组学
百泰派克生物科技
磷酸化定量蛋白质组学
质谱可以用于磷酸化蛋白质组的定性，也可以用于磷酸化蛋白质组的定量研究。
百泰派克生物科技提供基于质谱的磷酸化定量蛋白组学研究服务。
磷酸化定量蛋白质组学
磷酸化定量蛋白质组学指在组学水平上对磷酸化蛋白质进行定量分析。
磷酸化蛋白质是由蛋白激酶将ATP或GTP分子上的磷酸基团转移到底物蛋白特定的氨基酸侧链上形成的。
蛋白质磷酸化是一种可逆的蛋白质翻译后修饰。
在哺乳动物的细胞生命周期中，至少有三分之一的蛋白质发生磷酸化修饰。
磷酸化修饰参与许多信号转导途径和细胞代谢过程，且许多已知的疾病也与蛋白质的异常磷酸化有关。
因此，对磷酸化蛋白质组进行定量研究，寻找差异表达的磷酸化蛋白质，有助于发现疾病的生物标志物和寻找新的具有治疗潜力的药物靶标。
磷酸化定量蛋白质组学。
蛋白质组磷酸化定量分析方法
由于磷酸化蛋白质在生物样本中含量低、动态范围广，利用定量蛋白组学分析手段对磷酸化蛋白质样品进行定量分析前，需要先对磷酸化蛋白质进行富集从而提高其丰度。
常用的磷酸化蛋白质/肽段的富集方法包括免疫亲和色谱、金属亲和色谱（IMAC）以及TiO2色谱。
在质谱定量磷酸蛋白组学分析中，除了多一步富集步骤之外，其他步骤与一般定量蛋白质组学的步骤类似。
磷酸化蛋白质组研究中的富集策略
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ｅ ｐ ｎ ｅ ｏ ｈ ｓ ｈ ｐ ｐ ｉ ｉ ｌ．Ｔ ｔ ｄ ｃ ｒｅ ｔ ａ ａｌ ｅ ｆ ｒ ｔ ｅ ｒ ｈ ｎ ｔａｅ ｉ ｓ ｎ ｌ ｄ ｎ ｓｎ ｉ ｄ ｒ ｓ ｏ ｓ ｆ ｐ ｏ ｐ ｏ ｅ ｔ ｅ ｓｇ ａ ｓ ｈ ｅ ｍｅ ｏ ｓ ｕ ｒ ｎ ｌ ｖ ｉ ｌ ｏ ｅ ｎ ｃ ｍｅ ｔ ｓｒ ｔｇｅ ，ｉ ｃ ｕ ｉｇ ｕ ｉ ｇ ａ ｔ ｏ — ｄ ｎ ｈ ｙ ｂ ａ ｈ ｉ ｎ ｂ ｉｓ ｉ ｅ ， ｍｍｏ ｉ ｚ ｄ ｍｅａ ｆｉ ｉ ｈ ｍａｏ ｒ ｐ ｙ ａ ｄ ｍｅ ａ ｘ ｄ ／ ｙ ｒ ｘ ｄ ｆｉｉ ｈ ｍａｏ ｒ ｐ ｙ ｗｅ ｅ ｕ ｂｌ ｅ ｔ ｌ ａ ｎ ｔ ｃ ｒ ｉ ｙ ｏ ｔｇ ａ ｈ ｎ ｔｌ ｏ ｉ ｅ ｈ ｄ ｉ ｅ ａ ｎ ｔ ｃ ｒ ｏ ｙ ｏ ｔｇ ａ ｈ ｒ ｓ ｍｍａ ｚ ｄ ｉ ｈ ｓ ｉ ｒ ｅ ｎ ｔｉ
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(完整word版)生物质谱分析蛋白质磷酸化位点
磷酸化蛋白的高效富集在线酶解与快速鉴定项目申请人：袁敏婷黄懿指导教师：杨芃原摘要：蛋白质的可逆磷酸化具有重要的生物学意义，对蛋白质磷酸化位点进行分析有助于阐明蛋白质磷酸化的机制与功能。
生物质谱是目前进行蛋白质磷酸化分析最有力的方法之一，但由于蛋白质磷酸化的丰度低以及磷酸化的肽段离子化效率低，在质谱分析前，依然需要结合富集或分离的步骤。
本作品旨在利用四氧化三铁磁性纳米材料对磷酸化肽或蛋白快速高效的特异性吸附，结合在线酶解技术的快速，高序列覆盖度特性构建一个快速，高效鉴定分析磷酸化蛋白的新技术。
关键词：蛋白质磷酸化；Fe3O4磁性材料富集；在线酶解1.引言蛋白质的翻译后修饰（PTMs）是目前蛋白质组研究中的一个重要课题。
蛋白质磷酸化是最普遍、最重要的一种蛋白翻译后修饰方式，它几乎调节着生命活动的整个过程，包括细胞的增殖、发育和分化，神经活动，肌肉收缩，新陈代谢，肿瘤发生等。
了解蛋白质磷酸化对功能的影响可深入理解生命系统如何在分子水平进行调控。
据统计，在哺乳动物中大约有三分之一的蛋白质被认为是磷酸化修饰的，而脊椎动物基因组中有5%的基因编码蛋白激酶或磷酸酯酶。
对众多生物化学功能起开/关调控作用，是一种普遍的调控机制。
蛋白质的可逆磷酸化使得蛋白质组学研究更为复杂。
