CC-基因表达检测的相关实验技术和蛋白印迹技术实验报告
蛋白定量的实验报告
蛋白定量的实验报告本实验旨在利用免疫印迹（Western blot）技术进行蛋白定量，了解不同浓度蛋白样品的定量方法及其应用，为今后实验设计提供参考。
实验原理：免疫印迹是一种常用的蛋白分析技术，通过在蛋白印迹膜上利用特异性抗体与目标蛋白相互作用，从而检测和定量目标蛋白的存在量。
免疫印迹技术的基本步骤包括：电泳分离蛋白样品、将蛋白转移至膜上、与抗体结合、信号发光和检测。
实验步骤：1. 准备蛋白样品：将待测蛋白样品依次制备成不同浓度的标准品，分别为25 μg/mL、50 μg/mL、75 μg/mL和100 μg/mL。
2. SDS-PAGE电泳：将不同浓度的蛋白样品加入蛋白电泳缓冲液，按照分子量大小进行电泳分离。
3. 蛋白转移：将电泳分离后的蛋白转移到聚丙烯酰胺膜上，可以使用湿式转印法或半湿式转印法。
4. 阻断与孵育：用5%非脂乳糖或3%牛血清蛋白阻断膜上的非特异性结合位点，防止非特异性结合。
5. 一抗孵育：将目标蛋白的一抗加入阻断液中，孵育膜，使抗体与目标蛋白特异性结合。
6. 二抗孵育：将与目标蛋白一抗结合的二抗加入孵育液中，孵育膜，二抗一般会携带荧光物质或酶标记，在可见光或紫外线下观察或进一步检测。
7. 发光与显影：通过添加发光底物或显色剂，观察蛋白在膜上的相对强度并进行定量分析。
结果与讨论：在本次实验中，我们成功制备了不同浓度的标准品，并进行了免疫印迹实验，通过观察膜上的发光信号强度来定量目标蛋白的含量。
从实验结果中我们可以看出，随着标准品蛋白浓度的增加，免疫印迹膜上的发光信号强度也呈现出增加的趋势。
这是因为在免疫印迹技术中，标准品的蛋白浓度与免疫印迹膜上的发光信号强度成正相关关系。
因此，通过在实验中测量标准品的发光信号强度，可以根据标准曲线来计算待测样品中目标蛋白的含量。
需要注意的是，在进行免疫印迹实验时，关键的环节是选择合适的抗体。
抗体的特异性与亲和力会直接影响免疫印迹结果的准确性。
因此，在实验设计中，需要充分考虑抗体的选择，并进行合适的预实验来验证抗体的特异性和性能。
基因表达的定量检测分析报告
Taqman Probe
Molecular Beacon
背景荧光更低
反应优化
反应液组成、体积
50ul绝对不必要 20ul应用广，但成本高 推荐10ul，但需要优化
引物与引物、引物与探针浓度配比
4×4组合，50nm,300nm,600nm,900nm 探针50nm, 100nm, 250nm
Realtime PCR
• 实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，由于该技术不仅实现了 PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比 ，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、 自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。
• 实时荧光定量PCR原理
几个常用名词概念
1. Ct 值的定义
C代表Cycle，t代表threshold（阈值，临界值），Ct值的含义是： 每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数。
2. 荧光域值（threshold）的设定
PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的 缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold = 10 ′ 光扩增曲线可以分成三个阶段： 荧光背景信号阶段, 荧光信号指数扩增阶段和平台期。
在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，我们 无法判断产物量的变化。
而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加。 PCR 的终产物量与 起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的 PCR 产物量不能计算出 起始 DNA 拷贝数。
