大豆花叶病毒诱导的应用于膜蛋白酵母双杂交的大豆cDNA文库构建
酵母双杂交实验流程(精)
模块七蛋白质之间的相互作用1. 实验目的本实验以重组质粒和酵母细胞为材料, 学习检测蛋白质相互作用的基本原理和技术方法。
主要介绍酵母双杂交的基本原理与操作技术; 让学生了解和掌握酵母双杂交系统的应用; 掌握酵母感受态的制备的基本原理和主要的操作步骤。
2. 实验原理1989年 Fields 和 Song 等人根据当时人们对真核生物转录起始过程调控的认识(即细胞内基因转录的起始需要转录激活因子的参与 ,提出并建立了酵母双杂交系统。
该系统作为发现和研究活细胞体内的蛋白质与蛋白质之间的相互作用的技术平台,近几年得到了广泛的运用和发展。
相比于其它蛋白质筛选系统,酵母双杂交系统具有以下优点:(1检测在真核活细胞内进行,在一定程度上代表细胞内的真实情况。
(2作用信号是在融合基因表达后,在细胞内重建转录因子的作用而给出的,省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。
(3检测结果是基因表达产物的积累效应,因而可检测存在于蛋白质之间的微弱或暂时的相互作用。
(4酵母双杂交系统可采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建cDNA 文库,能分析细胞质、细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功能蛋白。
(5 通过 mRNA 产生多种稳定的酶使信号放大。
同时,酵母表型、 X-Gal 及HIS3 蛋白表达等检测方法均很敏感。
酵母双杂交系统也具有一定的局限性。
首先, 经典的双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细胞核内, 因而限制了该系统对某些细胞外蛋白和细胞膜受体蛋白的研究。
酵母双杂交系统的另一个局限性是“假阳性” 。
在酵母双杂交系统建立的初期阶段,由于仅仅采用β-半乳糖苷酶这一单一的报告基因体系,这种报告基因的表达往往不能十分严谨地被控制,因此容易产生假阳性。
由于某些蛋白本身具有激活转录的功能或在酵母中表达时发挥转录激活作用, 使 DNA 结合结构域融合蛋白在无特异激活结构域的情况下也可被激活转录。
另外某些蛋白表面含有对多种蛋白质的低亲和力区域, 能与其他蛋白形成稳定的复合物,从而引起报告基因的表达,产生“假阳性”结果。
白背飞虱酵母双杂交cDNA文库的构建
白背飞虱酵母双杂交cDNA文库的构建薛进;李静;羊健;唐彦;梁瑶;陈剑平;张恒木【摘要】白背飞虱(Sogatella furcifera Horváth)作为一种迁飞性害虫,不仅自身危害水稻,而且以持久性方式传播南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV).为了研究白背飞虱与SRBSDV之间的相互作用,需要构建一个高质量的酵母筛选文库,试验利用Gateway技术构建了白背飞虱cDNA 酵母表达文库,检测分析显示,白背飞虱初级文库库容量约为1.72×107 CFU,cDNA 插入片段主要分布在500~2000 bp,重组率约为95.8%;次级文库库容量约为1.73×107 CFU,cDNA插入片段主要分布在400~2000 bp,重组率为100%;Y187酵母菌株的白背飞虱酵母双杂交cDNA文库库容量约5.09×107 CFU,插入片段大小在750~2000 bp,重组率100%,再随机挑选36个单克隆进行测序分析,所得结果与GenBank数据库比对显示36个克隆中含有22个不同的基因,长度在750~2000 bp,这些分析表明,该文库可以用于酵母双杂交的后续筛选,为研究白背飞虱与SRBSDV之间的互作奠定了基础.%White-backed planthopper( Sogatella furcifera Horváth) is a major migratory pest that feed on rice plants and transmit Southern rice black-streaked dwarf virus (SRBSDV) in a persistent manner.In order to screen interac-tions between the genes of WBPH and SRBSDV , a cDNA expression library of WBPH was firstly constructed into the yeast plasmids using Gateway technique in this study .The results showed that the primary library consisted of 1.72 × 107 CFU (colony-forming units), the sizes of most inserts were 500-1500 bp in length, and the recombinant fre-quency was about 95.8%;the titer of secondary cDNA library was 1.73 ×107 CFU, the sizes of most inserts were400-2000 bp in length , and the recombinant frequency was 100%; the titer assays showed that the cDNA library