课件-transfection
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《conversation》ppt课件
1. What is the chart used for ? 2. Who prescribes IV infusions?
3. How many nurses check the IV infusion?
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Listen to 2.4 and complete the following extracts from the conversation using the words in the box Check, finished, IV Prescription, rate, run, sign, through
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Helena and Mylene continue discussing Mr Lenworth’s IV. Listen to 2.5 and answer the following questions.
1. What does Mylene ask Helena? 2. Which IV solution are they checking? 3. When will the nurses put up the next IV infusion?
• Mr Brodzik’s knee hurts. • Rachel is going to get Mr Brodzik some pain relief • The dressing is comfortable. • The IV cannula feels OK. • Rachel gets Mr Brodzik a pillow.
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Complete the following sentences about Recovery using the words and phrases in the box
3. How many nurses check the IV infusion?
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Helena and Mylene continue discussing Mr Lenworth’s IV. Listen to 2.5 and answer the following questions.
1. What does Mylene ask Helena? 2. Which IV solution are they checking? 3. When will the nurses put up the next IV infusion?
• Mr Brodzik’s knee hurts. • Rachel is going to get Mr Brodzik some pain relief • The dressing is comfortable. • The IV cannula feels OK. • Rachel gets Mr Brodzik a pillow.
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重组DNA技术ppt课件
HindⅡ
GTCGAC CAGCTG
GTC CAG
+
GAC CTG
平端切口
Bam HⅠ
GGATCC CCTAGG
GCCTAG+
GATCC G
粘端切口
DNA连接酶
①作用: 把切下来的DNA片段拼接成新的DNA，
即将脱氧核糖和磷酸连接起来.
②作用原理：
催化磷酸二酯键形成
③类型：
类型
来源
相同点
功能 差别
E·coliDNA连接酶 大肠杆菌 恢复 只能连接黏性末端
磷酸
T4DNA连接酶
T4噬菌体 二酯键
能连接黏性末端和 平末端(效率较低)
重组DNA技术中常用的工具酶
工具酶
功
能
限制性核酸内切酶 识别特异序列，切割DNA
DNA连接酶
催化DNA中相邻的5´磷酸基和3´羟基末端之间形成磷酸 二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接
目的 ① 分离获得某一感兴趣的基因或DNA ② 获得感兴趣基因的表达产物〔蛋白质）
（二〕工具酶
❖ 限制性核酸内切酶 ❖ DNA聚合酶Ⅰ ❖ 逆转录酶 ❖ T4DNA连接酶 ❖ 碱性磷酸酶 ❖ 末端转移酶 ❖ Taq DNA聚合酶
限制性核酸内切酶
定义 限制性核酸内切酶(restriction endonuclease, RE)是识别DNA的特异序列, 并在识别位点或其周 围切割双链DNA的一类内切酶。
DNA聚合酶Ⅰ
Klenow片段 反转录酶
多聚核苷酸激酶
① 合成双链cDNA分子或片段连接 ② 缺口平移制作高比活探针 ③ DNA序列分析 ④ 填补3´末端
又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53 聚合、35外切活性，而无53外切活性。常用于 cDNA第二链合成，双链DNA 3末端标记等
5 物质跨膜运输 细胞生物学PPT课件
主动运输（active transport）：物质逆浓度梯度
进出细胞，而且需要载体、消耗ATP。
1 被动运输
细胞膜是选择性半透膜
1.1 简单扩散（simple diffusion）
1. 概念：指物质顺浓度梯度从高浓度一侧通过细 胞膜向低浓度一侧移动的方式，不需消耗ATP， 又称被动扩散（passive diffusion）。 。
1.2.2 载体蛋白介导的协助扩散