qPCR一般使用二步PCR扩增，在退火-延伸整 合步骤结束时进行信号检测。
蛋白质免疫印迹实验
蛋白质免疫印迹实验（Western Blot）蛋白质免疫印迹（Western Blot）实验原理蛋白质免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的一种蛋白质检测方法。
对已知的表达蛋白，可以用相应的抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可以融合部分的已知片段进行检测，如HA-tag，Flag-tag，c-myc-tag等。
Western Blot采用的是聚丙烯酰胺（PAGE）凝胶电泳，被检测的是蛋白质，其中检测探针是相应的抗体，显色是使用的标记后的二抗。
经过PAGE凝胶分离的蛋白质样品，转移到固相载体上，如醋酸纤维素膜，固相载体以非共价键的形式吸附蛋白质。
然后以固相载体上的蛋白质作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，然后再与标记后的二抗起反应，经过底物显色以检测目的蛋白。
蛋白质免疫印迹（Western Blot）原理蛋白免疫印迹法主要分为三个阶段进行第一阶段是SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)在这个阶段，经过变性处理的蛋白质样品经SDS处理后会带上阴性电荷,在聚丙烯酰胺凝胶中在电场的作用下从阴极向阳极泳动,且分子量越小,泳动速度就越快。
所以在此阶段，根据蛋白的泳动速度可以将样品中的蛋白质根据其分子量的大小进行分离，此阶段分离效果肉眼不可见。
如果想观察蛋白的电泳情况，可以在电泳完成后进行考马斯亮蓝染色进行观察；第二阶段为电转移，又称为转膜。
即将在凝胶中已经分离的蛋白质条带通过电场的作用转移至硝酸纤维素膜上, 一般选用恒流300 mA，通电90 min即可将凝胶中的蛋白条带转移到醋酸纤维素膜载体上。
转移到载体上的蛋白条带也是肉眼不可见的，如果想观察转移的效果，可以在转移后对载体进行丽春红染液染色。
第三阶段为酶联免疫显色检测将印有蛋白质条带的硝酸纤维素膜(相当于包被了抗原的固相载体)依次与特异性抗体和酶标第二抗体作用后,加入能形成不溶性显色物的酶反应底物,使目的条带蛋白显色。
蛋白印迹实验报告
蛋白印迹实验报告篇一：实验十二Western印迹鉴定目标蛋白实验十二Western印迹鉴定目标蛋白实验目的1.了解Western blot的原理及其意义，掌握Western blot的操作方法；2.应用Western blot 技术分析鉴定经SDS-PAGE分离后转移到尼龙膜上的重组蛋白。
实验原理Western印迹法简称蛋白质印迹法。
蛋白质样品经SDS-PAGE电泳后，凝胶所含的样品蛋白质区带通过电泳方法转移、固定到载体（如尼龙膜、硝酸纤维素膜）上，固相载体以非共价键的形式与蛋白质结合，从而固定住蛋白质；以膜上的蛋白或多肽为抗原，与相应的第一抗体起免疫反应，再和酶标记或同位素标记的第二抗体反应，用适当的溶液漂洗去未结合抗体后，置含底物的溶液中温育，或通过放射自显影显出谱带，即可检测出样品中的特异蛋白组分。
试剂与器材试剂1.转移缓冲液：甘氨酸（39 mmol/L），Tris 碱（48mmol/L），SDS （%），200ml 甲醇（20%），定容至1,000mL；2.封闭液：5% 脱脂奶粉，% 叠氮钠，溶于PBST溶液中；3.丽春红S（Ponceaus）染液：丽春红S溶于1mL 冰乙酸中，加水至100mL；洗膜液：PBS 缓冲液含% Tween 20；5．DAB浓缩显色液（50X）：DAB （二氨基联苯胺）是根过氧化物酶的底物之一，临用前稀释。
6．5 x PBS：在1600mL蒸馏水中溶解Na 2HPO4 , Na H2PO4, 40g Na Cl,用/L NaOH调pH至，加水定容至2升。
高压灭菌20 分钟，室温保存。
用前稀释至1x 。
7．SDS-PAGE电泳用溶液和试剂。
