小鼠骨髓来源树突状细胞(BMDC)培养
小鼠骨髓源树突状细胞的体外培养及鉴定
源 的未 成 熟 和 成 熟 Ｄ Ｃ．
［ 关键词］树突状细胞 ；小 鼠；近交系 ；骨髓 细胞 ；吞 噬作用
［ 中图分类号］Ｒ ３ ２ ２ ． ２［ 文献标识码］Ａ ［ 文章编号］２ ０ ９ ５ －６ １ ０ Ｘ （ ２ ０ １ ３ ）１ １ －０ ０ ０ ５ －０ ４
Ｃｕ ｌ ｔ ｉ ｖ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ａ ｎｄ Ｉ ｄｅ ｎｔ ｉ ｉｃ ｆ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ Ｄｅ ｎｄ ｒ ｉ ｔ ｉ ｃ Ｃｅ ｌ ｌ ｓ ｆ ｒ ｏ ｍ Ｍｏ ｕｓ ｅ Ｂｏ ｎｅ Ｍａ ｒ ｒ ｏ ｗ ｉ ｎ Ｖｉ ｔ ｒ ｏ
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（ １ ）Ｂ ｉ ｏ ｍ ｅ ｄ ｉ ｃ ａ ｌ Ｒ ｅ ｓ ｅ ａ ｒ ｃ ｈ Ｃ ｅ ｎ ｔ ｅ ｒ ，Ｔ ｈ ｅ Ａ ｆ ｉｌ ｆ ｉ ａ ｔ ｅ ｄ Ｃ ｌｍ ａ ｅ ｔ ｔ ｅ Ｈｏ ｓ ｐ ｉ ｔ ｌ ａ ｏ ｆＫｕ ｎ ｍｉ ｎ ｇ Ｍｅ ｄ ｉ ｃ ａ ｌ Ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ ，Ｋｕ ｎ ｍｉ ｎ ｇ Ｙ ｕ ｎ ｎ ａ ｎ ６ ５ ０ ０ １ １ ； ２）Ｄ ｅ ｐ ｔ ． ｆＡ ｏ ｎ ｅ ｓ ｔ ｈ ｅ ｓ ｉ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ ，Ｔ ｈｅ Ｉ ｓ ｔ Ａ ｆ ｉｌ ｆ ｉ ｔ ａ ｅ ｄ Ｈｏ ｓ ｐ ｉ ｔ ａ ｌ ｆＫ ｏ ｕ ｎ ｍ ｉ ｎ ｇ Ｍｅ ｄ ｉ ｃ ａ ｌ Ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ ， Ｋｔ ｍｍｉ ｎ ｇ Ｙ ｕ ｎ ｎ ａ ｎ ６ ５ ０ ０ ３ １ ，Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ ） ［ Ａｂ ｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ］ Ｏｂ ｊ ｅ ｃ ｔ ｉ ｖ ｅ Ｔ ｏ ｅ ｓ ｔ ａ ｂ ｌ ｉ ｓ ｈ ａ ｍｅ ｔ ｈ ｏ ｄ ｏ ｆ ｃ ｕ ｌ ｔ ｉ ｖ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ ｄ ｅ ｎ ｄ ｒ ｉ ｔ ｉ ｃ ｃ ｅ ｌ ｌ ｓ（ ＤＣ ） ｆ ｒ ｏ ｍ ｍｏ ｕ ｓ ｅ ｂ ｏ ｎ ｅ ｍ ａ ｒ ｒ ｏ ｗ
小鼠树突状细胞(DC)培养
8．加入树突细胞培养液重悬细胞，调整细胞数至1×106/ml(Scepter自动细胞计数器,美国Millipore公司)，按2ml/孔接种至12孔细胞培养板（4.5cm2/孔），置37℃、5%CO2孵箱培养。
9．于培养第3，5天每孔分别更换2ml树突细胞培养液。第6天收集悬浮细胞，流式抗体染色后，流式细胞仪检测树突状细胞的表型。
1.4.4 红细胞裂解液pH7.2（1L）：
NH4CL 8.56g
Tris碱 2.059g
MilliQ水定容至1L 调节pH至7.2
1．处死BALB/c小鼠并浸泡于75%医用酒精10min，随后取小鼠股骨及胫骨并用眼科剪剔除附着在骨骼上的肌肉。
2．剪掉两侧股骨头，将吸满PBS缓冲液的注射器针头插入骨腔中，并缓慢推动注射器冲洗骨髓腔，直至骨变白。
3．将收集到的骨髓细胞悬液500×g离心5mim，弃上清。
4．向骨髓细胞沉淀中加入红细胞裂解液并反复吹打混匀，置37℃孵箱孵，吸弃上清。用PBS重悬细胞沉淀，200钼铜网过滤除去骨髓细胞悬液中组织碎块。
6．用1ml PBS缓冲液重悬细胞，加入功能纯化抗体抗-小鼠CD4/CD8a/ MHC-Ⅱ/CD45R及兔血清补体，37℃孵育1h，以去除T淋巴细胞、B淋巴细胞及MHC-Ⅱ+细胞。(功能纯化抗体抗-小鼠 CD4(L3T4)、CD8a(Ly-2)、CD45R(B220)、MHC-Ⅱ（I-A/I-E）抗体购自eBioscience公司)
bmdc培养方法
bmdc培养方法BMDC培养方法是一种常用的小鼠树突状细胞(Dendritic Cell, DC)培养方法，主要用于研究DC的功能和调控机制。