1.协助扩散（facilitated diffusion）：
各种极性分子和无机离子通过膜转运蛋白 顺浓度 梯度 的跨膜转运过程。
2. 运输对象：葡萄糖、氨基酸及细胞代谢物
3. 特点：
①不消耗代谢能
②需要载体蛋白的协助
③具有特异性
④具有饱和性
⑤可被竞争性阻断剂阻断
易化扩散
离子通道的类型
⑴ 配体闸门通道(ligand-gated channels）乙酰胆碱受体。 ⑵ 电压闸门通道(voltage-gated channels) 主要存在于可兴奋细胞，如神经元、肌细胞等。 （3）应力激活通道（stress-activated channel)如内耳毛细胞感受
声波震动。
第五章 物质的跨膜运输
2010-09-10
内容提要
1. 被动运输
简单扩散 协助扩散
2. 主动运输
ATP直接供能 ATP间接供能 Байду номын сангаас能驱动
3. 胞吞与胞吐
物质跨膜转运的主要方式：
被动运输（passive transport）：物质顺浓度梯度
进出细胞，不需要消耗ATP。
─ 简单扩散 ─协助扩散（易化扩散）
2 主动运输
概念：由载体蛋白介导的物质逆浓度梯度或化学 梯度进行跨膜转运的方式，消耗ATP。
进出细胞，而且需要载体、消耗ATP。
1 被动运输
细胞膜是选择性半透膜
1.1 简单扩散（simple diffusion）
1. 概念：指物质顺浓度梯度从高浓度一侧通过细 胞膜向低浓度一侧移动的方式，不需消耗ATP， 又称被动扩散（passive diffusion）。 。
1.2.2 载体蛋白介导的协助扩散
1.协助扩散（facilitated diffusion）：
各种极性分子和无机离子通过膜转运蛋白 顺浓度 梯度 的跨膜转运过程。
2. 运输对象：葡萄糖、氨基酸及细胞代谢物
3. 特点：
①不消耗代谢能
②需要载体蛋白的协助
③具有特异性
④具有饱和性
⑤可被竞争性阻断剂阻断
易化扩散
离子通道的类型
⑴ 配体闸门通道(ligand-gated channels）乙酰胆碱受体。 ⑵ 电压闸门通道(voltage-gated channels) 主要存在于可兴奋细胞，如神经元、肌细胞等。 （3）应力激活通道（stress-activated channel)如内耳毛细胞感受
声波震动。
第五章 物质的跨膜运输
2010-09-10
内容提要
1. 被动运输
简单扩散 协助扩散
2. 主动运输
ATP直接供能 ATP间接供能 Байду номын сангаас能驱动
3. 胞吞与胞吐
物质跨膜转运的主要方式：
被动运输（passive transport）：物质顺浓度梯度
进出细胞，不需要消耗ATP。
─ 简单扩散 ─协助扩散（易化扩散）
2 主动运输
概念：由载体蛋白介导的物质逆浓度梯度或化学 梯度进行跨膜转运的方式，消耗ATP。
基因克隆简介ppt课件
5’3’-
5’3’-
GAATTC CTTAAG
G AATTC CTTAA G
-3’ -5’
-3’ -5’
14
（4）粘性末端的意义 ①连接便利
i）不同的DNA双链： 只要粘性末端碱基互补就可以连接。 这比连接两个平齐末端容易的多。
ii）同一个DNA分子内连接： 通过两个相同的粘性末端可以连接成环 形分子。
pBR322质粒
pBR322质粒是由三个不同来源的部分组成的：第 一部分来源于pSF2124质粒的氨苄青霉素抗性基 因（ampr）；
第二部分来源于pSC101质粒的四环素抗性基因 （tetr）；
第三部分则来源于ColE1的派生质粒pMB1的DNA
复制起点（ori）。
27
PstI
ScaI
Ampr
HindIII BamHI
④ lacZ的a肽互补 1）a-肽（ lacZ’ ）：
b-半乳糖苷酶N端的一段氨基酸片断 （11-41氨基酸），该段基因序列连接到 pUC载体上。
受体菌基因组的b-半乳糖苷酶基因的 缺失a肽（氨基端有缺失），不能形成 活性酶，不能分解Xgal
37
⑤ 载体lacZ’与a互补
pUC质粒载体上的lacZ’ 编码a肽与这个 缺失突变的b-半乳糖苷酶“互补”，又 能分解Xgal。产生蓝色物质。
15
16
2. DNA 连接酶 3.1 DNA连接酶（ligase)的发现
从细菌DNA环化现象推测，必定存在一种能 把两条DNA双链连接到一起的酶。
DNA复制一定有断口。 17
3.2 DNA ligase的特点
1. 两种DNA连接酶
（1）大肠杆菌连接酶 只能连接粘性末端。
（2）T4噬菌体的连接酶 不但能连接粘性末端， 还能连接齐平末端。
Unit10TheTransaction综合教程三 ppt课件
Audiovisual Supplement Cultural Information
2020/12/12
5
Audiovisual Supplement Cultural Information
From Dead Poetห้องสมุดไป่ตู้ Society
Mr. Keating: Go on. Rip it out. Thank you Mr. Dalton. Gentlemen, tell you what, don’t just tear out that page, tear out the entire introduction. I want it gone, history. Leave nothing of it. Rip it out. Rip! Begone J. Evans Pritchard, Ph.D. Rip. Shred. Tear. Rip it out! I want to hear nothing but ripping of Mr. Pritchard. We’ll perforate it, put it on a roll. It’s not the Bible. You’re not going to go to hell for this. Go on. Make a clean tear. I want nothing left of it. Cameron: We shouldn’t be doing this. Neil: Rip! Rip! Rip! Mr. Keating: Rip it out! Rip! McAllister: What the hell is going on here? Mr. Keating: I don’t hear enough rips.