器材电泳装置一套;2.电转移膜装置3.抗体-酶反应摇床操作方法〈一〉电转移1．将蛋白质样品进行SDS-PAGE，待溴酚蓝跑出胶后停止电泳（1）。
2．载手套切6-8张定性滤纸和一张尼龙膜，它们的大小应与凝胶的大小相同。
在尼龙膜的一（左）角作一记号（或剪角），与滤纸和海棉（纤维）垫浸泡于转移缓冲液中。
蛋白印迹实验报告
蛋白印迹实验报告篇一：实验十二Western印迹鉴定目标蛋白实验十二Western印迹鉴定目标蛋白实验目的1.了解Western blot的原理及其意义，掌握Western blot的操作方法；2.应用Western blot 技术分析鉴定经SDS-PAGE分离后转移到尼龙膜上的重组蛋白。
实验原理Western印迹法简称蛋白质印迹法。
蛋白质样品经SDS-PAGE电泳后，凝胶所含的样品蛋白质区带通过电泳方法转移、固定到载体（如尼龙膜、硝酸纤维素膜）上，固相载体以非共价键的形式与蛋白质结合，从而固定住蛋白质；以膜上的蛋白或多肽为抗原，与相应的第一抗体起免疫反应，再和酶标记或同位素标记的第二抗体反应，用适当的溶液漂洗去未结合抗体后，置含底物的溶液中温育，或通过放射自显影显出谱带，即可检测出样品中的特异蛋白组分。
试剂与器材试剂1.转移缓冲液：甘氨酸（39 mmol/L），Tris 碱（48mmol/L），SDS （%），200ml 甲醇（20%），定容至1,000mL；2.封闭液：5% 脱脂奶粉，% 叠氮钠，溶于PBST溶液中；3.丽春红S（Ponceaus）染液：丽春红S溶于1mL 冰乙酸中，加水至100mL；洗膜液：PBS 缓冲液含% Tween 20；5．DAB浓缩显色液（50X）：DAB （二氨基联苯胺）是根过氧化物酶的底物之一，临用前稀释。
6．5 x PBS：在1600mL蒸馏水中溶解Na 2HPO4 , Na H2PO4, 40g Na Cl,用/L NaOH调pH至，加水定容至2升。
高压灭菌20 分钟，室温保存。
用前稀释至1x 。
7．SDS-PAGE电泳用溶液和试剂。
器材电泳装置一套;2.电转移膜装置3.抗体-酶反应摇床操作方法〈一〉电转移1．将蛋白质样品进行SDS-PAGE，待溴酚蓝跑出胶后停止电泳（1）。
2．载手套切6-8张定性滤纸和一张尼龙膜，它们的大小应与凝胶的大小相同。
在尼龙膜的一（左）角作一记号（或剪角），与滤纸和海棉（纤维）垫浸泡于转移缓冲液中。
基因表达的定量检测分析报告
荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧 光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般我们将荧光域值的缺省设置是 3-15 个循环的荧光信号的标准偏差的 10 倍。每个反应管内的荧光信号 到达设定的域值时所经历的循环数被称为 CT 值（ threshold value ）
几个常用名词概念
1. Ct 值的定义
C代表Cycle，t代表threshold（阈值，临界值），Ct值的含义是： 每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数。
2. 荧光域值（threshold）的设定
PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的 缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold = 10 ′ SDcycle 3-15
3. Ct值与起始模板的关系
研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性 关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出 标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值。因此， 只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline） 荧光阈值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍 手动设置：大于荧光背景和阴性对照的荧光最高值；进入指数期的
