小鼠骨髓来源树突状细胞(BMDC)的培养
树突状细胞培养方法
树突状细胞培养方法树突状细胞（Dendritic Cells，DCs）是一类免疫细胞，主要负责识别和激活T细胞，发挥着重要的免疫调节和抗肿瘤等作用。
为了进行树突状细胞的研究，科研人员需要对其进行体外培养。
本文将介绍常用的树突状细胞培养方法。
1.制备树突状细胞前驱细胞：树突状细胞前驱细胞主要存在于外周血和骨髓中。
首先，采集外周血或骨髓，并将其进行红细胞裂解。
然后，用PBS洗涤样品，离心沉淀细胞。
最后，将细胞进行培养。
2.培养基的选择：培养树突状细胞需要选择适宜的培养基。
目前常用的培养基有RPMI1640、DMEM等。
添加10-20%的胎牛血清（FBS）可以提供必要的生长因子和营养物质。
3.添加生长因子：在培养树突状细胞的过程中，可能需要添加一些生长因子来促进细胞的分化和增殖。
常见的生长因子包括GM-CSF（粒细胞巨噬细胞集落刺激因子）和IL-4（白细胞介素4）。
可以将这些生长因子添加到培养基中，以达到最佳生长条件。
4.细胞培养条件的控制：树突状细胞对培养条件非常敏感。
因此，需要对温度、湿度、CO2浓度等参数进行严格控制。
一般来说，将细胞培养在37摄氏度、5%CO2的培养箱中。
5.细胞的分离和传代：在树突状细胞培养过程中，细胞会不断增殖。
为了保证细胞的活力和稳定性，需要定期分离和传代细胞。
可以使用胰酶等消化酶将细胞从培养瓶中剥离，然后进行细胞计数并按照一定比例进行传代。
6.细胞质量的评估：在培养树突状细胞的过程中，需要对细胞质量进行评估。
可以通过使用流式细胞仪等设备来检测细胞表面标记物的表达情况，以及细胞活力、树突状突起的形态等指标来评估细胞的质量。
7.树突状细胞的激活：树突状细胞的主要功能是激活T细胞。
为了使树突状细胞具备充分的抗原递呈能力，可以使用多种促进细胞激活的方法，如脂多糖、TNF-α等。
总结：树突状细胞培养方法包括制备前驱细胞、培养基选择、生长因子添加、细胞培养条件控制、细胞分离和传代、细胞质量评估以及细胞的激活等步骤。
小鼠骨髓源树突状细胞的体外培养及鉴定
源 的未 成 熟 和 成 熟 Ｄ Ｃ．
［ 关键词］树突状细胞 ；小 鼠；近交系 ；骨髓 细胞 ；吞 噬作用
［ 中图分类号］Ｒ ３ ２ ２ ． ２［ 文献标识码］Ａ ［ 文章编号］２ ０ ９ ５ －６ １ ０ Ｘ （ ２ ０ １ ３ ）１ １ －０ ０ ０ ５ －０ ４
Ｃｕ ｌ ｔ ｉ ｖ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ａ ｎｄ Ｉ ｄｅ ｎｔ ｉ ｉｃ ｆ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ Ｄｅ ｎｄ ｒ ｉ ｔ ｉ ｃ Ｃｅ ｌ ｌ ｓ ｆ ｒ ｏ ｍ Ｍｏ ｕｓ ｅ Ｂｏ ｎｅ Ｍａ ｒ ｒ ｏ ｗ ｉ ｎ Ｖｉ ｔ ｒ ｏ
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（ １ ）Ｂ ｉ ｏ ｍ ｅ ｄ ｉ ｃ ａ ｌ Ｒ ｅ ｓ ｅ ａ ｒ ｃ ｈ Ｃ ｅ ｎ ｔ ｅ ｒ ，Ｔ ｈ ｅ Ａ ｆ ｉｌ ｆ ｉ ａ ｔ ｅ ｄ Ｃ ｌｍ ａ ｅ ｔ ｔ ｅ Ｈｏ ｓ ｐ ｉ ｔ ｌ ａ ｏ ｆＫｕ ｎ ｍｉ ｎ ｇ Ｍｅ ｄ ｉ ｃ ａ ｌ Ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ ，Ｋｕ ｎ ｍｉ ｎ ｇ Ｙ ｕ ｎ ｎ ａ ｎ ６ ５ ０ ０ １ １ ； ２）Ｄ ｅ ｐ ｔ ． ｆＡ ｏ ｎ ｅ ｓ ｔ ｈ ｅ ｓ ｉ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ ，Ｔ ｈｅ Ｉ ｓ ｔ Ａ ｆ ｉｌ ｆ ｉ ｔ ａ ｅ ｄ Ｈｏ ｓ ｐ ｉ ｔ ａ ｌ ｆＫ ｏ ｕ ｎ ｍ ｉ ｎ ｇ Ｍｅ ｄ ｉ ｃ ａ ｌ Ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ ， Ｋｔ ｍｍｉ ｎ ｇ Ｙ ｕ ｎ ｎ ａ ｎ ６ ５ ０ ０ ３ １ ，Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ ） ［ Ａｂ ｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ］ Ｏｂ ｊ ｅ ｃ ｔ ｉ ｖ ｅ Ｔ ｏ ｅ ｓ ｔ ａ ｂ ｌ ｉ ｓ ｈ ａ ｍｅ ｔ ｈ ｏ ｄ ｏ ｆ ｃ ｕ ｌ ｔ ｉ ｖ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ ｄ ｅ ｎ ｄ ｒ ｉ ｔ ｉ ｃ ｃ ｅ ｌ ｌ ｓ（ ＤＣ ） ｆ ｒ ｏ ｍ ｍｏ ｕ ｓ ｅ ｂ ｏ ｎ ｅ ｍ ａ ｒ ｒ ｏ ｗ
小鼠骨髓来源树突状细胞(BMDC)培养
小鼠骨髓来源树突状细胞（BMDC）的培养1、取骨髓，对倍稀释2、用滴管沿管壁缓慢加入淋巴细胞分离液(45度角倾斜，尽量产生气泡，起到缓冲作用)3、2000转，离心30分钟4、吸取白膜层，（沿管壁）交替多次吸取，加入5倍体积以上的PBS液5、1500转，离心15分钟（洗掉血小板）6、弃掉上清，留少许回流液，轻弹管壁，加入PBS液至50ml7、800转，离心10分钟，（洗掉红细胞）8、重复两至三次9、加入PBS液至50ml，计数:？个细胞离心后铺板，1X1076孔板培养液，共铺20板。
无血清1640+DNA酶12h后轻晃培养液，洗板后加入完全培养基和GM—CSF(1000U/ml)和IL—4(500U/lml) 10、第三天每孔补加等体积的完全培养基和GM—CSF(1000U/ml)和IL—4(500U/lml) ，这时细胞部分悬浮11、第五天为imDC，+1LPS(1ug/ml),诱导至第七天，为mDC。
参考Inaba等人的方法，并根据本实验室的经验稍作改进。
即：1. 颈椎脱位法处死C57BL/6小鼠，无菌状态下取股骨和胫骨，浸泡在RPMI-1640培养基中。
2. 用1ml注射器吸取RPMI-1640培养液，从骨干的一端刺入骨髓腔，将骨髓冲洗到一无菌培养皿中，每根骨头反复4～6遍，收集培养皿中的骨髓细胞悬液，离心，1500 rpm×10min。
3. 弃去上清，加入5 ml无菌Tris-NH4Cl溶液悬浮细胞溶解红细胞，于室温下静置2分钟溶解红细胞后，再次离心，1500 rpm×5min，弃上清。
4. 用RPMI-1640培养液洗涤后将细胞用完全培养基悬浮，分至6孔培养板中，并在每孔中加入完全培养基至4 ml，再加入rmGM-CSF至终浓度10 ng/ml，IL-4终浓度10ng/ml。
5. 将细胞培养板放入37℃，含5% CO2的孵箱中培养48小时。
6. 轻轻吹打细胞后，连同培养液一起吸去悬浮细胞，仅保留贴壁细胞。
小鼠树突状细胞(DC)培养
8．加入树突细胞培养液重悬细胞，调整细胞数至1×106/ml(Scepter自动细胞计数器,美国Millipore公司)，按2ml/孔接种至12孔细胞培养板（4.5cm2/孔），置37℃、5%CO2孵箱培养。
9．于培养第3，5天每孔分别更换2ml树突细胞培养液。第6天收集悬浮细胞，流式抗体染色后，流式细胞仪检测树突状细胞的表型。
1.4.4 红细胞裂解液pH7.2（1L）：
NH4CL 8.56g
Tris碱 2.059g
MilliQ水定容至1L 调节pH至7.2
1．处死BALB/c小鼠并浸泡于75%医用酒精10min，随后取小鼠股骨及胫骨并用眼科剪剔除附着在骨骼上的肌肉。
2．剪掉两侧股骨头，将吸满PBS缓冲液的注射器针头插入骨腔中，并缓慢推动注射器冲洗骨髓腔，直至骨变白。
3．将收集到的骨髓细胞悬液500×g离心5mim，弃上清。
4．向骨髓细胞沉淀中加入红细胞裂解液并反复吹打混匀，置37℃孵箱孵，吸弃上清。用PBS重悬细胞沉淀，200钼铜网过滤除去骨髓细胞悬液中组织碎块。
