第十二章DNA RNA 蛋白质
生物化学重点_第十二章 RNA的生物合成
第十二章RNA的生物合成一、RNA转录合成的特点：在RNA聚合酶的催化下，以一段DNA链为模板合成RNA，从而将DNA所携带的遗传信息传递给RNA的过程称为转录。
经转录生成的RNA有多种，主要的是rRNA，tRNA，mRNA，snRNA和HnRNA。
1．转录的不对称性：指以双链DNA中的一条链作为模板进行转录，从而将遗传信息由DNA传递给RNA。
对于不同的基因来说，其转录信息可以存在于两条不同的DNA链上。
能够转录RNA的那条DNA链称为模板链，而与之互补的另一条DNA链称为编码链。
2．转录的连续性：RNA转录合成时，在RNA聚合酶的催化下，连续合成一段RNA链，各条RNA链之间无需再进行连接。
3．转录的单向性：RNA转录合成时，只能向一个方向进行聚合，RNA链的合成方向为5'→3'。
二、RNA转录合成的条件：1．底物：四种核糖核苷酸，即ATP，GTP，CTP，UTP。
2．模板：以一段单链DNA作为模板。
3．RNA聚合酶（DDRP）：RNA聚合酶在单链DNA模板以及四种核糖核苷酸存在的条件下，不需要引物，即可从5'→3'聚合RNA。
原核生物中的RNA聚合酶全酶由五个亚基构成，即α2ββ'σ。
σ亚基与转录起始点的识别有关，而在转录合成开始后被释放，余下的部分（α2ββ'）被称为核心酶，与RNA链的延长有关。
真核生物中的RNA聚合酶分为三种：RNA polⅠ合成rRNA前体；RNA polⅡ合成HnRNA/mRNA；RNA pol Ⅲ合成tRNA前体、snRNA及5S rRNA。
4．终止因子ρ蛋白：这是一种六聚体的蛋白质，能识别终止信号，并能与RNA 紧密结合，导致RNA的释放。
三、RNA转录合成的基本过程：1．识别：RNA聚合酶中的σ因子识别转录起始点，并促使核心酶结合形成全酶复合物。
位于基因上游，与RNA聚合酶识别、结合并起始转录有关的一些DNA序列称为启动子。
基础生物化学 第十二章(1-3节)-核酸的合成与分解
＋ H2 O
尿囊素
尿囊酸酶
＋ H2 O
尿囊酸 4NH3
2CO2
尿酶
＋2H2O
尿素
乙醛酸
二、嘧啶核苷酸的代谢1
1，尿嘧啶与胸腺嘧啶在哺乳动物体内分解时，先
还原成对应的二氢衍生物。
2，破开环状结构分别产生β-丙氨酸及β-氨基异
丁酸。
3，最后成为CO2和NH3
胞嘧啶具有氨基，所以要先在胞嘧啶脱氨酶的作
通过用同位素标记的化合物实验来 确定，即用标有同位素的各种营养物喂 鸽子，然后将其排出的尿酸进行分析。
（一）嘌呤环的元素来源2（图示）
天冬氨酸
N1
6C
CO2
甲酰FH4
C2
5C
N7
甘氨酸
C8 甲酰FH4 N3
谷氨酰胺
4C
N9
谷氨酰胺
（二）合成过程（总）
从头合成嘌呤的途径已于50年代被
Greenberg等基本搞清,此途径是在核糖－ 5－磷酸的第一碳原子上逐步增加原子生 成次黄苷酸（肌苷酸） ，然后再由次黄 苷酸转变为腺苷酸和鸟苷酸。 反应分为两个阶段： 1，次黄苷酸的合成（11步反应） 2，腺苷、鸟苷的生成 （南大P480，图12－2）
途径称为补救途径。通过补救途径可以重新 利用核酸分解产生的嘌呤和嘧啶或它们的衍 生物。
从胸腺嘧啶或胸苷转变成胸苷酸的补救途径，
除真菌外，对所有细胞都是一样的，故常利 用放射性同位素标记胸腺嘧啶或胸苷参入DNA 的实验作为检查DNA合成的手段。
三、核苷酸合成的补救途径2
核苷 核糖-1-磷酸
激酶
核糖-5-磷酸
1．鸟嘌呤的分解
动物组织中广泛含有鸟嘌呤酶，可以催化 鸟嘌呤水解脱氨产生黄嘌呤，然后黄嘌呤在黄 嘌呤氧化酶的作用下氧化成尿酸。