•
所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系
中加入荧光基团，利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增
免疫印迹技术实验报告
免疫印迹技术实验报告一、引言免疫印迹技术（Western Blotting）是一种用于检测特定蛋白质的定性和定量分析方法。
它基于免疫学原理，通过将待测蛋白质进行电泳分离，并利用抗体与目标蛋白质特异性结合的原理，最终实现对目标蛋白质的检测和定量分析。
本实验旨在通过免疫印迹技术检测目标蛋白质在不同样本中的表达水平，并观察其变化情况，以深入了解该蛋白质的功能和作用机制。
二、实验步骤1. 样本制备首先，我们需要准备样本。
样本可以是细胞或组织。
在实验中，我们选择了A 细胞和B细胞作为样本，分别进行后续实验。
2. 蛋白质提取将A细胞和B细胞分别加入适量的细胞裂解缓冲液，通过离心等操作将细胞裂解并获取蛋白质提取物。
3. SDS-PAGE电泳分离将蛋白质提取物加入SDS-PAGE凝胶中，进行电泳分离。
电泳时间和电压根据实验需要来确定。
4. 转膜将电泳分离后的蛋白质从凝胶中转移到聚丙烯酰胺膜上。
转膜可以通过湿法或半湿法等方法实现。
5. 阻断将转膜后的聚丙烯酰胺膜放入阻断液中，在室温下进行阻断。
阻断的目的是防止非特异性结合。
6. 一抗处理将目标蛋白质的一抗加入到含有阻断液的培养皿中，将转膜的聚丙烯酰胺膜放置在一抗液中，进行一抗处理。
一抗的选择根据目标蛋白质的特异性来确定。
7. 洗涤将转膜的聚丙烯酰胺膜从一抗液中取出，进行洗涤。
洗涤的目的是去除非特异性结合的抗体。
8. 二抗处理将与目标蛋白质一抗结合的二抗加入到含有阻断液的培养皿中，将转膜的聚丙烯酰胺膜放置在二抗液中，进行二抗处理。
9. 洗涤将转膜的聚丙烯酰胺膜从二抗液中取出，再次进行洗涤，确保清洗干净。
10. 显色将合适的显色剂加入到含有阻断液的培养皿中，将转膜的聚丙烯酰胺膜放置在显色剂中，进行显色反应。
显色剂的选择根据实验需要和目标蛋白质的特性来确定。
11. 照相观察显色结果，并使用相机拍摄转膜的聚丙烯酰胺膜，记录实验结果。
三、结果与讨论根据实验步骤，我们成功地使用免疫印迹技术检测了A细胞和B细胞中目标蛋白质的表达情况。
蛋白质印迹法实验报告
一、实验目的1. 掌握蛋白质印迹法的基本原理和操作步骤。
2. 学习如何利用蛋白质印迹法检测目标蛋白的表达水平。
3. 掌握蛋白质印迹法的实验操作技巧，为后续相关实验奠定基础。
二、实验原理蛋白质印迹法（Western Blot）是一种常用的蛋白质检测技术，通过特异性抗体与待测蛋白结合，实现对目标蛋白的高灵敏度和高特异性检测。
实验原理如下：1. 蛋白质提取：从组织、细胞或体液中提取总蛋白质，避免蛋白质的降解和失活。
2. 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）：将提取的蛋白质进行SDS-PAGE，根据蛋白质分子量大小进行分离。
3. 蛋白质转移：将分离后的蛋白质从凝胶转移到固相载体（如硝酸纤维素膜或PVDF膜）上。
4. 免疫反应：用特异性抗体与转移至固相载体上的目标蛋白结合，然后与酶或同位素标记的第二抗体发生反应。
5. 显色或放射自显影：通过底物显色或放射自显影等手段，实现对目标蛋白的检测和定量。
三、实验材料1. 细胞株：大鼠原代脊髓星形胶质细胞2. 主要试剂：DMEM/F12培养基、胎牛血清、裂解液、PBS、NaCl、SDS、聚丙烯酰胺凝胶、硝酸纤维素膜、PVDF膜、特异性抗体、酶联第二抗体、底物、显影液等。
3. 仪器：玻璃匀浆器、高速离心机、分光光度仪、-20低温冰箱、垂直板电泳转移装置、恒温水浴摇床、多用脱色摇床等。
四、实验步骤1. 细胞培养：将大鼠原代脊髓星形胶质细胞在DMEM/F12培养基和胎牛血清的条件下培养，直至达到实验所需状态。
2. 蛋白质提取：用裂解液提取细胞总蛋白质，并进行蛋白质浓度测定。
3. SDS-PAGE：将提取的蛋白质进行SDS-PAGE，根据蛋白质分子量大小进行分离。
4. 蛋白质转移：将分离后的蛋白质从凝胶转移到硝酸纤维素膜或PVDF膜上。