以下是关于BMDC 培养方法的详细介绍：1. 实验材料准备：小鼠骨髓细胞RPMI-1640培养基小鼠GM-CSF(粒细胞巨噬细胞集落刺激因子)和IL-4(白细胞介素-4)无菌培养箱、离心机、显微镜等实验设备2. BMDC的获取：从小鼠的股骨和胫骨中提取骨髓细胞，用RPMI-1640培养基洗涤并悬浮。
将骨髓细胞以1×10^6/mL的密度接种到无菌的培养瓶中，加入GM-CSF和IL-4，使其终浓度分别为50ng/mL和20ng/mL。
将培养瓶置于37℃，5%CO2的培养箱中，每两天更换一次培养基。
3. BMDC的成熟：在BMDC培养的第5天，用GM-CSF和IL-4继续诱导BMDC的成熟。
此时，GM-CSF的浓度可以降低至25ng/mL，而IL-4的浓度可以维持在20ng/mL。
在BMDC培养的第7天，观察BMDC的形态变化，成熟的BMDC 呈树突状，表面有丰富的毛刺状突起。
此时，可以收集成熟的BMDC 进行后续实验。
4. BMDC的功能检测：将成熟的BMDC与抗原提呈细胞(如B细胞、T细胞等)共培养，观察BMDC对抗原提呈细胞的激活作用。
将成熟的BMDC与特异性抗体结合，观察BMDC对抗原的识别和摄取能力。
将成熟的BMDC与免疫细胞(如T细胞、NK细胞等)共培养，观察BMDC对免疫细胞的调节作用。
5. BMDC的应用：用于研究DC的功能和调控机制，如DC的抗原提呈、共刺激信号传导、凋亡抑制等。
用于制备疫苗，通过激活T细胞和B细胞，提高机体对病原体的免疫力。
用于研究免疫耐受、自身免疫性疾病等疾病模型。
总之，BMDC培养方法是一种常用的小鼠树突状细胞培养方法，通过诱导骨髓细胞分化为成熟的树突状细胞，可以用于研究DC的功能和调控机制，以及制备疫苗等应用。
一种小鼠骨髓来源树突状细胞的培养方法
专利名称：一种小鼠骨髓来源树突状细胞的培养方法专利类型：发明专利
发明人：国林沛,解晖,杨宪法,王准,彭双鹤,唐慧琴
申请号：CN202111468217.1
申请日：20211203
公开号：CN114058585A
公开日：
20220218
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明涉及细胞培养领域，特别是小鼠骨髓来源树突状细胞(BMDC)的原代培养。
该细胞培养步骤，包括：步骤A：获取小鼠完整的股骨；步骤B：获取股骨中的骨髓干细胞；步骤C：将骨髓干细胞接种于细胞培养板中，并加入细胞因子，刺激分化为树突状细胞。
本发明提供了一种经济高效的培养小鼠骨髓来源树突状细胞的方法，数十分钟即可获得大量的骨髓干细胞，加入少量的细胞因子培养6‑8天即可获得2×107以上成熟的树突状细胞。
申请人：无锡市第二人民医院
地址：214001 江苏省无锡市梁溪区中山路68号
国籍：CN
代理机构：天津佳盟知识产权代理有限公司
代理人：林玉慧
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小鼠骨髓来源树突状细胞（BMDC）培养
小鼠骨髓来源树突状细胞（BMDC）培养小鼠骨髓来源树突状细胞（BMDC）的培养1、取骨髓，对倍稀释2、用滴管沿管壁缓慢加入淋巴细胞分离液(45度角倾斜，尽量产生气泡，起到缓冲作用)3、2000转，离心30分钟4、吸取白膜层，（沿管壁）交替多次吸取，加入5倍体积以上的PBS液5、1500转，离心15分钟（洗掉血小板）6、弃掉上清，留少许回流液，轻弹管壁，加入PBS液至50ml7、800转，离心10分钟，（洗掉红细胞）8、重复两至三次9、加入PBS液至50ml，计数:？个细胞离心后铺板，1X1076孔板培养液，共铺20板。
无血清1640+DNA酶12h后轻晃培养液，洗板后加入完全培养基和GM—CSF(1000U/ml)和IL—4(500U/lml) 10、第三天每孔补加等体积的完全培养基和GM—CSF(1000U/ml)和IL—4(500U/lml) ，这时细胞部分悬浮11、第五天为imDC，+1LPS(1ug/ml),诱导至第七天，为mDC。
参考Inaba等人的方法，并根据本实验室的经验稍作改进。
即：1. 颈椎脱位法处死C57BL/6小鼠，无菌状态下取股骨和胫骨，浸泡在RPMI-1640培养基中。
2. 用1ml注射器吸取RPMI-1640培养液，从骨干的一端刺入骨髓腔，将骨髓冲洗到一无菌培养皿中，每根骨头反复4～6遍，收集培养皿中的骨髓细胞悬液，离心，1500 rpm×10min。