6．用1ml PBS缓冲液重悬细胞，加入功能纯化抗体抗-小鼠CD4/CD8a/ MHC-Ⅱ/CD45R及兔血清补体，37℃孵育1h，以去除T淋巴细胞、B淋巴细胞及MHC-Ⅱ+细胞。(功能纯化抗体抗-小鼠 CD4(L3T4)、CD8a(Ly-2)、CD45R(B220)、MHC-Ⅱ（I-A/I-E）抗体购自eBioscience公司)
bmdc培养方法
bmdc培养方法BMDC培养方法是一种常用的小鼠树突状细胞(Dendritic Cell, DC)培养方法，主要用于研究DC的功能和调控机制。
以下是关于BMDC 培养方法的详细介绍：1. 实验材料准备：小鼠骨髓细胞RPMI-1640培养基小鼠GM-CSF(粒细胞巨噬细胞集落刺激因子)和IL-4(白细胞介素-4)无菌培养箱、离心机、显微镜等实验设备2. BMDC的获取：从小鼠的股骨和胫骨中提取骨髓细胞，用RPMI-1640培养基洗涤并悬浮。
将骨髓细胞以1×10^6/mL的密度接种到无菌的培养瓶中，加入GM-CSF和IL-4，使其终浓度分别为50ng/mL和20ng/mL。
将培养瓶置于37℃，5%CO2的培养箱中，每两天更换一次培养基。
3. BMDC的成熟：在BMDC培养的第5天，用GM-CSF和IL-4继续诱导BMDC的成熟。
此时，GM-CSF的浓度可以降低至25ng/mL，而IL-4的浓度可以维持在20ng/mL。
在BMDC培养的第7天，观察BMDC的形态变化，成熟的BMDC 呈树突状，表面有丰富的毛刺状突起。
此时，可以收集成熟的BMDC 进行后续实验。
4. BMDC的功能检测：将成熟的BMDC与抗原提呈细胞(如B细胞、T细胞等)共培养，观察BMDC对抗原提呈细胞的激活作用。
将成熟的BMDC与特异性抗体结合，观察BMDC对抗原的识别和摄取能力。
将成熟的BMDC与免疫细胞(如T细胞、NK细胞等)共培养，观察BMDC对免疫细胞的调节作用。
5. BMDC的应用：用于研究DC的功能和调控机制，如DC的抗原提呈、共刺激信号传导、凋亡抑制等。
用于制备疫苗，通过激活T细胞和B细胞，提高机体对病原体的免疫力。
用于研究免疫耐受、自身免疫性疾病等疾病模型。
总之，BMDC培养方法是一种常用的小鼠树突状细胞培养方法，通过诱导骨髓细胞分化为成熟的树突状细胞，可以用于研究DC的功能和调控机制，以及制备疫苗等应用。
小鼠骨髓来源树突状细胞（BMDC）培养
小鼠骨髓来源树突状细胞（BMDC）培养小鼠骨髓来源树突状细胞（BMDC）的培养1、取骨髓，对倍稀释2、用滴管沿管壁缓慢加入淋巴细胞分离液(45度角倾斜，尽量产生气泡，起到缓冲作用)3、2000转，离心30分钟4、吸取白膜层，（沿管壁）交替多次吸取，加入5倍体积以上的PBS液5、1500转，离心15分钟（洗掉血小板）6、弃掉上清，留少许回流液，轻弹管壁，加入PBS液至50ml7、800转，离心10分钟，（洗掉红细胞）8、重复两至三次9、加入PBS液至50ml，计数:？个细胞离心后铺板，1X1076孔板培养液，共铺20板。
无血清1640+DNA酶12h后轻晃培养液，洗板后加入完全培养基和GM—CSF(1000U/ml)和IL—4(500U/lml) 10、第三天每孔补加等体积的完全培养基和GM—CSF(1000U/ml)和IL—4(500U/lml) ，这时细胞部分悬浮11、第五天为imDC，+1LPS(1ug/ml),诱导至第七天，为mDC。
参考Inaba等人的方法，并根据本实验室的经验稍作改进。
即：1. 颈椎脱位法处死C57BL/6小鼠，无菌状态下取股骨和胫骨，浸泡在RPMI-1640培养基中。
2. 用1ml注射器吸取RPMI-1640培养液，从骨干的一端刺入骨髓腔，将骨髓冲洗到一无菌培养皿中，每根骨头反复4～6遍，收集培养皿中的骨髓细胞悬液，离心，1500 rpm×10min。
3. 弃去上清，加入5 ml无菌Tris-NH4Cl溶液悬浮细胞溶解红细胞，于室温下静置2分钟溶解红细胞后，再次离心，1500 rpm×5min，弃上清。