5. 免疫反应：将转膜后的膜与特异性抗体进行孵育，然后用酶联第二抗体进行孵育。
6. 显色：加入底物，观察目标蛋白条带的出现，并通过扫描成像系统进行定量分析。
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课程名称：生物医学实验同组学生姓名：指导老师：应李强成绩：
实验名称：基因表达检测的相关实验技术和蛋白印迹技术实验类型：生物化学
一、实验目的和要求（必填）二、实验内容和原理（必填）
三、主要仪器设备（必填）四、操作方法和实验步骤
五、实验数据记录和处理六、实验结果与分析（必填）
七、讨论、心得
一、实验原理
电泳是指带电颗粒在电场中的泳动。
许多重要的生物分子如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都含有可电离基团，在非等电点条件下带有电荷，在电场力的作用下，它们向着与其所带电荷相反的电极移动。
电泳技术就是利用样品中各种分子带电性质、分子大小、形状等的差异，在电场中的迁移速度不同，从而对样品进行分离、纯化和鉴定的一种综合技术。
可用于样品的制备、纯度鉴定、分子量测定等。
蛋白质印迹技术（western blotting）
又称免疫印迹技术和western印迹技术，是鉴别蛋白质的分子杂交技术
原理：将经过SDS-PAGE分离的蛋白质样品转移到固相载体上。
以固相载体上蛋白质或多肽作为抗原，与对应的未标记的一抗起免疫反应，再与酶或同位素标记的二抗反应。
经过底物显色、化学发光或放射自显影，检测特异基因表达的蛋白成分的存在和含量。
该技术广泛应用于检测蛋白水平的表达。
二抗标记物
常用的二抗标记物有辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（AP）等，辣根过氧化物酶最敏感的底物是3,3’-二氨基联苯胺，它在过氧化物酶所在部位被反应转变成棕色沉淀。
在钴或镍离子存在下进行反应可以加深沉淀的颜色并提高反应的灵敏度。
但是，使用辣根过氧化物酶不可能完全排除背景颜色，因此须十分小心地观察生色反应，一旦特异性染色蛋白带清晰可见，就应尽快终止生色反应。
碱性磷酸酶可催化底物5一溴-4-氯-3-引哚磷酸／氮蓝四唑(BCIP／NBT)在原位转变为深蓝色化合物。
这是利用二抗标记物进行的显色反应，是最早的Western Blotting检测方法，现在主要用于免疫组化，在显微镜下观察。
该方法的灵敏度相对较低，可以检测ng水平的目标蛋白。
Western blotting 蛋白显影方法
1．增强化学发光法(ECL)
ECL化学发光检测试剂是基于Luminol的新一代增强型化学发光底物试剂，它由辣根过氧化物酶（HRP）催化发生化学反应，发出荧光，结果可以通过X光片压片和其它显影技术展现，或使用Luminometer检测。
溶液A主要成分为Luminol及特制发光增强剂，溶液B主要成分为H2O2及特殊稳定剂。
发光液A和B在HRP的催化作用下Luminol与H2O2反应生成一种过氧化物，过氧化物不稳定随即分解，形成一种能发光的电子激发中间体，当后者由激发态返回至基态，就会产生荧光。
在激发过程中不需要消耗HRP，HRP只是起催化作用，所以只要HRP没有降解失活，是可以重复加发光液的。
ECL化学发光检测灵敏度较高，可以检测pg水平的目标蛋白。
Ecl 显色原理：氨基苯二酰肼类：主要是鲁米诺（luminol）及异鲁米诺衍生物，是最常用的一类化学发光剂。
在Ecl底物中，含有鲁米诺（溶液A）和H2O2 （溶液B），在HRP（辣根过氧化物酶）催化
剂的作用下，发出荧光来。
HRP不消耗。
注意：荧光在一段时间后会越来越弱。
2.DAB 显色
DAB （3,3二氨基联苯胺）和HRP 反应产生棕色的不溶终产物。
这种棕色沉淀不溶于酒精和其它有机溶剂，对于必需使用复染和免疫组化染色特别理想。
对于碱性磷酸酶（AP ）标记的二抗，则选用BCIP 和 NBT 显色，在AP 作用下反应可生成一种不溶性黑紫色沉淀的强信号。
二、实验步骤
①SDS-PAGE 电泳分离待检测蛋白质