was approximately 5.09 ×107 CFU for yeast two-hybrid cDNA library of Y187;PCR assays showed that the average length of insertions were 750-2000 bp and the recombinant frequency of the cDNA library was high up to 100%,random sequence analysis of 36 clones showed that 22 of the clones were different in GenBank .These results consist-ently indicated that the cDNA library could be used for screening interactions in the yeast two hybrid experiments , which laid the foundation for studying on the interactions between white -backed planthopper and SRBSDV .【期刊名称】《浙江农业学报》【年(卷),期】2017(029)012【总页数】8页(P2060-2067)【关键词】白背飞虱;南方水稻黑条矮缩病毒(SRBSDV);Gateway技术;酵母双杂交;cDNA文库【作者】薛进;李静;羊健;唐彦;梁瑶;陈剑平;张恒木【作者单位】植物病虫害生物学与防控湖南省重点实验室湖南农业大学植物保护学院病毒研究所,湖南长沙410128;浙江省农业科学院病毒学与生物技术研究所,浙江杭州310021;浙江省农业科学院病毒学与生物技术研究所,浙江杭州310021;浙江省农业科学院病毒学与生物技术研究所,浙江杭州310021;植物病虫害生物学与防控湖南省重点实验室湖南农业大学植物保护学院病毒研究所,湖南长沙410128;湖南农业大学东方科技学院,湖南长沙 410128;植物病虫害生物学与防控湖南省重点实验室湖南农业大学植物保护学院病毒研究所,湖南长沙410128;浙江省农业科学院病毒学与生物技术研究所,浙江杭州310021;浙江省农业科学院病毒学与生物技术研究所,浙江杭州310021【正文语种】中文【中图分类】S435.11广泛分布在东亚地区的为害水稻的白背飞虱(Sogatella furcifera Horvth)属于半翅目(Hemiptera)同翅亚目飞虱科(Delphacidae)的迁飞性昆虫[1-3]，是最常见的3种稻飞虱之一，每年春天随大气环流方向从中南半岛、东南亚和我国的海南岛等地不断地北上迁飞，直至我国东北，其初始迁入量与每年春夏暖湿气流北上程度相关[4-5]，在南岭以北地区不能越冬。
文库构建及酵母双杂交技术
第四章基因文库构建及酵母双杂交技术1 基因组文库的构建基因组文库（genomic library）将某种生物细胞的整个基因组DNA切割成大小合适的片断，并将所有这些片断都与适当的载体连接，引入相应的宿主细胞中保存和扩增。
理论上讲，这些重组载体上带有了该生物体的全部基因，称为基因文库。
1. 1构建基因文库的载体选用载体能够容载的DNA片断大小直接影响到构建完整的基因文库所需要的重组子的数目。
第四章基因文库构建及酵母双杂交技术1.1.1对载体的要求：载体容量越大，所要求的DNA片断数目越少，所需的重组子越少。
1.1.2目前常用的载体： 载体系列（容量为24 kp ）、cosmid载体（容量为50 kb ）、YAC（容量为1 Mb ）、BAC （容量为300 kb）1.2 基因文库构建的一般步骤1.2.1染色体DNA大片段的制备：断点完全随机，片断长度合适于载体连接。
不能用一般的限制性内切酶消化法，使用物理切割法或不完全酶切法。
1.2.2载体与基因组DNA大片段的连接：直接连接、人工接头或同聚物加尾。
噬菌体载体构建基因组文库第四章基因文库构建及酵母双杂交技术2 cDNA文库的构建cDNA克隆的基本过程是通过一系列，酶酶催作用，使poly(A) mRNA转变成双链cDNA群体并插入到适当的载体分子上，转化大肠杆菌寄主细胞，构建包含所有基因编码序列的cDNA基因文库。
2.1高质量mRNA的制备应用Promega PolyAT tract mRNA Isolation System 分离Poly(A)RNA。
将Biotinylated Oligo(dT)引物与细胞总RNA共温育，加入与微磁球相连的Streptavidin，用磁场吸附与PMP相连的SA-Biotinylated Oligo(dT)-mRNA。
PolyAT tract mRNA 的分离纯化过程第四章基因文库构建及酵母双杂交技术2.2反转录成cDNA可同时在反转录系统中加入Oligo(dT)12-18-mer及随机引物R6，以保证得到全长cDNA；应选用活性较高的反转录酶(Reverse transcriptas)；应选用甲基化dCTP；应保证所获得双链cDNA 的方向性。
630490 酵母双杂交文库构建实验流程(clontech)
第一链cDNA合成1.准备: 高质量的Poly A 或总RNA2. 在微量离心管中混匀以下试剂：1–2 μl RNA 样本(0.025–1.0 μg poly A+或0.10–2.0 μg 总RNA)1.0 μl CDS III 或CDSIII/6 引物1–2 μl 去离子水(补齐体系到4.0 μl)4.0 μl 总体积注意: 对照实验时，请使用1μl *1μg+ 的对照RNA。
CDSIII = Oligo-dT；引物CDSIII/6 =随机引物3. 72°C ，孵育2 min。
4. 冰上冷却2 min，然后14000rpm，10sec，瞬时离心。
5. 混合以下试剂，将混合液加入Step4中的经过变性且结合有引物的RNA样本中，轻拍混匀。
2.0 μl 5X First-Strand 缓冲液1.0 μl DTT (100 mM)1.0 μl dNTP 混合物(10 mM )1.0 μl SMART MMLV 反转录酶6. 只有使用随机引物(CDSIII/6)实验才进行此步骤[如果采用Oligo-dT(CDSIII)请忽略此步骤，直接进行Step7]，25°C，室温孵育10 min。
7. 42°，孵育10 min。
注意: 孵育在热盖的PCR仪中进行。
若用非热盖的PCR仪或水浴，请在反应管中加入一滴矿物油来避免水分蒸发。
8. 加入1 μl SMART III-modified oligo，混匀，42°C，孵育1 hr。
9. 75°C ，10 min终止第一链合成反应。
10. 室温冷却，加入1 μl RNA酶H (2U)。
11. 37°，孵育20 min。
12. 继续进行LD-PCR 扩增(Section VII.B)。
注意: –20°C下可保存3个月。
第一链反应最终体积为15μl• 10 μl SMART III Oligo(10 μM; 5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGG CCATTATGGCCGGG-3’)• 10 μl CDS III 引物(10 μM; 5’-AT TCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACA TG-d(T)30VN-3’)*23个碱基• 10 μl CDS III/6 引物(10 μM; 5’-AT TCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACA TG-NNNNNN-3’)注意: N = A, G, C, or T; V = A, G, or C• 50 μl 5’ PCR 引物(10 μM; 5’-TTCCACCC AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGG-3’)25个碱基•50 μl 3’ PCR 引物(10 μM; 5’-GTATCGATGCCCACCC TCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACA-3’)第二链cDNA合成（LD-PCR）尽量使用最小的循环数来得到3-6ug的ds cDNA。
东北农业大学学报2020年第51卷总目次
东北农业大学学报2020年第51卷总目次研究报告孕穗期冷水胁迫下施用γ-氨基丁酸对寒地粳稻氮光合效率的调控效应…………贾琰，任鹏飞，赵宏伟，邹德堂，王晋，杨亮1大豆GmPID基因生物信息学分析及克隆…………张超，张勇，满百膺，伍应保，张高阳，张惠宁，涂班策，吕晶晶，李思楠，程鹏，武小霞1外源激素处理对美洲南瓜植株生长的影响…………………………………………屈淑平，丁文琪，王云莉，徐文龙，任晓婧1乙烯处理对树莓果实呼吸速率及乙烯合成代谢的影响………杨国慧，辛月岩，麻世琳，韩德果，李铁梅，范珍珠，王佳明1抗O型口蹄疫病毒猪源单链抗体的筛选……………李德山，胡爽，赵文漾，李青青，郭笑辰，王丹，任桂萍，尹杰超1亮氨酸和异亮氨酸对脂肪沉积的影响及机制……………………………马清泉，王国红，周昕博，朱佳良，岳志元，单安山1通草提取物对奶牛乳腺上皮细胞乳糖合成及相关基因表达的影响……………………………………刘莉莉，王博，蒋倩倩1亮氨酸和异亮氨酸对脂肪沉积的影响及机制…………王宏燕，马晓伟，郑涵，赵承森，全鑫，刘锡博，张月沛，单建荣，范金霞，赵伟，朱用哲1基于改进遗传算法的河流水质模型多参数识别………………刘洁，陈昊辉，张丰帆，姜德迅，许崇品，南军，王鹏1考虑水文变异的水库生态流量研究………………………………………徐淑琴，王亚超，乐静，高凯茹，齐竟辰，徐恩典1过滤后养猪废水厌氧发酵与固氮技术研究……………………………………………………张洋洋，关正军，章恬恬，尹恒1大豆种子分泌物中蛋白质鉴定及其对大豆疫霉的趋化作用……………文景芝，赵钰琦，高新颖，张卓群，吴羚阁，贾梦瑱2大豆GmVIT1克隆及耐盐功能分析……………………………李永光，景雅，孙铭阳，张沿政，苌兴超，陈龙，李文滨2大豆GmFT5a基因启动子受日长调控模式分析………………………………………………赵琳，张妍，刘颖，许崇晶2不同密度和行距对玉米生长特性、产量和籽粒营养成分的影响…………………………………董伟欣，韩立杰，张月辰2西瓜果皮硬度相关性状分析…………………………王学征，杨天天，刘争，孙蕾，朱子成，高鹏，刘识，栾非时2多糖对大豆分离蛋白乳液及乳液凝胶性质的影响…………………………………朱秀清，王婵，孙禹凡，钟明明，齐宝坤2不同发酵条件对氨化玉米秸秆粗蛋白质含量的影响…………谢小来，魏川子，马逢春，陈明明，王雪，孙悠然，焦培鑫2四川丘陵旱地玉米穴灌覆膜施肥播种机设计与参数优化……胡云，王小春，陈诚，蔡金雄，蒲甜，张黎骅，杨文钰2夹护式西瓜钵苗移栽机构设计与试验………………………………………………许春林，解江涛，王宇杰，李恩全，辛亮2遥感蒸散发在无测站资料地区洪水模拟中的应用………………邢贞相，傅爽，孙明新，纪毅，付强，李衡2高效、快速提取高质量稻曲病菌基因组DNA方法……………………张俊华，马玥，杨明秀，宋爽，刘连夫，杨硕3黄瓜棒孢叶斑病菌实时荧光定量PCR方法的建立与应用…………张艳菊，刘齐月，张笛，陶磊，王春龙，刘行风，李雪莲，马天，刘东3间作黄瓜对辣椒疫病及生长发育的影响………………………蒋欣梅，张倩，陈映彤，白国梁，王杰，吴凤芝，于锡宏3低温胁迫对戊唑醇包衣高粱种子出苗和幼苗生理生化的影响…………樊娟，龙海江，向晓龙，任明见，吴传玺，胡安龙3 