4. 用RPMI-1640培养液洗涤后将细胞用完全培养基悬浮，分至6孔培养板中，并在每孔中加入完全培养基至4 ml，再加入rmGM-CSF 至终浓度10 ng/ml，IL-4终浓度10ng/ml。
5. 将细胞培养板放入37℃，含5% CO2的孵箱中培养48小时。
小鼠骨髓及脾脏来源的树突状细胞培养及鉴定
Ｃ Ｆ 和 白细 胞 介 素 （Ｌ ４ 协 同 诱 导 下 培 养 ， Ｓ） Ｉ－ ） 光镜 下 观 察 Ｄ 的 形 态 ， 式 细 胞 仪 检 测 Ｃ ８ 、 Ｄ ６表 达 水 平 。结 果 Ｃ 流 Ｄ ０Ｃ ８ 骨髓 细 胞 体 外 诱 导 培 养 ３天 后 ， 镜 下 显 示 细 胞 表 面 不 规 则 ， 树 突 状 突 起 ， 光 呈 可见 典 型 的 树 突 状 细 胞 形 态 ， 表 达 共 刺 低 激分 子 （ Ｄ ０Ｃ ８ ） Ｃ ８ ， Ｄ ６ 。结 论 与 脾 脏 细 胞 相 比 ， 髓 细 胞 中不 仅 富 含 大 量 的 ＤＣ的 前 体 细 胞 而 且 诱 导 成 ＤＣ时 间 短 。 骨 关 键 词 ： 突状 细 胞 ； 髓 ； 脏 ； 树 骨 脾
ｄ ｔ ｃ ｅ ｗｉｈ ｆｏ ｅｅ ｔｄ ｔ ｌ ｗ ｃ ｔ ｙ ｏｍｅ ｒ ｔ ｙ．Ｒｅ ｕ ｔ ｂｏ ｍ ａ ｒ ｓ ｌｓ ｎｅ ｒｏｗ ｃ ｌｓ ｐｐ ａ ｅ ｉｒ ｇｕｌｒ ａ ｏｒ ｅ ｎ ｉｉ ｐｒ ｅ ｓ ｓ ａ ｔ ｒ ｅ ｌ ａ ｅ ｒ ｄ ｒ ｅ ａ ｎｄ ｆ ｍ ｄ ｄｅ ｄｒｔｃ ｏｃ ｓ ｅ ｆｅ ３
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小鼠骨髓源树突状细胞体外诱导培养及初步鉴定
小鼠骨髓源树突状细胞体外诱导培养及初步鉴定刘铮;代继宏;符州;冯琳琳【摘要】To establish a method of cultivation and purification of dendritic cells ( DC) from mouse bone marrow in vitro and observe their morphology, recombinant mouse granulocyte and macrophage colony stimulus factor( GM-CSF) and interleukin-4( IL4) induction were used to induce mouse bone marrow cells to form dendritic cells in vitro. After 9 days , the percentage of the cultured DCs was more than 80％ with typical morphology of DCs under light microscope. The mature cells had clear marker on their surface. This meant that these used substances could stimulate allogenic mixed lymphocyte proliferation.%用重组小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rmGM-CSF)和重组小鼠白细胞介素4(rmIL-4)体外诱导小鼠骨髓细胞分化为树突状细胞,进行形态学变化观察,分析细胞表面分子,刺激T细胞增殖,探讨小鼠骨髓源树突状细胞(BMDC)体外诱导培养并进行初步鉴定.体外培养9d后BMDC可达80%以上m,光镜下可见典型的树突状细胞形态.清楚表达成熟期主要表面标志物,可显著刺激同种异体混合淋巴细胞增殖.获得了较高纯度的BMDC,避免了使用传统磁珠分离方法所带来的成本高,操作复杂,产出率低的弊端,为研究BMDC功能以及运用开展下游实验提供材料.