真核生物细胞蛋白质中主要的磷酸化氨基酸为丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸，其比例大概为1800∶200∶1。
大多数磷酸化蛋白质都有多个磷酸化位点，并且其磷酸化位点是可变的。
因此,一种蛋白可能有多种磷酸化形式。
对单一蛋白质进行研究的传统方法远不能满足分析这一层面上蛋白质的多样性和复杂性的需要，用蛋白质组技术和生物信息学高通量地研究翻译后蛋白质的修饰已成为必然趋势。
虽然对磷酸化蛋白质组学分析已有很大进步，但依然存在多个难点亟待解决包括磷酸化蛋白和肽段的富集，可逆性磷酸化位点的鉴定以及磷酸化位点的定量等。
在过去几十年中已有多种分离和鉴定蛋白质磷酸化的技术发展起来，包括放射性同位素标记、免疫沉淀反应、化学修饰、固定金属离子亲合色谱法等，而生物质谱技术已经成为磷酸化蛋白鉴定的主要工具，串联质谱更是可以高通量，快速的给出详细的磷酸化位点。
磷酸化组学分析技术
百泰派克生物科技磷酸化组学分析技术磷酸化蛋白质组（Phosphoproteome）就是蛋白质组中全部的磷酸化蛋白质，而磷酸化蛋白质组学（Phosphoproteomics）就是针对磷酸化蛋白质的全面分析，包括对磷酸化的定性、定位和定量。
磷酸化蛋白质组学分析技术主要与质谱技术相结合进行分析，分析流程包括样品中提取蛋并酶解成肽段，之后利用固定金属离子亲和色谱法（IMAC）、二氧化钛亲和色谱法（TiO2）等方法富集磷酸化肽段，最后联合质谱检测技术进行分析。
常用的质谱定量磷酸化蛋白质组学分析技术主要包括TMT（Tandem Mass Tag），LFQ（Label Free Quantitation）和DIA（Data Independent Acquisition）技术。
TMT定量：TMT是添加同位素标记的一种定量技术，TMT除了可以应用在全蛋白质组的鉴定以外，也可以用于磷酸化蛋白质组学分析。
目前经过后期改进，TMT技术最多能同时对16个样品进行标记分析，消除多批次标记不平行问题，进一步减少定量数据丢失，准确性高。
LFQ非标记定量：LFQ磷酸化蛋白质组学，其利用基于质谱的非标记定量技术研究磷酸化蛋白质组，可实现磷酸化蛋白质组的定性和定量鉴定。
LFQ和TMT标记定量相比，非标记定量操作简单，样品损失小，单次实验可定量到的蛋白数目更多。
但由于非标记定量依据一级谱图的峰强度或者峰面积，所以数据质量是关键，严重依赖于质谱仪的稳定性。
DIA：DIA数据非依赖采集模式，是一种质谱分析中使用的数据采集模式，由于DIA 数据采集窗口更宽，谱图更为复杂，想要在混合的谱图中正确定位磷酸化位点并且正确处理磷酸肽位置异构体，对谱图处理能力需要达到更高的要求。
百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Q ExactiveHF质谱平台，Orbitrap Fusion质谱平台，Orbitrap Fusion Lumos质谱平台结合Nano-LC，推出磷酸化定量蛋白组分析服务技术包裹。
磷酸化肽段富集方法
磷酸化肽段富集方法
磷酸化是一种重要的蛋白质修饰方式，在细胞信号传导、基因转录调控、细胞凋亡等生物学过程中都发挥着重要作用。
因此，研究磷酸化蛋白质及其在生物学过程中的功能十分重要。
磷酸化肽段富集方法是一种常用的技术，可以使得磷酸化肽段的比例提高，从而更方便地进行质谱分析和生物学功能研究。
磷酸化肽段富集方法的原理是基于亲和吸附，将磷酸化肽段与非磷酸化肽段进行分离。
常见的富集方法包括IMAC（金属离子亲和层析）、TiO2（钛离子亲和层析）、MOAC（磷酸酯酶结合富集）等。
其中，IMAC是最常用的富集方法之一，它利用金属离子与磷酸基团之间的亲和力使得磷酸化肽段与非磷酸化肽段分离。
TiO2富集方法则利用钛离子与磷酸基团之间的亲和力分离磷酸化肽段。
MOAC则利用磷酸酯酶结合具有磷酸化基团的肽段，从而分离磷酸化肽段。