Lager酵母中CRISPR-Cas9基因敲除系统的构建……………李梦琦，张可心，郑飞云，钮成拓，刘春凤，李崎，王金晶3氢气对CO2气腹致大鼠肾脏损伤的保护作用及相关机制研究…………张建涛，蒋丽红，陈明子，王婷，董奕含，范宏刚3重组人碱性磷酸酶表达及其调节人白细胞释放TNF-α活性研究…………惠觅宙，秦璐楠，高辰哲，薄乐，刘天奇，吴书音，韩建春，翁晓刚，双宝3封闭条件下粉质黏土冻融交界面抗剪强度研究………………………………………………汪恩良，肖尧，许春光，田雨3基于NSGA-Ⅱ灌区两级渠道输配水优化调度……………………………徐淑琴，高凯茹，乐静，王亚超，乔厚清，王雅君3大豆种子包衣机种药混合装置匀种性能数值模拟与试验……韩豹，刘俏，高英玲，杨书婕，郭畅，董小伟，李悦梅3多环境下水稻株型相关性状QTL解析……………………………………………刘化龙，杨洛淼，徐善斌，刘华东，邹德堂4基于元分析的大豆胞囊线虫病3号生理小种抗性基因挖掘…………韩英鹏，田利峥，姜海鹏，包冬芳，王俊，赵雪4 RNAi技术介导大豆蚜hsp70基因对其内源物质及激素表达的影响……………韩岚岚，陈娟，赵奎军，邴玉成，朱琳，张雯林，高丽瞳，肖建飞，金明国4西瓜种子脂肪酸组分分析及种子油体显微观察………………栾非时，裴爽，刘争，高鹏，刘识，朱子成，王学征4施用有机肥对土壤重金属累积的影响及风险评价……………姜佰文，陆磊，王春宏，高强，张迪，陈曦，王艳玲4在线自由基清除法引导具有抗氧化活力蛋白组分分离纯化…………………………………张宏伟，郭阳，孙义玄，包怡红4鸡HMG box蛋白1（HBP1）基因启动子区多态性与腹脂率关联分析…………王守志，张长超，李紫薇，王伟佳，李玉东，王宁，李辉4茶多酚对过氧化氢诱导鹅小肠上皮细胞氧化损伤的保护作用……………………付晶，林桐，陈艾玲，邓珊，刘春朋4褐鳟LEAP-2成熟肽在大肠杆菌中的融合表达……刘晨斌，徐革锋，黄天晴，谷伟，陈春生，程琳，史秀兰，王炳谦4农用履带机器人轨迹跟踪控制系统设计与试验………………………匡文龙，沈文龙，姬长英，田光兆，顾宝兴，刘朋4猪场废水培养小球藻工艺优化…………………………………………王忠江，李泽，王贵祥，王子越，孙玮，姚纪宇4不同轮作模式对黄瓜幼苗生长及土壤化学性质的影响……………………………………………………………吴凤芝，朱维伟5 Cf-19介导的抗番茄叶霉病（Cladosporium fulvum）免疫应答酵母双杂交cDNA文库构建和鉴定…………许向阳，裴童，吴泰茹，王子玉，赵婷婷，李景富，杨欢欢，姜景彬，张贺5不同种植模式下大豆蚜种群体内生理活性物质含量及生命参数研究…………赵奎军，高丽瞳，韩岚岚，陈娟，赵雅妮，肖建飞，郝子茹，师正浩，朱琳5谷氨酸棒杆菌PhoPR双组分系统应答低氧胁迫功能研究………………………陈静，彭枫，刘秀霞，杨艳坤，白仲虎5缺氧诱导因子2α在大鼠早期妊娠中的表达与调节…………………………………………马兴红，陈川，姜南，李世杰5有机物料还田对黑土有机碳及其组分的影响…………………闫雷，周丽婷，孟庆峰，李思莹，戴建军，张宇飞，喇乐鹏5母猪防御攻击性对仔猪争斗行为及生长性能的影响………王希彪，吴锡，李柯，闫浩宇，黄宣凯，崔世泉，狄生伟5猪全基因组范围ETS基因家族成员的鉴定、进化与表达分析…………王志鹏，周萌，郭媛媛，张超鑫，王涛，刘胜伟，闫晓红，丁坤，朱秋思，杨里昂5基于遥感的辽河口岸线动态变化及成因分析…………………………邢贞相，刁晴茹，纪毅，李衡，付强，刘东5 1JM-200灭茬旋耕一体机关键部件设计与试验………………………秦宽，周强，曹成茂，李威亚，张远，刘权5外源海藻糖对碱胁迫下不同品种水稻幼苗生长及生理特性的影响…………邹德堂，王烁，孙健，李嘉明，尹天娇，王敬国，刘化龙，郑洪亮，杨洛淼6生物药肥对水稻秧苗免疫抗病机理的研究…………………………………………………丁伟，高文逸，程茁，戴航宇6大豆玉米间作体系溶磷菌筛选及影响因素研究………………………………………………………王浩，朱思沅，刘晓峰6辽藁本内生细菌ZHAB63鉴定与拮抗菌筛选………………………………………张芳芳，田义新，卢宝慧，王志清，刘桂英6一株产肠毒素大肠杆菌短尾噬菌体分离与鉴定………………………魏炳栋，丛聪，于维，徐永平，李纪彬，李淑英6层粘连蛋白调控奶牛乳腺上皮细胞乳蛋白合成途径研究…………………………………王春梅，王保胜，门晶晶，赵锋6日粮蛋白质水平对生长肥育猪消化代谢的影响………………………尚秀国，邓波，朱晓萍，陶新，袁启志，冯尚连6咖啡酸对LPS诱导小鼠乳腺炎的保护作用……………………………………………………张雯，王琳，孙雅丽，马建章6利用2型重组腺相关病毒抑制子宫腔上皮Plekhs1基因表达对小鼠生育能力的影响…………马兴红，张其法，姜南，李世杰，王一妹6基于SWAT模型与Copula修正的融雪径流模拟……………………………………邢贞相，金超群，纪毅，付强，刘东6水稻钵苗夹秧式分秧装置夹秧片变形试验…………………………………………………尹大庆，池相河，周脉乐，王佳照6外源激素对水稻籽粒碳氮代谢相关酶基因表达影响…………金正勋，王思宇，王珊，王剑，张忠臣，李钢夑，朴钟泽7马铃薯晚疫病菌卵孢子形成与萌发条件研究…………张铉哲，姜萌，陈梅，周子豪