第十二章 DNA的复制和修复
第十二章 DNA的复制和修复第十二章dna的复制和修复解释名词:1.激活体:在dna制备的生长点，即为激活叉上，原产着各种各样与激活有关的酶和蛋白质因子，它们构成的复合物称为复制体:。
2.oric:大肠杆菌的复制起点称为oric，由245个bp构成，其序列和控制元件在细菌复制起Behren十分激进。
3.引发体:由dnab解螺旋酶和dnag引物合成酶构成了复制体的一个基本功能单位，称为引起体4.端粒：它就是由许多成串长的重复序列所共同组成。
该重复序列通常一条链上含有g（g-rich)，而其互补链上富含c（c-rich)。
5.端粒酶:就是一种所含rna链的逆转录酶，它以所不含rna为模板去制备dna端粒结构。
6.一：填空题1.参予dna激活的主要酶和蛋白质包含________________、________________、________________、________________、________________、________________和________________。
2.dna激活的方向从________________端的至________________端的进行。
3.大肠杆菌在dna复制过程中切除rna引物的酶是________________，而真核细胞dna复制过程中切除rna引物的酶是________________或________________。
4.大肠杆菌染色体dna激活的初始区被称作________________，酵母细胞染色体dna 激活的初始区被称作________________，两者都含有________________碱基对，这将有助于________________过程。
5.大肠杆菌dna连接酶采用________________能源物质，t4噬菌体dna连接酶采用________________做为能源物质。
6.________________和________________酶的缺乏可导致大肠杆菌体内冈崎片段的堆积。
东北师范大学生物化学第十二章 核酸的生物合成1
限制性 内切酶
3′—C—A—A—T—T
G—5′
粘性末端(该末端能与具有互补碱基的目的基 因的DNA片段连结 )
限制性内切酶：
识别DNA特定核苷酸序列 回文序列 限制性内切酶和核酸修饰酶共同作用， 保护自身的DNA 重要的生物化学工具酶
（八） 基因重组与DNA“克隆”
（九） 聚合酶链式反应（PCR）技术 与DNA扩增
不对称转录（以DNA的一条链位模板）
2 依赖DNA的RNA聚合酶
（1）以DNA为模板
（2）以四种核糖核苷三磷酸为底物 （3）链的生长方向是5′→3′（聚合酶） （4）不需要引物，也无校正功能
（5）产物第一个核苷酸带有3个磷酸基。
（1）大肠杆菌RNA聚合酶
全酶
α2 β β/ σ ω
核心酶（催化磷酸二酯键的形成） 识别起始位点
SSB防止双链 DNA形成
DNA旋转酶 (拓扑异构酶）
冈崎片段的RNA引物
冈崎片段需要引物，RNA引物的合成 “引发”：
引物合成酶：RNA聚合酶，催化合成约10个核苷酸
引物体
（催化合成 引物） 几种蛋白质
引物RNA在复制过程中暂时存在，最后通过PolⅠ的 5′→3′外切酶活力水解。
（3）DNA链的延长
5′→3′ 3′→5′ 5′→3′ 核酸外切酶 核酸外切酶 聚合酶
Klenow fragment
该酶由一条多肽链组成，分子量为109KD。
1. DNA聚合酶Ⅰ
5′→3′聚合酶活性
催化DNA链的延长
3′→5′外切酶活性
校对功能