【期刊名称】《生物学杂志》【年(卷),期】2011(028)002【总页数】4页(P25-27,31)【关键词】树突状细胞;体外诱导培养;初步鉴定【作者】刘铮;代继宏;符州;冯琳琳【作者单位】儿童发育疾病研究省部共建教育部重点实验室儿科学重庆市重点实验室重庆市(儿童发育重大疾病诊治与预防)国防科技合作基地;重庆医科大学附属儿童医院呼吸中心,重庆,400014;重庆医科大学附属儿童医院呼吸中心,重庆,400014;儿童发育疾病研究省部共建教育部重点实验室儿科学重庆市重点实验室重庆市(儿童发育重大疾病诊治与预防)国防科技合作基地【正文语种】中文【中图分类】Q813.5Abstract:To establish a method of cultivation and purification of dendritic cells(DC)from mouse bone marrow in vitro and observe theirmorphology,recombinantmouse granulocyte and macrophage colony stimulus factor(G M-CSF)and interleukin-4(I L4)induction were used to inducemouse bonemarrow cells to for m dendritic cells in vitro.After9 days,the percentage of the culturedDCswasmore than 80%with typicalmorphology ofDCs under lightmicroscope.The mature cells had clearmarker on their surface.Thismeant that these used substances could stimulate allogenic mixed lymphocyte proliferation.Keywords:dendritic cells;culture in vitro;initial appraisal树突状细胞(dendritic cell,DC)是一种专职性抗原提呈细胞,在肿瘤、抗感染免疫、移植排斥等方面起着关键的引导和调节作用,并能显著激活初始型 T淋巴细胞并诱导其增殖,处于免疫应答过程的中心环节。
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2002 年---美国匹兹堡癌症研究院大学(University of Pittsburgh Cancer Institute (UPCI)) 的 Son 也研发出一种超大量 BMDC 培养方法，称为 bulk-culture method。该法每只小鼠可获 得的 BMDC 的数量是 Inaba 经典方法的 7-10 倍，即 3 – 4 x 107 个 BMDC，而且培养时间 与 Inaba 经典方法相似，仅需 7 天[9]。 1. 2. 3. 4. 骨髓取出后仅溶血，不做任何其它处理； 使用6孔培养板培养； 培养过程中使用GM‐CSF+IL‐4联合诱导； 培养的第4天和第7天补加足量的GM‐CSF和IL‐4。
需要选择使用。 另外，我们还备有实用的 BMDC 培养操作视频(内部交流，非商用)，因文件比较大， 若需要，可通过我们的企业 QQ(号码为：800053055)向我们索取发送。
【BMDC 培养的发展简史】