语法翻译法-直接法-听说法PPT演示课件
6
(4)Exemplifcedures for a typical lesson with the Grammar-translation Method can be divided into three phases.
① Phase One : Read and explain the new words and expressions in the first language . Teach the new grammar with deductive method.
The Grammar-translation Method
• Background there is evidence that grammar analysis and
translation began to be the basic procedures in foreign language teaching from the 16th century.
1
(2)the second impetus for the procedures of grammar analysis and translation in teaching Latin came from the social needs of European countries. (3)in the 19th century, more experts of foreign languages teaching adopted the strategy of combining grammar rules with translation.
② Phase Two :reading/translation/analysis/ask questions
(4)Exemplifcedures for a typical lesson with the Grammar-translation Method can be divided into three phases.
① Phase One : Read and explain the new words and expressions in the first language . Teach the new grammar with deductive method.
The Grammar-translation Method
• Background there is evidence that grammar analysis and
translation began to be the basic procedures in foreign language teaching from the 16th century.
1
(2)the second impetus for the procedures of grammar analysis and translation in teaching Latin came from the social needs of European countries. (3)in the 19th century, more experts of foreign languages teaching adopted the strategy of combining grammar rules with translation.
② Phase Two :reading/translation/analysis/ask questions
重组DNA导入受体细胞课件.ppt
显微注射分为 （1）真正的显微注射(true microinjection)法
DNA是由注射针直接注入细胞
（2）“穿刺”(pricking)导入法 DNA是处在细胞周围培养基中，它通过穿刺形
成的小孔进入细胞的内部，或是随穿刺的针头一道进 入的。
用显微注射法转移基因的效率明显地超出其它方 法。显微注射用的受体细胞，多数是沿培养皿贴壁生 长的单层细胞。
c. 具有较高的转化效率 d. 具有与重组体互补的遗传性状 e. 感染与寄生缺陷型 安全角度的要求。
二）大肠杆菌感受态的制备与转化
感受态细胞(Competent cells): 受体 细胞经过一些特殊方法的处理后，细胞 膜的通透性发生变化，成为能容许有外 源DNA的载体分子通过的感受态细胞 (competent cells) 。
转化过程中，这些分子同时被转 移到宿主细胞内。
未连接的分子即使被细菌摄取，只 有在特殊的条件下才能复制，寄主的 酶可降解这些DNA片段。
自连的载体和错误插入的重组质 粒可以进入宿主细胞进行正常的复制
一、转化方法
自然界中，转化并不是细菌遗传信 息传递的主要方式，实验室中只有小部 分的细菌可以很容易的转化。
F质粒转移的不同结果
二、phage DNA的转化
两种方法可以将噬菌体DNA转入细菌： 1） 转染（transfection）：是将纯化
的噬菌体DNA通过热激的方法转化感受态 大肠杆菌的过程。
2） 体外装配（in vitro packaging）： λ DNA的转染效率不高，如果将重组的λ分 子装配成头-尾结构的病毒粒子，将极大的 提高效率。
转化方法 Ca 诱 导
原生质体转化 噬菌体转化 电穿孔法 接合转化
转化效率 107-8 105-6 107-8
《转换生成语法》PPT课件
性来对说话者的语感和语言能力做出解释,那么它就满足
了描写的充分性这一要求〔描写出反映观察充分性的语
法是怎样生成各种语言现象的〕.