安装垂直板型电泳装置→干净的小烧杯中按所列的试剂用量配制(所列试剂见表1)→ 注胶至红线下方，上用蒸馏水覆盖→在另一个干净的小烧杯中配置浓缩胶(配方见表2)→ 待胶凝固后电倒去水层，注入浓缩胶→凝固后将电极缓冲溶液倒入上、下贮槽中没过短玻璃片→ 在样品凹槽内按下列表格加样→插入电源开始电泳(开始时30V ，后为60V ，电泳2h)→
牛血清蛋白/10μL
样品2/15μL 样品1/15μL Maker/15μL
样品1/15μL
样品2/15μL
牛血清蛋白/10μL
表1 12％分离胶浓度10ml 体积配制量 表2 4.5％分离胶浓度5 ml 体积配制用量
30%凝胶贮液 4.0ml 分离胶缓冲液 1.25ml 10% SDS 0.1ml ddH2O 4.0ml 10%过硫酸胺 0.06ml 2%TEMED 0.6 ml
②转膜
凝胶片取出进行转膜→带上手套将凝胶片放在装有转膜夹的转膜缓冲液中→按照转膜夹黑色面（负极）－海绵垫－滤纸－胶－ 膜 －滤纸－海绵垫－红色面（正极）的顺序进行安放，PVDF 膜需要用甲醇激活（15S ），在此过程中要排气泡→用塑料夹夹紧后放入转移电泳装置，将电泳槽搁置冰上，90V 恒压1小时（转膜后的P V D F 膜晾干后在4℃冰箱中保存一周）→ ③封闭、抗体结合、显色
30%凝胶贮液 0.75ml 分离胶缓冲液 0.83ml 10% SDS 0.1ml ddH2O 3.0ml 10%过硫酸胺 0.03ml 2%TEMED
0.3 ml
剪膜（检测蛋白为甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH），大小约为36kDa，因此根据预染蛋白marker提示剪取36kDa上下共约3条预染蛋白大小宽度）甲醇激活，TBST漂洗→封闭（封闭液：5%脱脂牛奶，TBST ），室温，1小时（摇床上），TBST淋洗→一抗反应，室温孵育，1小时→洗涤：TBST，3次，每次10min→二抗反应，室温孵育，1小时→洗涤：TBST，3次，每次10min→ECL显色：A，B化学发光液各0.5ml混合，放入膜，反应2min后于化学发光检测仪上进行观察
三、实验数据
第二条是我们组的实验，从显色图中我们可以清晰的看出有四条带，分别是样品2、样品1、样品1、样品2，而且由于样品1的浓度大于样品2，因而样品1的亮度更亮些，完全与事实相符。
所以，总的说来，这次实验还是很成功的。
四、讨论
①注意事项
1.转膜时，PVDF膜特别注意的是需要100%甲醇预处理（不超过15秒）再用缓冲液平衡。
2.整个转膜过程中注意排尽气泡。
3.从转膜完毕起，以后所有的步骤均要注意膜的保湿，避免膜的干燥，否则极易产生较高的背景。
4.在摇床上培养时，注意船是否破裂，以致封闭液或者一抗、二抗未能没过膜，从而产生实验误
差或失败。
5.在用TBST淋洗时，注意一定要洗干净，从而保持良好的特异性。
②实验感悟
1.在整个实验过程中，由于是两组合作，而且实验较简单，导致，整个实验可能并不需要所有人
都动手操作。
2.整个实验简单，且在摇床上时间很长，而这一阶段的时间并没有很好地利用。
3.在膜的左上角剪一下，便于确定膜的正反面。
③思考题
1.三种固相载体膜的优缺点。
①硝酸纤维素（NC）膜：
优点：与蛋白质之间靠疏水作用结合，无需预先活化，对蛋白质的活性影响小；非特异性本底显色浅；价格低廉（三种膜中最便宜），使用方便。
灵敏度和分辨率教高，背景低。
缺点：结合在NC 上的小分子蛋白质在洗涤时易丢失；NC韧性较差，易损坏。
②聚偏二氟乙烯(PVDF)膜：
优点：灵敏度、分辨率和蛋白亲和力比常规的膜要高，非常适合于低分子量蛋白的检测。
机械强度高，背景低。
缺点：价格昂贵。
③尼龙膜：
优点：灵敏度、分辨率也叫高，软而结实，价格较便宜。
缺点：背景较高
2.用PVDF转膜时，为什么需要用甲醇激活？
活化膜上的正电基团，使其更容易与带负电荷蛋白结合。
3.高背景出现的原因有哪些，以及解决方法？
①抗体浓度太高，优化降低一抗、二抗的浓度。
②抗体孵育温度过高，采用4℃孵育。
③封闭不充分，延长封闭时间，更换合适的封闭剂。
④漂洗不完全，增加漂洗时间和缓冲液体积，或者漂洗液中加入浓度0.05%Tween20
4.信号弱或者无信号的原因?
转膜不完全, 蛋白质与膜结合不充分, 过度封闭, 膜没有完全均匀湿透甲醇浓度过高。