1973 年 ---加拿大籍科学家 Raplph M. Steinman 在美国洛克菲勒大学 (Rockefeller University)工作时从小鼠外周淋巴器官(脾、淋巴结和派氏集合淋巴结)中首次鉴定出树突状 细胞(Dendritic Cells, DC)[1]。Steinman 也因此获得了 2011 年诺贝尔生理学或医学奖。 1992 年---日本京都大学(Kyoto University)的 Inaba 在添加 GM-CSF(粒细胞/巨噬细胞集 落刺激因子)的情况下，分别成功从小鼠血液和骨髓细胞体外诱导出大量的 DC[2,3]。因此， Inaba 被认为是小鼠 DC 体外培养的创立者，且 Inaba 法被称为小鼠 BMDC 培养的经典方 法。 1. 这些工作均是在Ralph M. Steinman的参与下完成的； 2. Inaba培养的BMDC来源于小鼠股骨和胫骨中的骨髓； 3. Inaba先用抗体+补体法去除骨髓中的淋巴细胞，以防淋巴细胞对 BMDC培养的影响； 4. 在诱导分化过程中，为防止粒细胞的干扰，Inaba通过每2天轻摇培 养板并3/4体积换液的方法来尽量去除粒细胞； 5. Inaba证实单用GM‐CSF通过6‐8天的培养，即可从骨髓细胞诱导得到 大量的DC细胞，而且混合淋巴细胞反应提示其为成熟的DC细胞； 6. 该法可从一个小鼠的骨髓中培养获得 5‐7 x 106个DC细胞。
2 详情请致电授权经销商——杭州联科生物技术股份有限公司 中国杭州拱墅区祥园路108号 智慧信息产业园三期3号楼13层 全国免费客服电话：400-6721-600 邮箱：service@
1. 骨髓不作任何预先处理； 2. 使用细菌培养皿(Petri Dish)替代细胞培养板； 3. 细胞的初始铺板密度低，为2 x 105/ml； 4. 培养时间延长至10‐12天； 5. 仍仅用GM‐CSF诱导，但第8天或第10天后减量使用； 6. 第6天和第8天半量换液，但吸出的悬浮细胞离心后放回原板。
【经典的 BMDC 培养法】-Inaba 法(改良)[3,10] 背景：
1. Inaba 法获得的 BMDC 数目为 5-7 x 106 个/小鼠； 2. Inaba 原法操作比较复杂，需要将骨髓中的淋巴细胞等用抗体+补体法预先去除， 后来的改良法均省却了这个步骤，其实 Inaba 后来自己也说这个步骤虽然可提高 BMDC 的纯度，但不会对 BMDC 的生成产生影响，可做可不做[10]； 3. Inaba 原法仅用 GM-CSF 来诱导 BMDC 的产生，虽然得到的 BMDC 在混合淋巴 细胞反应中有较强的刺激能力，但 DC 的成熟度不及 GM+IL-4 的联合诱导，所以 后来的改良法中多用 GM+IL-4 联合诱导。
收集DC，重新铺板， 以促进DC更成熟
加入以下任意一种成熟诱 导剂： 1. rmTNF‐ (25‐50ng/ml) 2. LPS (1g/ml) 3. rmCD40L (1g/ml)
【前 言】
原递呈细胞 (Antigen Presenting Cells, APC)。已证实，DC 是唯一能够显著刺激初始 T 细胞 (Naï ve T cells)增殖的 APC，而其它种类的 APC(如单核巨噬细胞，B 细胞等)仅能刺激已活化 的或记忆性的 T 细胞，因此 DC 是机体适应性 T 细胞免疫应答的始动者，在肿瘤免疫中也 发挥着极其重要的作用。 虽然 DC 存在于体内多种组织中，但含量很少，无法满足科学研究和临床治疗的需要， 所以人们尝试多种方法来体外培养和扩增 DC。对于人，最常用的方法是从人外周血单个核 细胞(PBMC)诱导 DC 的产生。而对于小鼠，最常见的方法是从骨髓细胞诱导产生 DC，即骨 髓来源的 DC(Bone Marrow-Derived Dendritic Cells，BMDC)。 鉴于功能分析和分子生物学研究的需要，获得更高数量和更高纯度的 BMDC 是大家一 直追求的目标，本文将与大家分享 BMDC 的经典制备方法和大量制备法，大家可根据自身
1 详情请致电授权经销商——杭州联科生物技术股份有限公司 中国杭州拱墅区祥园路108号 智慧信息产业园三期3号楼13层 全国免费客服电话：400-6721-600 邮箱：service@
D
C 是“Dendritic Cells”的缩写，中文全称为“树突状细胞”，因其成熟时伸出 许多树突样或伪足样突起而得名。DC 是由 2011 年诺贝尔奖获得者、加拿大 籍科学家 Ralph M. Steinman 于 1973 年发现的[1]，是目前发现的功能最强的抗
培养步骤：
1.