，李媛媛，赵雪，任雪琦，徐浩然，陈苏慧7干旱胁迫下“Micro-Tom”番茄酵母双杂交cDNA文库构建和鉴定…………许向阳，裴童，吴泰茹，王子玉，赵婷婷，李景富，杨欢欢，张贺，姜景彬7不同类型番茄品质性状遗传多样性及其相关性分析……………………………………………………………卢琦，梁燕7高效液相色谱法同时测定黑蒜中蒜氨酸、脱氧蒜氨酸及γ-谷氨酰半胱氨酸含量…………卢连登，周御，黄振荣，刘春凤，郑飞云，钮成拓，王金晶，马玉金，李崎，王栋7豆渣回添量对内酯豆腐品质特性的影响……………………………………………………兰秋雨，林兆晖，杨文钰，张清7乌苏里貉KIT基因及编码蛋白生物信息学分析…………白秀娟，姜恩泽，苏杭，朱宇航，许愿，徐逸男，李雪，韩志强，徐超7牦牛和犏牛MEISETZ基因克隆及生物信息学分析………………………………向娅，柴志欣，武志娟，王吉坤，钟金城7黑龙江水系6个地理群体银鲫染色体倍性和肌肉营养分析………………………韩英，李洪卿，薛淑群，吕晓楠，马凯7基于改进SVM算法的典型作物分类方法研究…………………………贾银江，姜涛，苏中滨，孔庆明，张萧誉，施玉博7大豆胞囊线虫病抗性相关AP2/EREBP转录因子生物信息学分析………………韩英鹏，卜凡珊，田利峥，姜海鹏，赵雪8水稻三种化控剂复配及壮秧机理研究…………………………………………………………………丁伟，李如意，孔祥男8几种绿色方法防治大豆蚜效果研究……………………………………樊东，鲁冰瑜，杨洪佳，陈雅茹，李泽，张良8黑龙江省黄瓜主栽品种及种质资源对霜霉菌不同致病型抗病性鉴定…………张艳菊，陶磊，刘东，周秀艳，李雪莲，马天，潘梦佳8外源ALA对盐胁迫下西伯利亚白刺光合作用的影响……………………闫永庆，季绍旭，王贺，赵野，范倩雯，王骁8肉鸡屠体脂肪含量间接选择方法及其效果评估…………李辉，陈冲，冷丽，王守志，宿志勇，肖凡，郭怀顺，李玉茂，栾鹏8过表达TLR4基因绵羊对口蹄疫疫苗（O型）免疫效应研究…………姚玉昌，翟羽飞，宋旭婷，赵多维，陆奇，徐利强，亓美玉，陆明海8植物乳杆菌Lp229v饲喂奶牛效果研究………………………………………………………张永根，崔梓琪，姜鑫，徐宏建8基于BP神经网络模型黑龙江漠河段气温变化对开江影响预测……………………………宋春山，林立邦，韩红卫，朱新宇8基于高光谱和MLSR-GA-BP神经网络模型油菜叶片SPAD值遥感估算……………崔小涛，常庆瑞，屈春燕，史博太，蒋丹垚，夏利恒，王玉娜8响应面优化复合酶制备干酪素工艺……………………………………………………………蔡丽莎，王东鹏，曾珍，李诚8有色稻米B族维生素含量与种皮颜色关系研究…………邹德堂，韩笑，孙健，王敬国，刘化龙，郑洪亮，杨洛淼，荆雨桐，黄菊9钾肥对水稻籽粒碳氮代谢相关酶基因表达的影响…………金正勋，王珊，王思宇，王剑，张忠臣，李钢夑，朴钟泽9马铃薯StERF10基因克隆及重金属胁迫下表达分析……………………蒙露露，何冠谛，田维军，李丹丹，黄云，何腾兵9黄瓜CsHSP20基因克隆和生物信息学分析…………………………………………秦智伟，张君鸣，辛明，单宝成，周秀艳9基于层次分析法的旱地不同番茄品种产量和品质比较…………苏秀敏，韩文清，王佼，李鹏，王秋兰，李万星，曹晋军，靳鲲鹏，李丹，李小霞，刘永忠9堆肥土著微生物演替响应抗酸化菌剂研究……………………………………………………宋彩红，齐辉，魏自民，席北斗9染色质重建因子BRG1介导Ile调节牛乳腺上皮细胞乳合成分子机理研究………高学军，王哲，祁昊，王璐璐，甄贞9江苏省荷斯坦牛日产奶量Wood模型DHI分析…………梁艳，王海洋，郭梦玲，张强，高启松，李明勋，张慧敏，杨章平，毛永江9哈尔滨市城市化进程对气温变化影响…………………………………崔嵩，贾朝阳，宋梓菡，付强，刘东，崔宁波9温室三七收获机挖掘铲铲型对比研究……………………………………………张兆国，余小兰，李汉青，程一启，解开婷9基于无线传感技术的秸秆焚烧火点在线监测系统设计与实现…………刘蓝，谢明江，高珊，张齐心，宋井富，周康康9不同发育时期大豆豆荚性状QTL动态分析…………滕卫丽，郭志文，郑立娜，付雪，王博，董莹莹，张丹洋，刘赫禹，冯文婧，赵雪，韩英鹏，李文滨10大豆胞囊线虫病抗性候选基因GmPEBP4-1克隆及表达分析……………………………郭杨，陈立新，姜海鹏，战宇航10青海高原藜麦资源农艺性状评价及产量相关分析……………………李想，朱丽丽，张业猛，权有娟，代千千，陈志国10不同盐分胁迫对皂荚种子萌发及幼苗生理特征的影响……………………………………于兆友，闫海冰，张慧芳，杨秀清10苹果属小金海棠WRKY48基因克隆与功能初步分析…………………韩德果，周正一，杜漫，李铁梅，王爽，杨国慧10转录因子KLF7对IL-6基因的转录调控分析………………王宁，尤欣，徐海冬，娄明，娄钰琦，闫晓红，李辉10干扰MAP3K1基因对山羊毛囊干细胞增殖和凋亡的影响……………马金亮，王健，冯云奎，王强，张柳明，李拥军10内蒙古部分地区绵羊胃肠道线虫感染率及驱虫效果比较研究…………何秀玲，贡庆扎布，其力木格，海鹰，额叶勒德格，哈斯苏荣10基于Copula函数黑土区水稻不同种植模式分析…………………………………魏永霞，张学文，刘慧，侯景翔，冀俊超10四川丘陵旱地春玉米穴灌播种机配套农艺措施研究………石恺，王小春，陈诚，蔡金雄，蒲甜，张黎骅，杨文钰10水稻叶片SPAD值高光谱成像估测……………………………………康丽，高睿，孔庆明，贾银江，施玉博，苏中滨10大豆产量相关性状QTL定位……………………………………………………韩英鹏，栗春霞，赵雪，于宽伟，罗政辉11碱胁迫下不同水稻品种微观结构响应解析………赵海新