5′→3′外切酶活性
切除RNA引物 DNA损伤修复
DNA聚合酶Ⅰ 分子量 每个细胞中的分子数
（1）大肠杆菌RNA聚合酶
分子生物学原理：第十二章 基因表达调控1
基本方式。
二、乳糖操纵子调节机制
结构基因：lacZ（β－半乳糖苷酶） lacY（通透酶） lacA （乙酰基转移酶）
操纵序列：O1、 O2、O3 启动子：P
CAP结合位点
调节基因：I
Lac操纵子结构及其负性调节
Lac操纵子的调节
1、阻遏蛋白的负调节
阻遏基因
DNA
I
真核基因组结构庞大
真核基因组含有大量重复序列
多拷贝序列
高度重复序列（106 次） 中度重复序列（103 ~ 104次）
单拷贝序列
真核生物以染色质的形式储存遗传信息
真核生物转录与翻译分割进行
真核基因转录产物为单顺反子
真核基因具有不连续性
真核生物线粒体DNA也储存遗传信息
二、染色质的活化
反式作用因子（trans-acting factor） ——由某一基因表达产生的蛋白质因子，与被
调节的DNA调节序列相互作用而发挥作用，这些蛋 白质分子称为反式作用因子。
反式作用因子直接作用： •直接结合DNA序列
反式作用因子间接作用： •通过蛋白质－蛋白质相 互作用发挥功能
基因表达调控的生理意义
基因表达的时间特异性和空间特异性
基因表达的持续性
管家基因
基因表达的可诱导性
诱导与阻遏
二、基因表达调控
1
多层次
DNA 基因激活 、拷贝数重排 、DNA 甲基化 RNA 转录起始、转录后加工、mRNA降解
蛋白质 蛋白质翻译、翻译后加工修饰、蛋白质降解
2
在一定机制控制下，功能上相关的一组基因，无论其为
II. 增强子(enhancer)
增强子是一种能够提高转录效率的顺式调控元件。
生化-第12章-蛋白质的生物合成(20150512)
2．方向性（direction） 起始密码子总是位于编码区5′-末端， 而终止密码子位于3′-末端，每个密码子的 三个核苷酸也是按照5′→3′方向阅读，不能 倒读。
5′ 读码方向 3′
N
肽链延伸方向
C
3．简并性（degeneracy） 遗传密码中，除色氨酸和甲硫氨酸 仅有一个密码子外，其余氨基酸均有2
参与核糖体循环的起始因子
原核生物蛋白质合成起始阶段
• • • • 起始三元复合物的形成； mRNA在小亚基定位结合； 起始氨基酰-tRNA定位在P位； 起始复合物的形成。
1．起始三元复合物的形成
2．mRNA在小亚基定位结合
SD序列（Shine-Dalgarno sequence） ： 在mRNA起始密码子的上游8~13个核苷酸处有一 段4~9个核苷酸组成的富含嘌呤核苷酸的序列，以 AGGA为核心，它可与核糖体小亚基中的16S rRNA 3′-端富含嘧啶的序列（UCCU）互补。
二、肽链合成的起始
指mRNA和起始氨基酰-tRNA与核蛋白体共 同构成起始复合物 。这一过程需要起始因子 （IF）、GTP和镁离子参与。 起始氨基酰-tRNA的表示方法：tRNAiMet
真核生物： Met-tRNAiMet
原核生物： fMet-tRNAifMet
甲硫氨酸 甲酰甲硫氨酰
原核生物中的起始因子有3种： IF1直接结合到小亚基A位，阻止tRNA过早与A 位结合； IF2具有GTP酶活性，催化fMet-tRNAifMet结合 至小亚基，并阻止其它负载tRNA与小亚基结合。 IF3结合于小亚基E位，阻止小亚基与大亚基的 结合，并促进fMet-tRNAifMet结合至核糖体的P位。
NH2 A1 A2A3A4……Anp……………….Amp…………….Aup……………COOH
第十二章-表观遗传学
表观遗传修饰的分子机制