• 解释的充分性
• 如果语法描写以某种把语言学上普遍现象具体化,同时建
立语言习得理论的语言理论为依据,那么,这样的描写就涉
及到了最为复杂的解释的充分性问题.这样一种语言理论
例外均不自觉地遵从.
乔氏举儿童学习陈述句转换为疑问句的例子：
The man is tall → is the man tall?
转换似乎是分析到词,找到第一次出现的"is",
将其置于句首.乔氏又举下例：
The man who is tall is in the room.
*Is the man who ta1l is in the room？
• 针对经验主义白版论假说,主张天赋语言观.
• 针对行为主义,反对语言为刺激造成的一套习惯
的观点,反对学习论.认为：
• 人的遗传生物属性具有认知结构,其语法系统自
行发展能力和自行发展的机制,这种先天能力和
机制,为人类共有.
• 先天语言能力和自行发展机制在环境诱导下发
展,这一过程是语言习得过程.〔即语言习得离不
• 诺姆•乔姆斯基受到严格的实证主义语言
学传统的训练,即"后布龙菲尔德结构主
义"的训练. "后布龙菲尔德结构主义"统
领着20世纪40－50年代的美国语言学,乔
姆 斯 基 的 老 师 齐 里 格 • 哈 里 斯 <Zellig
Harris>就是其中最著名的代表成员.
• "后布龙菲尔德结构主义"的目标很明确,
了描写的充分性这一要求〔描写出反映观察充分性的语
法是怎样生成各种语言现象的〕.
• 解释的充分性
• 如果语法描写以某种把语言学上普遍现象具体化,同时建
立语言习得理论的语言理论为依据,那么,这样的描写就涉
及到了最为复杂的解释的充分性问题.这样一种语言理论
例外均不自觉地遵从.
乔氏举儿童学习陈述句转换为疑问句的例子：
The man is tall → is the man tall?
转换似乎是分析到词,找到第一次出现的"is",
将其置于句首.乔氏又举下例：
The man who is tall is in the room.
*Is the man who ta1l is in the room？
• 针对经验主义白版论假说,主张天赋语言观.
• 针对行为主义,反对语言为刺激造成的一套习惯
的观点,反对学习论.认为：
• 人的遗传生物属性具有认知结构,其语法系统自
行发展能力和自行发展的机制,这种先天能力和
机制,为人类共有.
• 先天语言能力和自行发展机制在环境诱导下发
展,这一过程是语言习得过程.〔即语言习得离不
• 诺姆•乔姆斯基受到严格的实证主义语言
学传统的训练,即"后布龙菲尔德结构主
义"的训练. "后布龙菲尔德结构主义"统
领着20世纪40－50年代的美国语言学,乔
姆 斯 基 的 老 师 齐 里 格 • 哈 里 斯 <Zellig
Harris>就是其中最著名的代表成员.