1.1
小鼠骨髓细胞的获得
小鼠(6 - 10 周龄)颈椎脱臼法处死，手术取出所有股骨(femurs)和胫骨(tibias)， 并剪刀和镊子将骨周围的肌肉组织尽量去除干净；
注：不要损伤到骨。
1.2 1.3 将骨移至超净台内，并用盛有 70%酒精的无菌培养皿浸泡 2-5min，以消毒灭 菌，然后用无菌的 PBS 洗 2 次； 将骨移入另一个盛有 PBS 的新培养皿中，用剪刀剪去骨两端，再用注射器抽 取 PBS，针头分别从骨两端插入骨髓腔，反复冲洗出骨髓至培养皿中，直至 骨完全变白； 1.4 1.5 1.6 收集骨髓悬液，用 200 目尼龙网滤去小碎片和肌肉组织； 滤过液 1200 rpm 离心 5min，弃上清； 加入 2 ml 氯化铵红细胞裂解液(1x)，重悬细胞，室温孵育 3-5min，最长 10min； 氯化铵红细胞裂解液的配制： 1. 先配制10x的贮存液，配法如下： 称取82.9g NH4Cl，10.0gKHCO3和0.37g Na2EDTA，溶于1L的蒸馏 水中，0.22m滤膜过滤除菌，4oC储存6个月；
1994 年---奥地利因斯布鲁克大学(University of Innsbruck)的 Romani 等发现 GM-CSF 和 IL-4(白细胞介素 4)联合诱导，可从人血液 PBMC(外周血单个核细胞)制备出大量的 DC，而 GM-CSF 单独诱导的效果不好[4]。后来，科学家也将 IL-4 应用于小鼠 BMDC 的培养[5,6]。 1999 年----德国明斯特大学(University of Munster)的 Labeur 研究表明，单独用 GM-CSF 诱导的 BMDC 为未成熟 DC(immature DC, iDC)，GM-CSF 和 IL-4 联合诱导出来的 BMDC 的成熟度居中，添加 CD40L 或 LPS 可进一步诱导 DC 完全成熟，即成熟 DC(mature DC, mDC)[7]。 1999 年---德国埃尔朗根大学(University of Erlangen)的 Lutz 开发出一种可获得超大量 BMDC 的方法，每只小鼠可获得的 BMDC 的数量是 Inaba 经典方法的 50 倍之多，达 1-3 x 108 个 DC 细胞/小鼠[8]。该法被 DC 研究者广泛认可和使用。
摘自文献 Inaba K, et al. J Exp. Med. 1992; 176(6):1693-702 [3]
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摘自文献 Son YI, et al. J Immunol Metods. 2002; 262(1-2): 145-57 [9]
3 详情请致电授权经销商——杭州联科生物技术股份有限公司 中国杭州拱墅区祥园路108号 智慧信息产业园三期3号楼13层 全国免费客服电话：400-6721-600 邮箱：service@
2.3 每 2 天轻轻摇晃培养板，然后 3/4 体积更换新鲜培养液，并补足细胞因子。
注：1)此步骤的目的是去除粒细胞和淋巴细胞，因粒细胞和淋巴细胞为悬浮生 长； 2) Inaba 认为培养的前 4 天，大部分 DC 贴壁仍较牢，所以此法不会大量 损失 DC； 3) 若发现损失的 DC 细胞过多，可仅在培养的第 2 天用此法换液； 4) 在培养的第 4 天，可以看到聚团生长的 DC 贴附于板底，第 6 天则可 观察到很多 DC 成集落生长。
小鼠骨髓来源树突状细胞(BMDC)的培养
主要目次
【经典的 BMDC 制备方法简图】--------------------------------------------- 1 【BMDC 培养的发展简史】--------------------------------------------------- 2 【经典的 BMDC 培养法】-Inaba 法(改良) ----------------------------------4 【BMDC 大量制备法】-Son 法-------------------------------------------------6 【BMDC 大量制备法】-Lutz 法------------------------------------------------7 【注意事项】----------------------------------------------------------------------9