11 2 3
DNA 甲基化 DNA 甲基化
组蛋白修饰 RNA调控
一、DNA甲基化
DNA甲基化(DNA methylation)是研究得最清楚、 也是
最重要的表观遗传修饰形式，主要是基因组 DNA上的胞嘧 啶第5位碳原子和甲基间的共价结合，胞嘧啶由此被修饰为 5甲基胞嘧啶(5-methylcytosine，5mC)。
NOEY2 1p31
被组蛋白覆盖的基因如果要表达，首先要改变组蛋白的
修饰状态，使其与DNA的结合由紧变松，这样靶基因 才能与转录复合物相互作用。因此，组蛋白是重要的染
色体结构维持单元和基因表达的负控制因子。
组蛋白修饰种类
乙酰化-- 一般与活化的染色质构型相关联，乙酰化修饰
大多发生在H3、H4的 Lys 残基上。
等位基因处于不同的修饰状态。
表达的调控。 RNA干扰。
蛋白修饰：通过对特殊蛋白修饰或改变蛋白的构象实现对基因 非编码RNA调控：通过某些机制实现对基因转录的调控，如
意义：
任何一个层面异常，都将影响染色质结构和基因表达，导致复
杂综合征、多因素疾病以及癌症。和DNA序列改变不同的是， 许多表观遗传的改变是可逆的，这就为疾病的治疗提供乐观的 前景。
第十二章 表观遗传学
不依赖于DNA序列的遗传现象
掌握表观遗传、基因组印记的概念
熟悉DNA甲基化、组蛋白修
1. DNA自身通过复制传递遗传信息；
2. DNA转录成RNA； 3. RNA自身能够复制 (RNA病毒)； 4. RNA能够逆转录成DNA； 5. RNA翻译成蛋白质。
DNMT1
SAM S-腺苷甲硫氨酸 胞嘧啶
细胞生物学 第十二章 细胞增殖及其调控
第十二章细胞增殖及其调控一、细胞增殖的意义细胞增殖cell proliferation,是细胞生命活动中的一个重要部分，对于多细胞生物体的生长发育以及生物种群的延续都具有十分重要的意义。
例如一个成年人约由1014个细胞构成，而如此多的细胞均来源于同一个受精卵，是通过大量的、连续不断地细胞分裂增殖以及细胞分化才形成人体的。
此外，每个人体平均每秒钟还要增补产生几十万个新细胞，来补偿体内各种衰亡细胞的损失，维持机体细胞数量的相对平衡。
二、细胞周期 cell cycle（一）细胞周期的概念细胞增殖包括：细胞生长、DNA复制和细胞分裂三个主要事件，构成细胞周期。
可分为四个期：G1期、S期、G2期和M期。
其中的S期是DNA合成期，M期是分裂期，而G1和G2期分别是合成前期和合成后期。
因为分裂期染色体出现了明显形态特征，∴通常从一次分裂中期到下一次分裂中期的历程称为一个周期。
M期中又可分为前期、中期、后期和末期四个阶段。
从细胞增殖行为来看，细胞在晚G1期开始分歧为三类：①周期性细胞，即持续在周期中运转的细胞；②G O期细胞（休眠细胞），即暂时脱离周期不增殖，但在适当刺激下仍可恢复进入周期的细胞；③终端分化细胞（特化细胞），即不可逆地脱离周期，丧失分裂能力，但仍然保持正常生理机能的细胞。
（二）细胞周期的速率细胞周期时间（TC）是随细胞类型不同而异的，周期内四个期的时间亦各不相同。
一般规律是：①S期长,M期短；②G1期时间（TG1）易变，但TG2、TS和TM都变动不大；③ TG1长短是细胞周期速率变化的基础。
（三）细胞周期各时相的时间测定●仅M期可依据染色体形态变化来判断，而其它的三个期皆无形态判断依据。
●3H—TdR脉冲标记和放射自显影观测▲标记物仅在S期能渗入细胞▲最先在M期显现标记的是被标记时的S期最晚期细胞▲细胞周期中各期时间的推算：TG2 = 换液洗脱→被标记M细胞出现TM = 被标记M细胞出现→占M细胞总数最大值TS= 被标记M细胞达总数的50%→降回50%TC= 被标记M细胞始出现→再次又开始出现TG1 = TC-TG2-TM-TS●流式细胞仪测定法能快速测定和分析流体中的细胞或颗粒物的各种参数，如DNA、RNA和蛋白质等含量变化，目前被广为应用于细胞周期研究。