3. 弃去上清，加入5 ml无菌Tris-NH4Cl溶液悬浮细胞溶解红细胞，于室温下静置2分钟溶解红细胞后，再次离心，1500 rpm×5min，弃上清。
4. 用RPMI-1640培养液洗涤后将细胞用完全培养基悬浮，分至6孔培养板中，并在每孔中加入完全培养基至4 ml，再加入rmGM-CSF 至终浓度10 ng/ml，IL-4终浓度10ng/ml。
5. 将细胞培养板放入37℃，含5% CO2的孵箱中培养48小时。
小鼠骨髓及脾脏来源的树突状细胞培养及鉴定
Ｃ Ｆ 和 白细 胞 介 素 （Ｌ ４ 协 同 诱 导 下 培 养 ， Ｓ） Ｉ－ ） 光镜 下 观 察 Ｄ 的 形 态 ， 式 细 胞 仪 检 测 Ｃ ８ 、 Ｄ ６表 达 水 平 。结 果 Ｃ 流 Ｄ ０Ｃ ８ 骨髓 细 胞 体 外 诱 导 培 养 ３天 后 ， 镜 下 显 示 细 胞 表 面 不 规 则 ， 树 突 状 突 起 ， 光 呈 可见 典 型 的 树 突 状 细 胞 形 态 ， 表 达 共 刺 低 激分 子 （ Ｄ ０Ｃ ８ ） Ｃ ８ ， Ｄ ６ 。结 论 与 脾 脏 细 胞 相 比 ， 髓 细 胞 中不 仅 富 含 大 量 的 ＤＣ的 前 体 细 胞 而 且 诱 导 成 ＤＣ时 间 短 。 骨 关 键 词 ： 突状 细 胞 ； 髓 ； 脏 ； 树 骨 脾
ｄ ｔ ｃ ｅ ｗｉｈ ｆｏ ｅｅ ｔｄ ｔ ｌ ｗ ｃ ｔ ｙ ｏｍｅ ｒ ｔ ｙ．Ｒｅ ｕ ｔ ｂｏ ｍ ａ ｒ ｓ ｌｓ ｎｅ ｒｏｗ ｃ ｌｓ ｐｐ ａ ｅ ｉｒ ｇｕｌｒ ａ ｏｒ ｅ ｎ ｉｉ ｐｒ ｅ ｓ ｓ ａ ｔ ｒ ｅ ｌ ａ ｅ ｒ ｄ ｒ ｅ ａ ｎｄ ｆ ｍ ｄ ｄｅ ｄｒｔｃ ｏｃ ｓ ｅ ｆｅ ３
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bmdc细胞提取步骤
bmdc细胞提取步骤BMDC（骨髓源性树突状细胞）的提取步骤通常包括以下几个步骤：1.准备工作：a.高效细胞培养基：根据实验要求选择适合的培养基，常见的包括RPMI-1640培养基、DMEM等。
b.包含20%胎牛血清（FBS）的细胞培养基。
c.手术器械：包括手术刀、剪刀、镊子和注射器等。
d.消化酶：常用的有胰蛋白酶和胶原酶等。
e.细胞培养条件：包括恒温恒湿的细胞培养箱以及含5%CO2的细胞培养箱。
2.动物准备：a.选择符合实验要求的动物（常用小鼠）。
b.按照实验室动物管理规定进行麻醉和安乐死操作。
c.用70%乙醇对动物表面进行消毒。
3.BMDC提取：a.彻底消毒动物表面后，在操作实验纸上将动物放置在耳板的背面。
b.使用消毒的剪刀和镊子，从动物的骨髓中提取骨骼。
c.将提取的骨骼置于含有培养基的试管中，并用注射器吸入10mL的培养基，将髓腔彻底清洁。
d.将清洗后的骨骼放在含有培养基的培养皿中，在恒温恒湿的培养箱中孵育24小时。
4.BMDC筛选和分离：a.24小时后，将培养皿中的骨骼取出，用胰蛋白酶和胶原酶进行胶原酶消化处理。
b.消化结束后，用细胞培养基将胶原酶停止消化，并通过筛选筛除未消化的骨骼颗粒。
c.将筛选后的纯化细胞放入含有培养基的96孔培养板中，每孔种植一定数量的细胞。
d.将种植后的培养板放入恒温恒湿的培养箱中进行细胞培养和观察。
5.细胞培养和扩增：a.用培养基进行细胞培养，每2-3天更换一次培养基。
b.确保培养皿内有适当的氧气和营养物质。
c.观察细胞的生长情况，密度达到一定程度后，用胰蛋白酶进行细胞裂解。
d.细胞数目达到要求后，用所需的方式进行实验或培养。
BMDC的提取过程需要严格的操作和分离步骤，确保获取纯化的树突状细胞，这对进一步的实验研究是非常重要的。
小鼠骨髓源性树突状细胞培养与冻存
中国组织工程研究与临床康复第14卷第45期 2010–11–05出版Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research November 5, 2010 Vol.14, No.45 ISSN 1673-8225 CN 21-1539/R CODEN: ZLKHAH8455 Department ofUrinary Surgery, Renmin Hospital of Wuhan University, Wuhan 430060, Hubei Province,ChinaZhu Guo-hui★, Studying for master’s