• "后布龙菲尔德结构主义"的目标很明确,
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包装成分
由HIV-1基因组去除了包装、逆转录和整合所 需的顺式作用序列而构建，能够反式提供产生病 毒颗粒所必需的蛋白。包装成分通常被分开构建 到两个质粒上，一个质粒表达Gag和Pol蛋白，另 一个质粒表达Env蛋白，其目的也是降低恢复成 野生型病毒的可能。将包装成分与载体成分的3个 质粒共转染细胞(如人肾293T细胞)，即可在细胞 上清中收获只有一次性感染能力而无复制能力的、 携带目的基因的HIV-1载体颗粒。
基因转移技术已广泛用于基因的结构和
功能分析、基因表达与调控、基因治疗 与转基因动物等研究。
化学方法 磷 酸 钙 法 脂 质 体 法
D E A E 葡 聚 糖 法
物理方法 电 穿 孔 法
显 微 注 射 法
DNA 病毒
逆转录病毒
基 因 枪 法
慢病毒
1.磷酸钙共沉淀法
将氯化钙、DNA和磷酸盐缓冲 液混合，形成磷酸钙微沉淀 ，附 着于细胞膜并经过细胞内吞作用进 入细胞质。该方法的转染效率通常 很低。
细胞克隆 个体克隆（动物或植物）
重组DNA技术相关概念
DNA克隆
应用酶学方法，在体外将各种来源的遗传物质 （同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或 人工合成的DNA）与载体DNA接合成一具有自我复 制能力的DNA分子—复制子（replicon）,继而通 过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的 转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA 分子，也称基因扩增或重组DNA。
电脉冲和场强的优化对于成功的转染很重要。
在高压电场的作用下，细胞膜发生临时性破裂形成微孔 微孔的关闭：一种天然衰减的过程，在0℃下，这种过程会被延缓进 行。 电穿孔之前若用秋水仙酞胺(colcemid)预处理细胞10小时，可提高 转化效率3～10倍。 电穿孔转染效率主要取决于所用的细胞类型。主要针对不适毒载体
优点： 对于一些较难转染的细胞，如原 代细胞、干细胞、不分化的细胞 等，能大大提高目的基因转导效 率，而且目的基因整合到宿主细 胞基因组的几率大大增加，这就 为 RNAi，cDNA 克隆以及报告基 因的研究提供了一个有利的途径; 进行稳转细胞株的筛选； 为活体动物模型实验提供高质量 的包含目的基因的病毒液。
影响因素：
DNA-磷酸钙共沉淀物中DNA的数量 共沉淀物与细胞接触的保温时间 甘油或DMSO等促进因子作用的持续时间 等。 一般说来，在磷酸钙转染实验中要使用高浓度 的DNA(1～50ug/ml)。DNA磷酸钙共沉淀物 同细胞接触的最适保温时间，因细胞的类型而 异。促进因子通常是在DNA-磷酸钙共沉淀物 被细胞吸收4～8小时之后再加入。
天津心脏病学研究所 徐昭 2014-1-5
欲研究基因A在动脉粥样 硬化发生发展中的功能， 如何设计实验？
1.DNA是什么？ 2.我们这里谈的DNA重组是什么？
克隆（clone） 来自同一始祖的相同副本或拷
贝的集合。
克隆化（cloning） 获取同一拷贝的过程,即无
性繁殖。
克隆的三个层次： 分子克隆（molecular clone），即DNA克隆
2. 脂质体介导法（目前应用最广泛）
原理：阳离子脂质体试剂与DNA混 合后，形成一种稳定的脂质双层复合 物，DNA被包在脂质体中间，这种脂质 双层复合物可直接加到培养的细胞中， 脂质体粘附到细胞表面并与细胞膜融 合，DNA被释放到胞浆中。
阳离子脂质体介导的转染
电穿孔通过将细胞暴露在短暂的 高场强电脉冲中转导分子，即 利用脉 冲场将DNA导入培养细胞。
改进