第十二章 生物化学DNA合成
复制叉
复制泡的两个复制叉向相反方向移动，双链不断解开， 复制不断向两侧推进。新合成的子代链与亲本链互补，并 形成双螺旋结构的子代DNA。
复制叉会合 处复制终点
连续合成
复制起点
复制起点
亲代 亲代 DNA DNA
不连续合成
复 制
三、DNA是半不连续复制的
3′
5′
新链合成是从5′→3′端进行 的其中一条链从起始点开始连 续合成，并与复制叉前进方向 一致——前导链
DNA复制起始必须精确受到调控，因为每个生命周期复制只 发生一次。现已知，复制起始的时序受到DNA甲基化和细菌 细胞质膜相互作用的影响。
E.Coli 的 oriC DNA是由Dam甲基化酶甲基化的，而甲基化
发 生在回文顺序（5′）GATC的腺嘌呤N6 (m6A)，大肠杆菌的
oriC区密布GATC顺序（在245bp的DNA链中含有11个GATC）
P ～ P ～ P
5′
A
5′→3′聚合酶活性
3′ 5′
P P P P P P P P P P P
PPi
P P P P P P
A G C A T C G T A G C A T C G T T C G T A 3′-OH
P P P P
5′
聚合酶催化形成3′磷酸酯键使
单核苷酸随即被添加到3′端
Ⅰ型DNA聚合酶用胰蛋白酶温和处理，可以把5′→3′核
亚基数
1 6（同亚基） 1
功能
识别原点，在特异位点打开DNA双链 DNA解螺旋酶 辅助DnaB与原点结合
HU
引物酶（DnaG) SSB RNA聚合酶 TopoⅡ Dam甲基化酶
19
60 75.6 454 400 32
第十二章___遗传信息的传递和表达答案
第十二章遗传信息的传递和表达学号姓名成绩一、填空题1、参与DNA复制的主要酶和蛋白质包括DNA连接酶、DNA聚合酶、引发酶、解链酶、拓扑异构酶、切除引物酶和单链结合蛋白酶。
2、DNA复制的方向是从5端到3端。
3、DNA连接酶和DNA聚合酶Ⅰ酶的缺乏会导致冈崎片段的堆积。
4、体内DNA复制主要使用RNA作为引物，而RNA的转录不需要引物。
5、使用枯草杆菌蛋白酶可将大肠杆菌DNA聚合酶I水解大小两个片段，其中大片段被称为klenow酶，它保留了DNA聚合酶和3,5-核酸外切酶酶活性，小片段则保留了3,5-核酸内切酶酶的活性。
6、DNA复制的主要聚合酶是DNA聚合酶Ⅲ，该酶在复制体上组装成不对称二聚体，分别负责领头链和随从链的合成。
7、DNA的损伤可分为碱基损伤和DNA链损伤两种类型，造成DNA损伤的因素有理化因素和生理化因素。
8、基因转录的方向是从5端到3端。
9、大肠杆菌RNA聚合酶由核心酶和σ因子组成，其中前者由α亚基、β亚基和β’亚基组成，活性中心位于β亚基上。
10、原核细胞启动子－10区的序列通常被称为TA TA盒或pribnow box，其一致序列是TATAAT。
11、第一个被转录的核苷酸一般是嘌呤核苷酸。
12、真核细胞Pre-mRNA后加工方式主要有加帽、加尾、内部甲基化、编辑和剪切5种。
13、原核细胞转录终止有两种机制，一种是依赖蛋白质因子的转录终止另一种是不依赖蛋白质因子的转录终止。
14、蛋白质的生物合成是以mRNA作为模板，tRNA作为运输工具，rRNA作为合成场所。
15、细胞内多肽链合成的方向是从N端到C端，而阅读mRNA的方向是从5端到3端。
16、核糖体上能够结合tRNA的部位有A部位、P部位和E部位。