degree, Departmentof Urinary Surgery, Renmin Hospital of Wuhan University, Wuhan 430060, Hubei Province,Chinadrzhugh@hotmail.com Correspondence to:Liu Xiu-heng, Professor, Chief physician, Doctoral supervisor, Department ofUrinary Surgery, Renmin Hospital of Wuhan University, Wuhan 430060, Hubei Province,Chinadrliuxh@Supported by: the National Natural Science Foundationof China, No. 30672107*Received: 2010-05-01 Accepted: 2010-06-30小鼠骨髓源性树突状细胞培养与冻存*★朱国辉，翁小东，刘修恒，匡幼林Culture and cryopreservation of mouse bone marrow-derived dendritic cellsZhu Guo-hui, Weng Xiao-dong, Liu Xiu-heng, Kuang You-linAbstractBACKGROUND: Dendritic cell is an ideal carrier of tumor antigen due to the presenting function and the promotion of T cell proliferation. How to obtain large numbers of dendritic cells is important for producing tumor vaccine.OBJECTIVE: To induce, culture, amplify and cryopreserve dendritic cells derived from mouse bone marrow, then compare the biological characters of cryopreserved dendritic cells with the fresh dendritic cells, than find an effective method to obtain and store large numbers of dendritic cells.METHODS: Dendritic cells from mouse bone marrow cells were induced, cultured and amplified in complete medium with recombinant mouse granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (rmGM-CSF) (10 μg/L) and recombinant mouse interleukin 4 (rmIL-4) (5 μg/L). On day 6, the dendritic cells were frozen in complete medium with dimethyl sulphoxide. After thawing, lipopolysaccharide was added to induce the maturation. At last, large number of mature dendritic cells was obtained. Then the viability, morphology, dendritic cells markers and mixed lymphocyte reaction were compared between the thawed cells and fresh cells.RESULTS AND CONCLUSION: After thawing, the recovery rate of cells was (82.2±4.73)%. The survival cells became mature dendritic cells induced by lipopolysaccharide. Compared with