包膜蛋白 采用表达水疱性口炎病毒(VSV)糖蛋白G的质粒和双嗜性 小鼠白血病病毒(MLV)包膜蛋白Env的质粒，分别取代表 达HIV本身包膜蛋白Env的质粒，使HIV-1载体颗粒包上 了VSV或双嗜性MLV的 包膜。 这样做的结果至少具有三个方面的积极意义： ①包膜的更换进一步降低了慢病毒载体恢复成野生型病毒 的可能； ②使HIV载体感染宿主的范围不再仅限于CD4+细胞，而 扩大到几乎能感染所有组织来源的细胞； ③VSV的包膜赋予慢病毒载体颗粒高度的稳定性，使其能 够通过超速离心而浓缩，达到高滴度。Naldini等已使慢 病毒载体滴度由105转录单位(TU)/ml达到108TU/ml。
成HIV毒性的因素，将其删除、加上包膜蛋白的替换，可
使制备HIV载体过程中产生野生型病毒的可能必微乎其微。
载体质粒 载体质粒上 HIV-1的顺式序列通常包括两端的 LTR 、剪切 位点及包装信号Ψ等。此外，研究表明，gag基因5′端的 序列可提高载体 RNA的包装效率； Rev蛋白需要与 Rev反 应元件(RRE)相作用，将未剪切的载体转录产物从细胞核 转运到胞浆。因此， Naldini 等在载体上保留了 gag 基因 5′端350bp的序列及位于env序列中的RRE，提高了产生 载体颗粒的能力。
包装成分 包装成分的构建应在不重组病毒的装配和感染力的前提下，
尽可能地减少无关的 HIV-1蛋白的表达，为野生型病毒的
恢复设置障碍。 Naldini 等在构建包装质粒时，阻止 env 基因的表达。在此基础上，Zufferey等将包装质粒上表达 调节蛋白 Nef 、 Vif 、 Vpr 和 Vpu 的 4 个基因分别删除或联 合删除。这4个调节蛋白或已被证实、或被高度怀疑是构
转染的过程
1、细胞的生长状态
2、细胞的密度
靶基因质粒DNA的准备
1、重组质粒的纯度OD260/OD280
2、重组质粒的浓度
转染与分析
（外源基因的表达与检测）
1、GFP的表达 2、WB
构建基因A的真核表达载 体，并使该基因在内皮细 胞中获得表达
自Gene Bank获取基因序列
设计合成ORF Primer（含酶切位点） 扩增ORF 将PCR产物与T载体连接（T-A克隆） 测序，挑选正确的T-A克隆
酶切，回收目的片段 表达载体 扩增 酶切载体，回收载体大片段
连接
转化E.coli，挑选正确重组子 转染293T细胞，包装病毒 感染target 细胞
基因A在内皮细胞中获得表达
准备DNA: 构建提质粒 线性化 准备细胞：0.5～1×107 将细胞、DNA加入电极 杯 冰上预冷（！） 设置电脉冲参数电击 常温静置 转移细胞至培养皿 24－36小时后加筛选药 物
概念：转染与感染？
4、病毒感染
逆转录病毒载体
逆转录病毒为RNA病毒，它们的基因组 编码在一条单链RNA上，病毒进入细胞 通过逆转录作用，病毒RNA即转变为双 链DNA分子，DNA进入细胞核并整合在 细胞染色体中，这种整合的病毒称为原 病毒。
载体成分 与包装成分互补，即含有包装、 逆转录和整合所需的 HIV 顺式作用序 列，同时具有异源启动子控制下的多 克隆位点及在此位点插入的目的基因。 为降低两种成分同源重组恢复成野生 型病毒的可能，需尽量减少二者的同 源性，如将包装成分上 5′LTR 换成巨 细 胞 病 毒 (CMV) 立 即 早 期 启 动 子 、 3′LTR换成SV40 polyA等。
慢病毒
慢病毒载体
慢 病 毒 载 体 （ Lentiviral vector, LVs ）是在 HIV-1 病 毒基础上改造而成的病毒载 体系统，它能高效的将目的 基因（或 RNAi ）导入动物 和人的原代细胞或细胞系。 慢病毒载体基因组是正链 RNA ，其基因组进入细胞后， 在细胞浆中被其自身携带的 反转录酶反转为 DNA ，形 成 DNA 整合前复合体，进 入细胞核后， DNA 整合到 细胞基因组中。整合后的 DNA 转录 mRNA ，回到细 胞浆中，表达目的蛋白；或 产生 RNAi 干扰。
DNA克隆的基本原理
1、目的基因的获取 2、克隆载体的选择和构建 3、外源基因与载体的连接 4、重组DNA导入宿主细胞
5、重组体的筛选
6、克隆基因的表达
基因转染:将具生物功能的核酸转移或运
送到细胞内并使核酸在细胞内维持其生 物功能。
基因转染技术：将纯化的含有靶基因的
质粒DNA送入细胞内，并在细胞内表达。