17、蛋白质的生物合成通常以AUG作为起始密码子，有时也以GUG作为起始密码子，以UAG、UAA和UGA作为终止密码子。
18、原核生物合成中第一个被掺入的氨基酸是甲酰甲硫氨酸。
二、选择题1、逆转录酶是一类：（ C ）A、DNA指导的DNA聚合酶B、DNA指导的RNA聚合酶C、RNA指导的DNA聚合酶D、RNA指导的RNA聚合酶2、 DNA上某段碱基顺序为5’-ACTAGTCAG-3’，转录后的上相应的碱基顺序为：（ C ）A、5’-TGATCAGTC-3’B、5’-UGAUCAGUC-3’C、5’-CUGACUAGU-3’D、5’-CTGACTAGT-3’3、假设翻译时可从任一核苷酸起始读码，人工合成的（AAC）n（n为任意整数）多聚核苷酸，能够翻译出几种多聚核苷酸？（C）A、一种B、二种C、三种D、四种4、参与转录的酶是（A）A、依赖DNA的RNA聚合酶B、依赖DNA的DNA聚合酶C、依赖RNA的DNA聚合酶D、依赖RNA的RNA聚合酶5、RNA病毒的复制由下列酶中的哪一个催化进行? （ B ）A、RNA聚合酶B、RNA复制酶C、DNA聚合酶D、反转录酶6、大肠杆菌有三种DNA聚合酶，其中参予DNA损伤修复的是（ A ）A、DNA聚合酶ⅠB、DNA聚合酶ⅡC、DNA聚合酶Ⅲ7、绝大多数真核生物mRNA5’端有（A）A、帽子结构B、PolyAC、起始密码D、终止密码8、羟脯氨酸：（ B ）A、有三联密码子B、无三联密码子C、线粒内有其三联密码子9、蛋白质合成起始时模板mRNA首先结合于核糖体上的位点是（ B ）A、30S亚基的蛋白B、30S亚基的rRNAC、50S亚基的rRNA10、能与密码子ACU相识别的反密码子是（ D ）A、UGAB、IGAC、AGID、AGU11、原核细胞中新生肽链的N-末端氨基酸是（ C ）A、甲硫氨酸B、蛋氨酸C、甲酰甲硫氨酸D、任何氨基酸12、tRNA的作用是（ D ）A、A、把一个氨基酸连到另一个氨基酸上B、将mRNA连到rRNA上C、增加氨基酸的有效浓度D、把氨基酸带到mRNA的特定位置上。
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1.
DNA的分离：
• 质粒DNA的提取基本步骤： 1）质粒载体的选择； 2）培养细 菌使质粒扩增；3）收集和裂解细胞。溶菌酶破坏细菌细胞壁， 再同SDS和triton X-100可使细胞膜裂解，用强热或酸、碱处理 后中和、复性就可以提取到质粒DNA。有煮沸裂解法、碱裂解法
等。 • 噬菌体DNA的提取基本步骤：1）感染力的测定，一般用噬菌
第十二章DNA、RNA和蛋白质
DNA篇
DNA的基本操作：DNA（线状双链DNA）、ocDNA（开
环双链DNቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ）、cccDNA（闭环双链DNA）。
DNA是相当稳定的，但是使用时也不能太随意，DNA的污染来源主要 是其他DNA分子。
• DNA保存：
DNA在中性PH，低温，暗处，合适的盐浓度和无物理剪切的 条件下较稳定 ，适宜保存。用于存放DNA的缓冲液有三种,TE，0.1×TE(适宜酶促 反应)，T50E （适宜溶解PH不稳定的DNA）。
体裂解物感染大肠杆菌来计算感染力；2）从噬菌斑中回收噬菌 体；3）增殖噬菌体；4）平板裂解液法；5）提取噬菌体DNA。
• 真核生物基因组DNA的提取基本步骤：1）破碎细胞；2）取出 蛋白质、多糖、脂类等生物分子；3）取出盐类、有机溶剂等杂 质；4）浓缩和溶解DNA。
2.