，黄晓群，陈书强，杨丽敏，杜晓东，张志强，蔡永盛，潘国君11向日葵油酸合成上游基因HaFAB2克隆与表达分析…………………………………………………………………………周菲11树莓种子休眠原因探究………………………………………杨国慧，范珍珠，李玲，李铁梅，郭潇雨，张蕴瑭，王一凡11层积前GA处理对老山芹种胚发育及物质代谢的影响………李富恒，吴晶晶，赵恒田，张晓雯，张宏发，尚爱娟，马汇聪11基于线粒体DNA黑龙江野猪进化分析……………………………………………王文涛，刘娣，张东杰，何鑫淼，田明11基于枯草芽孢杆菌多组学数据全基因组规模代谢模型与蛋白质降解模拟…………袁萍，江明锋，官久强，安添午，张翔飞，罗晓林11基于高通量测序和Q-PCR芯片技术分析养殖环境中苍蝇携带细菌菌群结构和耐药基因特点…………张红娜，周玉法，崔娜，翟真真11基于多目标遗传算法的灌排两用渠道输水优化调度…………………徐淑琴，王雅君，乔厚清，郭晓婷，李仲裕，徐恩典11黑龙江省农业水足迹时空分布及用水效率分析…………………………………姜秋香，李鑫莹，王子龙，吴云星，曹璐11研究进展果园风送式喷雾机智能化发展现状与前景分析……………………………………边永亮，李建平，薛春林，王鹏飞，李昕昊2镰孢菌与大豆根腐病研究进展……………………………………………………………………………………许艳丽，魏巍3东北典型黑土区农田景观多尺度土壤养分时空分异研究进展……………张少良，张海军，肖梓良，曲凤娟，王雪珊，霍纪平，张兴义，刘晓冰7卷终。
两个水稻品种(系)酵母双杂交cDNA文库的构建和比较分析
ｄ ｕ ｌ—ｔａ ｄ ｃ ｏ ｂ ｅ ｓｒ ｎ ＤＮＡ，ａ ｄ ｔ ｅ ＤＮＡ ｗｅ ｅ ｉ ｓ ｒ ｄ ｉ ｔ ｍｏ ｉ ｅ ｅ ｔ ｒＮ ＧＡＤ ７ ｔ ｒ ｕ ｈ ｎ ｈ ｎ ｅ ｒ ｎ ｅ ｔ ｎ ｏ ｅ ｄ ｆ ｄ ｖ ｅ ｏ ｐ ｉ Ｔ ｈ ｏ ｇ Ｉ ｅ ｚ ｍｅ ｓｔｓ ｎ ｅ ｓ ｎ ｙ ｉ ，ａ ｄ ｙ ａ ｔ ｅ
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大豆叶片全长cDNA文库的构建与鉴定
作物杂志 Ｃｏｓ ｒ 英慧 张 宝石 关 荣霞 常 汝镇 邱 丽娟
摘 要 以 大 豆绥 农 ｌ ４第 一 个三 出复 叶 幼 叶
为材料提 取 ｍ Ｎ 利 用 Ｓ ＡＲ Ｒ Ａ， Ｍ Ｔ技 术 合 成 了 全 长 ｃ Ｎ 经 限制 性 内切酶 ｓ ａ和 日 消化后 的 ｃ Ｎ Ｄ Ａ， ｉ ｆ Ｄ Ａ
３ ０Ｎ
Ｎ一 ’Ｎ＝Ａ， Ｃ或 Ｔ； ３（ Ｇ， Ｎ一，＝Ａ， 或 Ｃ） Ｇ ，
Ｓ ＭＡＲ Ｖ ｌ ｏ（ Ｔ） ５ Ｔ Ｉ Ｏ ｉ ｄ ： ’一 ＡＡＣＣ Ｔ ｇ ＡＧ ＧＧＴ Ｔ 了 ＤＡ 测 解 生物 体 结 构 和 功 能 的 一 种 重 要 方 法 之 一 。 全 长 ｃＮ Ｄ Ａ有 助于鉴 定其 基 因组 序 列 中的外 显 子 一内含 子的边 界 ， 析 基 因编 码 区 和理 解 基 因在 转 录 和 翻 分 译 水平 的功 能 ， 是分析 植 物基 因表 达 图谱 、 能 和结 功 构的重 要资 源 。 日本 的研究 人 员在 拟南 芥 和水稻 基 因组测 序后 ， 后完成 了拟南芥 、 稻 全长 ｃ Ｎ 先 水 Ｄ Ａ文
Ｃ Ｃ Ｇ （ Ｇ Ｃ ＡＩ Ａ Ｇ Ｃ Ｇ Ｇ 一３。 ｃ Ｎ 第 Ｇ Ａ Ａ Ｇ Ｃ ｒ Ｃ Ｇ Ｃ Ｇ Ｔ Ｔ ’ ＤＡ 二 链 合 成 ５Ｐ Ｒ 引 物 ５ ’Ｃ ’一 Ａ Ｇ Ａ Ｔ Ｇ Ａ Ａ Ｃ Ｇ Ｇ ＴＴ
ＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴ 一３’ 。 ＲＮｅ ｓ ｌｎｔｋ ｔ Ｏｌｇ ｔ ｘ ｍＲＮＡ ｉ — ｃ ｌ ｍｎ ａ ｙ Ｐ ａ ｉ ， ｉｏｅ Ｓｐｎ ｏｕ
室 种植 ， 当第 一 个三 出复 叶 完全 展开 时 ， 取其 三 出复
入 片断 大小范 围为 ０２ ２０ ｂ 主要 集 中在 ０ ５～ ．５～ ．ｋ ， ．
《水稻膜系统酵母双杂交cDNA文库及OsVDAC5诱饵蛋白载体的构建与鉴定》
《水稻膜系统酵母双杂交cDNA文库及OsVDAC5诱饵蛋白载体的构建与鉴定》一、引言随着生物技术的飞速发展，水稻作为重要的粮食作物，其研究日益受到广泛关注。
水稻膜系统是水稻细胞中一个重要的组成部分，对于维持细胞正常功能起着至关重要的作用。
酵母双杂交技术作为一种有效的工具，被广泛应用于蛋白质相互作用的研究中。
本文旨在构建水稻膜系统酵母双杂交cDNA文库及OsVDAC5诱饵蛋白载体，并对构建结果进行鉴定。
二、材料与方法1. 材料（1）水稻基因组DNA；（2）酵母菌株；（3）PCR引物；（4）cDNA文库构建试剂盒；（5）酵母双杂交试剂盒；（6）OsVDAC5基因序列。
2. 方法（1）cDNA文库的构建：利用PCR技术扩增水稻膜系统相关基因的cDNA序列，将扩增产物与载体连接，构建cDNA文库。
（2）诱饵蛋白载体的构建：将OsVDAC5基因序列克隆至酵母双杂交系统所用的载体中，构建OsVDAC5诱饵蛋白载体。
（3）载体鉴定：通过PCR、酶切及测序等方法对构建的cDNA文库及OsVDAC5诱饵蛋白载体进行鉴定。
三、结果与分析1. cDNA文库的构建与鉴定（1）通过PCR扩增得到水稻膜系统相关基因的cDNA序列，将扩增产物与载体连接，成功构建了cDNA文库。
（2）对构建的cDNA文库进行PCR鉴定，结果显示扩增出的cDNA片段大小与预期相符，说明cDNA文库构建成功。
2. OsVDAC5诱饵蛋白载体的构建与鉴定（1）将OsVDAC5基因序列克隆至酵母双杂交系统所用的载体中，成功构建了OsVDAC5诱饵蛋白载体。