磷酸化肽段富集方法可以用于分离磷酸化肽段，并用质谱等方法鉴定磷酸化位点，进而深入探究磷酸化修饰在生物学过程中的作用机制，为研究磷酸化蛋白质及其生物学功能提供了有力的工具。
- 1 -。
磷酸化蛋白表达
磷酸化蛋白表达
磷酸化蛋白是指蛋白质上发生磷酸化修饰的蛋白质分子。
磷酸化是一种生物化学过程，通过这个过程，磷酸基团被添加到蛋白质上，从而改变其结构和功能。
磷酸化可以调节蛋白质的结构、功能和相互作用，进而影响细胞的生理和病理过程。
磷酸化蛋白在细胞信号传导、细胞增殖、细胞凋亡等过程中起着重要的调控作用。
磷酸化蛋白表达谱分析是通过高通量技术来分析细胞中磷酸化蛋白的表达水平和位置。
常用的方法包括质谱分析、免疫沉淀、蛋白芯片等。
质谱分析可以鉴定和定量磷酸化蛋白，免疫沉淀可以富集磷酸化蛋白，蛋白芯片则可以快速筛选和分析磷酸化蛋白。
例如，cAMP反应元件结合蛋白（CREB）作为核转录因子家族中的一员，在神经系统应激性损伤（如缺氧、紫外线、高渗透压等）中，活化（磷酸化）的CREB可直接或间接激活相关基因的转录，进而表达某些蛋白分子（如c-Fos、Jun-B、bcl-2等）和某些神经营养因子（如神经生长因子和脑源性
神经营养因子等）。
这些基因产物调节着神经元在应激性损伤后再生、存活及修复等，从而为神经元提供保护作用。
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TiO2法磷酸化富集
试验：pH值对TiO2富集磷酸化蛋白的影响
共5个样品，各400ug蛋白（酶解之前），每个样品用1mg TiO2，共用5mg。
流程：
1.TiO2 Beads 活化
①向10mg TiO2 Beads中加入1000 ul Elute buffer 2，震荡20min，8200×g，2min，离心，弃上清；
②更换wash buffer 1 1000ul，第一遍摇晃两次，弃上清；第二遍，震荡20min，弃上清；
③更换Loading buffer 1000ul，2遍震荡30min，最后TiO2 Beads保存在Loading buffer中。
2.酶解后的肽段溶液中加入TFA酸化，使TFA终浓度为0.1%—0.5%，离心浓缩抽干，之后重新用Loading buffer溶解（体积控制在400ul左右）。
3.每400ug蛋白用1mg TiO2 Beads 富集，将1mg TiO2 加入到一个样品中，室温旋转30min，转速1100转/分。
4.将孵育好的肽段溶液加入脱盐柱中，8200×g，2min，收集为Flow Through。
5.再向脱盐柱中加入200ul wash buffer 1，8200×g，2min，，重复3次，收集600ul。
6.再向脱盐柱中加入200ul wash buffer 2，8200×g，2min，，重复3次，收集600ul。
4、5、6合并到一起，为Flow Through。
7.再向脱盐柱中加入200ul Elute buffer 1，8200×g，2min，，重复2次，收集400ul，为elute1；再加入200ul Elute buffer 2，8200×g，2min，收集200ul，为elute 2；合并elute 1和elute 2，总共600ul磷酸化多肽。
8.离心浓缩干，复溶于0.1% FA中，上样。
试剂准备：
Loading buffer：35%乙醇酸溶液/65%ACN/2%TFA
—3.5mL饱和谷氨酸溶液/乙醇酸
—6.5mL ACN
—0.2mL TFA
wash buffer 1：65% ACN/0.5% TFA
wash buffer 2: 65% ACN/0.5% TFA
Elute buffer 1：300mM氨水/50% ACN
—H2O 19.1mL
—ACN 20mL
—浓氨水（25%）0.9mL
Elute buffer 2：500mM氨水/60% ACN
—H2O 14.4mL
—ACN 24mL
—浓氨水（25%） 1.6mL。