DNA的转化
• 制备感受态细胞： 有CaCl2 法和电转化法。 •转化主要步骤： 化冻、质粒与感受态细胞接触、热激， 骤冷和目的基因的表达。
RNase无处不在。
细胞内存在大量的RNase，裂解细胞时应特别注意。
人的体液中含有大量的RNase，应尽量避免样品和样品管与体液的 接触，养成戴手套和口罩的习惯，勤更换。 空气中的灰尘和细菌中含有大量的RNase，应建立干净的操作环境。 RNase的稳定性极高，即用蛋白质变性剂SDS或苯酚不能使之完 全失活；其活性不依赖于金属离子，因此EDTA等螯合剂不能使之 失活；热稳定，仅用煮沸方式也不能使之失活。
超滤法
原理：在常温下以一定压力和流量，利用不对称微孔结构和半透膜介质，
依靠膜两侧的压力差作为推动力，以错流方式进行过滤，使溶剂及小分子 物质通过，大分子物质和微粒子如蛋白质、水溶性高聚物、细菌等被滤膜 阻留，从而达到分离、分级、纯化、浓缩目的的一种新型膜分离技术。
优缺点：
1、超滤过程是在常温下进行，条件温和无成分破坏，因而特别适宜对热 敏感的物质，如药物、酶、果汁等的分离、分级、浓缩与富集。 2、超滤过程不发生相变化，无需加热，能耗低，无需添加化学试剂，无 污染，是一种节能环保的分离技术。 3、超滤技术分离效率高，对稀溶液中的微量成分的回收、低浓度溶液的 浓缩均非常有效。 4、超滤过程仅采用压力作为膜分离的动力，因此分离装置简单、流程短、 操作简便、易于控制和维护。 5、超滤法也有一定的局限性，它不能直接得到干粉制剂。对于蛋白质溶 液，一般只能得到10～50%的浓度。
• 对于仅用限制酶处理的载体，与目的DNA连接的同时也 能进行自我连接，因此有必要将载体DNA末端进行脱磷酸 化处理，以防止载体自连。 •如果载体和目的DNA不存在合适切点，这时候就需要对 目的DNA或者载体进行修饰与改造。
RNA篇
RNA是单链分子，由A、U、C、G四个碱基串联在核糖-磷酸骨架上。 由于核糖2’是-OH，遇水易发生变构，其结构不稳定。这种不稳定的 变构反应在碱性条件下被加快。因此，RNA的长期保存是件令人头痛 的工作。 细胞内外存在大量的RNase，对RNase 产生降解反应，且该酶极稳定，因此试验 中如何避免RNase污染时意见非常重要的工作。 RNA在合适的条件下易出现分子内局部配 对，这种配对导致RNA分子形状发生改变，因 此在普通电泳中不能正确显示其大小，所以应 用变性胶电泳，利用变性剂破坏其内部配对，使RNA表现为完整的单 链状态。在PH6.0的微酸性环境下RNA相对稳定，碱性环境下易分解。
RNA的分离
前面步骤所提取的是总RNA，其中80%~85%是核糖体RNA（ rRNA ）， 10%~20%是转移RNA（ tRNA ），只有2%~5%是基因克隆中非常重要的信 使RNAPCR等实验也需要纯化的mRNA。与rRNA 和tRNA不同的是，绝大部分 mRNA的3’端均有一个poly(A)尾，称为polyRNA，可根据该结构进行分 离。 mRNA的分离方法较多，其中以寡聚（dT）-纤维素柱层析法最为有 效，已成为常规方法。此法利用mRNA 3’末端含有Poly（A+）的特点， 在RNA流经寡聚（dT）纤维素柱时，在高盐缓冲液的作用下，mRNA被特 异地结合在柱上，当逐渐降低盐的浓度时或在低盐溶液和蒸馏水的情 况下，mRNA被洗脱，经过两次寡聚（dT）纤维柱后，即可得到较高纯 度的mRNA。
3.DNA的扩增：主要是PCR技术
4.DNA的重组：指将目的基因从这一载体插入到 另一载体的过程。
• • • • • • 目的DNA的准备。 载体准备 对目的DNA片段和载体磷酸化 处理。 酶切完毕的DNA和载体连接。 连接DNA转入合适宿主菌，获 取重组体。 筛选，检测重组体。
DNA重组过程中的注意点：
主要操作过程
细胞破碎和碎片分离
浓缩
进一步纯化
常用指标分析
细胞的破碎
物理法：主要通过各种物理因素使组织细胞破碎的方法。 常用的方法有： 1. 反复冻溶法：因突然冷冻，细胞内冰晶的形成及 胞内外 溶剂浓度的突然改变而破坏细胞。 特点：此法适用于组织 细胞，多用于动物性材料，对微生物细胞作用较差。 2. 超声波处理： 用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细 胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，用大肠杆菌制 备各种酶，特点：操作简单，重复性较好，节省时间；多用 于微生物和组织细胞的破碎。 3.高速珠磨法。 4.高压匀浆法。
二、常用的RNA酶抑制剂
1.焦磷酸二乙酯（DEPC）：是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂，他通