fresh dendritic cells, there was no significant difference in morphology, dendritic cells markers and mixed lymphocyte reaction. Results suggest that there was no significant difference in biological characters between frozen-thawed dendritic cells and fresh dendritic cells. To store dendritic cells through cryopreservation can avoid repeating culture in different times and can obtain large numbers of dendritic cells.Zhu GH, Weng XD, Liu XH, Kuang YL.Culture and cryopreservation of mouse bone marrow-derived dendritic cells.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu. 2010;14(45): 8455-8459. [ ]摘要背景：树突状细胞因其良好的抗原提呈功能及促T细胞增殖功能，成为肿瘤抗原的良好载体。
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小鼠骨髓来源树突状细胞（BMDC）的培养
1、取骨髓，对倍稀释
2、用滴管沿管壁缓慢加入淋巴细胞分离液(45度角倾斜，尽量产生气泡，起到缓冲作用)
3、2000转，离心30分钟
4、吸取白膜层，（沿管壁）交替多次吸取，加入5倍体积以上的PBS液
5、1500转，离心15分钟（洗掉血小板）
6、弃掉上清，留少许回流液，轻弹管壁，加入PBS液至50ml
7、800转，离心10分钟，（洗掉红细胞）
8、重复两至三次
9、加入PBS液至50ml，计数:？个细胞
离心后铺板，1X1076孔板培养液，共铺20板。
无血清1640+DNA酶12h后轻晃培养液，洗板后加入完全培养基和GM—CSF(1000U/ml)和IL—4(500U/lml) 10、第三天每孔补加等体积的完全培养基和GM—CSF(1000U/ml)和IL—
4(500U/lml) ，这时细胞部分悬浮
11、第五天为imDC，+1LPS(1ug/ml),诱导至第七天，为mDC。
参考Inaba等人的方法，并根据本实验室的经验稍作改进。
即：
1. 颈椎脱位法处死C57BL/6小鼠，无菌状态下取股骨和胫骨，浸泡在RPMI-1640培养基中。
2. 用1ml注射器吸取RPMI-1640培养液，从骨干的一端刺入骨髓腔，将骨髓冲洗到一无菌培养皿中，每根骨头反复4～6遍，收集培养皿中的骨髓细胞悬液，离心，1500 rpm×10min。
3. 弃去上清，加入5 ml无菌Tris-NH4Cl溶液悬浮细胞溶解红细胞，于室温下静置2分钟溶解红细胞后，再次离心，1500 rpm×5min，弃上清。
4. 用RPMI-1640培养液洗涤后将细胞用完全培养基悬浮，分至6孔培养板中，并在每孔中加入完全培养基至4 ml，再加入rmGM-CSF至终浓度
10 ng/ml，IL-4终浓度10ng/ml。
5. 将细胞培养板放入37℃，含5% CO2的孵箱中培养48小时。
6. 轻轻吹打细胞后，连同培养液一起吸去悬浮细胞，仅保留贴壁细胞。
7. 加入新鲜的完全培养基及相同浓度的rmGM-CSF，继续培养至第5天。
8. 半量换液，并补足rmGM-CSF；尽量保留悬浮细胞。
9. 继续培养至第7天，用吸管轻轻吹打后收集所有悬浮细胞，即为富集的小鼠骨髓来源的树突状细胞(Bone marrow-
derived dendritic cell, BMDC)。
经鉴定，此时BMDC的纯度可达80%以上。
楼上的cherry_28提供的好像是外周血DC的培养方法。
我本人没有培养外周血DC的经验，但培养了2年半的小鼠骨髓DC，有稍许体会。
其中体会最深的是：强烈反对初次铺板不到24小时就去除悬浮细胞的做法，我接触的网友中用贴壁时间<48小时而养不出DC不少于15位，而延长贴壁时间就可以大大提供集落形成率。
下面是我用上述方法培养的小鼠DC，供朋友们共同讨论。