（2）对构建的OsVDAC5诱饵蛋白载体进行PCR、酶切及测序鉴定，结果显示OsVDAC5基因已成功克隆至载体中，且序列正确无误。
四、讨论本研究成功构建了水稻膜系统酵母双杂交cDNA文库及OsVDAC5诱饵蛋白载体，为进一步研究水稻膜系统中蛋白质相互作用提供了有力工具。
在构建过程中，我们采用了PCR技术扩增相关基因的cDNA序列，并利用载体连接、克隆等技术完成了文库及载体的构建。
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植物病理学报ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA 43（5）：556-560（2013）收稿日期：2012-08-15；修回日期：2013-07-02基金项目：国家自然科学基金（31101411）；江苏省农业科技自主创新基金（CX （12）5045）；转基因抗大豆花叶病毒病高蛋白大豆新品种的培育（2010ZX08004-004-004）通讯作者：陈新，研究员，主要从事豆类病害和豆类育种的研究；Tel ：025-********，E-mail ：cx@jaas．ac．cn 智海剑，教授，主要从事大豆花叶病毒的研究；Tel ：025-84396463，E-mail ：zhj@njau．edu．cn 。
檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭殐殐殐殐研究简报大豆花叶病毒诱导的应用于膜蛋白酵母双杂交的大豆cDNA 文库构建崔晓艳1，陈新1*，栾鹤翔2，智海剑2*（1江苏省农业科学院蔬菜研究所，南京210014；2南京农业大学农学院，南京210095）Construction of Soybean mosaic virus -induced soybean cDNA library for mem-brane-based yeast two-hybrid system CUI Xiao-yan 1，CHEN Xin 1，LUAN He-xiang 2，ZHI Hai-jian 2（1Institute of Vegetable Crops ，Jiangsu Academy of Agricultural Sciences ，Nanjing 210014，China ；2College of Agricul-ture ，Nanjing Agricultural University ，Nanjing ，210095，China ）Abstract ：Membrane-baesd yeast two-hybrid system is an effective method for research on interaction between Soy-bean mosaic virus -encoded membrane-associated proteins and host factors ，while the Gateway technology without the use of restriction enzyme cloning techniques is easier for construction of virus-induced host cDNA library．In this study ，both membrane-based yeast two-hybrid system and Gateway TM systems were used．With TＲIZOL regent ，total ＲNA was extracted from soybean leaves infected with soybean mosaic virus ．SMV-induced soybean primary cD-NA library constructed by Gateway technology was recombined into a reconstructed prey vector for membrane-based yeast two-hybrid system．The capacity and quality tests showed that the library titer was 1．7ˑ106cfu /mL and the length of inserted cDNA fragments ranged from 0．5to 2kb．It is available for research on interaction between the virus-encoded membrane protein and host．Key words ：Soybean mosaic virus （SMV ）；cDNA library ；Membrane-based yeast two-hybrid system （MbY2H ）；Gateway technology文章编号：0412-0914（2013）05-0556-05前言大豆花叶病毒（Soybean mosaic virus ，SMV ）是大豆上最普遍的病害之一，严重影响大豆的产量和品质，通过筛选与病毒互作的寄主蛋白，根据互作蛋白的功能和两者的作用机制可揭示病毒侵染的分子机制。
对于病毒编码的膜蛋白或者膜相关特性的蛋白，由于具有膜结合特性，在生物体内的互作多发生在膜上。
传统的酵母双杂交系统发生在核内，试剂盒的载体上加了核定位信号肽，可以把基因都锚定到酵母核内；这与细胞内自然状态下的互作情况是有差异的，而且翻译后修饰过程等都无法完成。