过和RNA酶的活性基因团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶 的活性。
2.异硫氰酸胍 ：它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来， 又对RNA酶有强烈的变性作用。 3.氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和 RNA酶结合 形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNA酶的活性。 4.RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin ）：从大鼠肝或人胎盘中提取得来 的酸性糖蛋白。RNasin 是RNA酶的一种非竞争性抑制剂，可以和多 种RNA酶结合，使其失活。
盐析法
原理：加入中性盐蛋白质溶液中，蛋白质的溶解度开始增大 （盐溶），
但随着继续加盐，蛋白质的溶解度却逐步减小，并形成沉淀，即成为盐析。
影响因素：
1．蛋白质浓度 高浓度蛋白溶液可以节约盐的用量，但若蛋白浓度过高，会发生严重的共 沉淀作用；在低浓度蛋白质溶液中盐析，所用的盐量较多，而共沉淀作用 比较少，因此需要在两者之间进行适当选择。一般认为2.5%-3.0%的蛋白 质浓度比较适中。 2．离子强度和类型 一般说来，高价阴离子沉淀效果好，单价阳离子中，铵离子效果好于钾、 钠离子。常用硫酸铵，因其价格便宜，溶解度高，对温度敏感性低。 3．PH值 与蛋白质等电点有关，但必须注意在水中或稀盐液中的蛋白质等电点与高 盐浓度下所测的结果是不同的，需根据实际情况调整溶液PH值，以达到最 好的盐析效果。 4．温度 在一般情况下，蛋白质对盐析温度无特殊要求，可在室温下进行，只有某 些对温度比较敏感的酶要求在0-4℃进行。
紫外分光光度计
测定 A260与A280 的值，根据二者的比值来估计制备样品的纯度，纯净的DNA比 值为1.8，纯净的RNA比值为2.0，比值过大过过小则说明样品中含有蛋白质杂 质，需去除。
蛋白质
蛋白质操作的原则
首先，必须了解待纯化样品中目的蛋白及主要杂质的 性质，尽可能多的收集有关蛋白质来源、性质和稳定性等 信息，有助于设计蛋白质纯化方案。 其次，纯化开始前必须了解最终产品的用途，要综合 考虑纯化产品的质量、数量和经济性等三方面的要求。 最后，充分了解各分离纯化技术操作单元的大量信息 也很重要。
蛋白质浓缩法
吸附法
原理：将干的惰性多孔基质聚合物，如葡聚糖凝胶，加 入到蛋白质溶液中吸收水和其他小分子，当凝胶完全膨 胀后，没用过滤或离心方法去除凝胶，分离出蛋白质。
优缺点：简单快速，仪器简单，适应于稳定性较差的蛋 白质。但选择性比较差，不能连续操作，浓缩倍数较低， 蛋白质回收率低，仅有80%~90%。
蛋白质样品的分离
聚沉： 聚沉剂主要是无机盐类（如氯化锌、氯化铝、硫酸盐等） 和聚合无机盐（聚合铝、聚合铁等）。为促进聚沉的产生， 可以降温至20℃以下进行；调整pH至3~6；提高离子浓度； 增加颗粒数量；增加多价金属离子等方法。 离心： 对于低粘度介质中的细菌，2000~3000g、10~15min；对 于高粘度的溶液，则需更高的速度和更长的时间，如细胞 碎片，12000g、30~45min；对于蛋白质沉淀，5000g、 30min或15000g、10min 过滤： 孔径一般为0.2um或0.45um，常压或减压过滤。
防止RNA酶污染
一、防止RNA酶污染 的措施 1.所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6h或更长时间。 2.塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗（注意：有机玻璃器具 因可被氯仿腐蚀，故不能使用）。 3.有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，
再浸泡在3% H2O2 室温10min，然后用0.1% DEPC水冲洗，晾干。
• DNA检测： 1.紫外吸收 2.溴化乙锭（EBa）
• DNA浓缩： 1. DNA不溶于乙醇，所以一般用乙醇沉淀DNA来达到纯
化的目的; 2.异丙醇沉淀； 3.有机溶剂浓缩DNA，如正丁醇。
• DNA纯化： 1. 酚抽提（适宜样品DNA中混有蛋白质污染）；2.苯酚/
氯仿/异戊醇抽提; 3.DEAE/纤维素交换树脂(其他杂质); 4.凝胶过滤(适宜除 去样品中含有盐、缓冲液组分、小分子杂质等)。