目前已经有专门适用于膜蛋白的泛素酵母双杂交系统［1］，直接在膜系统上发生互作，解决了这些难题。
由于膜蛋白酵母双杂交系统必须购买对应的文库或定制，成本较高，且程序复杂。
而已经商业化的美国Invitrogen 公司开发的Gateway 技术可将DOI:10.13926/ki.apps.2013.05.0135期崔晓艳，等：大豆花叶病毒诱导的应用于膜蛋白酵母双杂交的大豆cDNA文库构建cDNA片段定向且快速转移至各种目的载体上，大大提高单次构建文库的利用率；且在后续的目的基因研究工作中可直接通过BP和LＲ双向反应进行载体构建，无需PCＲ与重复测序过程，明显提高后续研究工作效率［2］。
因此我们将膜蛋白酵母双杂交系统与Gateway TM系统相融合，利用Gateway高效文库构建系统构建大豆花叶病毒诱导的大豆叶片初级cDNA文库，然后将初级文库重组到泛素介导的膜蛋白酵母双杂交系统载体上，为从中筛选与SMV编码的膜蛋白相互作用的寄主因子奠定了基础。
1材料与方法1．1材料及试剂本实验所用菌株DH10B、DH5α，载体pPＲ3-N、pDEST22为江苏省农科院蔬菜所实验室保存，大豆品种南农1138-2和SMV强毒株系SC15由南京农业大学大豆改良中心提供，菌株ccdB survival strain、CloneMiner文库构建试剂盒等购自Invitro-gen公司，其他常规酶、培养基、生化试剂等购自大连TaKaＲa公司。
引物合成及测序由Invitrogen公司完成。
1．2方法1．2．1TotalＲNA的提取及mＲNA的分离鉴于所构建文库主要用于大豆对大豆花叶病毒侵染反应分子机制研究，取SMV侵染发病的大豆叶片，参照Trizol操作说明书提取总ＲNA，用ＲNase-free H2O溶解并检测质量。
参照FastTrack 2．0Kit 说明书分离mＲNA。
1．2．2cDNA初级文库的构建及质量鉴定取上步骤中得到的mＲNA3μg，参照CloneMiner文库构建说明书进行cDNA第一链的合成及ds cDNA 的合成，然后将ds cDNA与三框attB1重组接头连接并用色谱柱分级法进行片段分级及收集，再将含attB1接头的cDNA文库通过BP反应构建到入门载体pDONＲ222上，最后导入大肠杆菌DH10B宿主细胞中，得到文库菌液。
进行初级文库质量鉴定。
（1）库容量的鉴定取转化后细菌原液（1mL）10μL稀释1000倍后，从中取出50μL涂布LB平板，第二天计数。
总克隆数CFU=平板上的克隆数/50μLˑ1000倍ˑ1ˑ103μL。
（2）重组率和插入片段长度鉴定随机挑取32个克隆进行菌落PCＲ鉴定（M13引物），电泳鉴定插入片段大小及多态性，分析文库的重组率。
1．2．3猎物载体pPＲ3-gateway的构建设计引物扩增pDEST22上attＲ1与attＲ2之间的序列，引物5'端带SfiⅠ酶切位点（根据载体pPＲ3-N上两个中间序列不同的SfiⅠ，分别命名为SfiA和SfiB）attＲ1sfiA：5'-agtggccattacggccACAAGTTTGTA-CAAAAAAGCTGAACGAGAAACG-3'attＲ2sfiB：5'-agaggccgaggcggccACCACTTTGTA-CAAGAAAGCTGAACGA-3'将SfiⅠ分别酶切pPＲ3-N和以上引物所扩得的PCＲ产物（attＲ1-Cmr-ccdB-attＲ2），进行连接反应，构建好的载体pPＲ3-gateway转化ccdB survival strain感受态细胞，用引物pPＲ3-NF（5'-GTCG-AAAATTCAAGACAAGG-3'）和pPＲ3-NＲ（5'-AAGCGTGACATAACTAATTAC-3'）测序鉴定插入片段序列的正确性。
将载体分别转化菌液（ccdB survival strain）和DH5α感受态细胞，根据菌落是否长出判断插入片段是否正常表达。
1．2．4酵母双杂交cDNA文库的构建将上步验证合格的初级文库，采用肉汤培养基扩大培养，提取入门文库质粒。
将入门文库质粒稀释到300ng/μL，与构建好的目的载体pPＲ3-gateway进行LＲ重组反应并电转化DH10B感受态细胞，得到酵母文库菌液。
评价目的文库质量（方法同1．2．2），PCＲ鉴定引物为：pPＲ3-NF，pPＲ3-NＲ。
2结果与分析2．1大豆叶片总ＲNA的提取及mＲNA的分离经测定，大豆叶片总ＲNA OD260/OD280=1.87，OD260/OD230=2．50，浓度为：2μg/μL，结果表明ＲNA的纯度较高，蛋白、盐分已去除。
从1%琼脂糖凝胶电泳结果看，28S和18S两条ＲNA条带清晰（图1A），表明提取的总ＲNA完整性较好。
总ＲNA经mＲNA纯化后，电泳图呈弥散状，可以用于文库构建（图1B）。
755植物病理学报43卷Fig．1Total ＲNA and mＲNA analyzed on 1%agarose gelA ：Total ＲNA ；B ：mＲNA ；M ：1kb DNA ladder．2．2初级cDNA 文库的构建及质量鉴定经检测，初级cDNA 文库滴度为6．84ˑ106cfu /mL 。
随机挑取32个克隆进行PCＲ鉴定，结果表明文库重组率为96%，插入片段大小范围为0．52．0kb ，平均片段大小为1kb （图2），表明大豆叶片初级cDNA 文库质量较高。
2．3猎物载体pPＲ3-Gateway 的构建pPＲ3-N 载体经Sfi Ⅰ双酶切得到6kb 产物，PCＲ扩增得到pDEST22上attＲ1与attＲ2之间的片段1．8kb ，电泳检测片段大小均符合（图3）。