植物4-香豆酸-辅酶A连接酶(4CL)研究进展

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4-香豆酸：辅酶A连接酶(4CL)活性检测试剂盒说明书紫外分光光度法

4-香豆酸：辅酶A连接酶（4CL）活性检测试剂盒说明书紫外分光光度法注意:正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

货号:BC4220规格:50T/48S产品简介：4-香豆酸：辅酶A连接酶（4-coumarate:CoA ligase，4CL）是木质素生物合成的关键酶之一，主要催化肉桂酸及其羟基或者甲氧基衍生物生成相应的辅酶A酯，这些中间产物随后进入苯丙类衍生物支路合成途径。

该酶主要存在于高等植物、酵母和菌类中，研究该酶可以探讨多种生物细胞发育过程中木质素沉积的代谢机理，为减少水果石细胞含量而提高其品质提供依据。

4CL催化4-香豆酸和CoA生成4-香豆酸CoA，其在333nm下测有特征吸收峰，测定4-香豆酸CoA的生成速率，即可反映4CL活性。

试验中所需的仪器和试剂：紫外分光光度计、低温台式离心机、水浴锅、1mL石英比色皿、可调式移液枪、研钵/匀浆器、EP管、冰和蒸馏水。

产品内容：提取液：液体60mL×1瓶，4℃保存；试剂一：液体30mL×1瓶，4℃保存；试剂二：粉剂×瓶，-20℃保存；临用前加入6mL蒸馏水溶解，可以分装后-20℃保存，避免反复冻融。

试剂三：液体6mL×1瓶，4℃保存；试剂四：粉剂×1瓶，-20℃保存；临用前用6mL蒸馏水溶解备用，可以分装后-20℃保存，避免反复冻融。

试剂五：粉剂×1支，4℃保存；加入1mL蒸馏水溶解。

临用前用蒸馏水稀释40倍后备用，现用现配。

操作步骤：一、粗酶液提取：1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。

植物花青素合成代谢途径及其分子调控

植物花青素合成代谢途径及其分子调控一、本文概述植物花青素是一类广泛存在于自然界中的天然色素，它们以其丰富的色彩和独特的生物活性，在植物的生长、发育以及适应环境过程中发挥着重要作用。

花青素的合成代谢途径是一个复杂而精细的网络，涉及到多个酶的催化作用和各种调控机制的协同作用。

本文将对植物花青素合成代谢途径及其分子调控进行系统的阐述，旨在深入理解花青素生物合成的分子机制，挖掘其在植物生物学中的应用潜力，为植物遗传改良和农业生产提供理论依据。

本文将详细介绍植物花青素合成代谢途径的基本框架和关键步骤，包括前体物质的合成、花色苷合成酶系的催化作用以及最终产物的形成等。

通过对这些基本过程的分析，我们可以清晰地了解花青素如何从简单的无机物质逐步转化为复杂的有机色素。

本文将深入探讨花青素合成代谢途径中的分子调控机制。

这包括转录水平、翻译水平和翻译后水平等多个层次的调控，涉及多种转录因子、miRNA、激素信号转导通路以及蛋白质相互作用等。

通过对这些调控机制的研究，我们可以揭示花青素合成代谢途径的复杂性和灵活性，了解植物如何根据环境条件的变化调整花青素的合成量和种类。

本文将总结花青素合成代谢途径及其分子调控在植物生物学中的应用前景。

随着对花青素生物合成机制的深入理解，我们可以利用基因工程、代谢工程等现代生物技术手段，对植物进行遗传改良，提高花青素的含量和品质，进而开发出更具营养价值和观赏价值的植物新品种。

花青素作为一种天然色素和生物活性物质，在食品、医药和化妆品等领域也具有广阔的应用前景。

因此，对植物花青素合成代谢途径及其分子调控的研究具有重要的理论和实践意义。

二、植物花青素合成代谢途径植物花青素（Anthocyanins）是一类重要的次生代谢产物，广泛存在于各类植物的花、果实、叶片和茎干中，赋予植物丰富多彩的色泽。

这些色素不仅影响植物的观赏价值，而且在植物应对环境胁迫（如紫外线、低温、干旱等）和防御病虫害方面发挥重要作用。

林学——维管植物4-香豆酸：辅酶A连接酶(4CL)研究进展

０ｌ７枷ｌ６２０・６１０
物质能源之一．参９关键词：二次能源；生物质能源；气化；生物制氢：沼气
０ｌ７枷ｌ９２０・７１０
１０９）００４，张文吉，刘建华，，植物保护．一
２ｏ０７，３（ ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ １￣２３１．５０－
１７９～１８１
关键词：溴甲烷；替代品；使用技术
０枷７ｌｌ４２０・６１０
综述了我国苜蓿主要病害的分布和危害、病原学、发生规律、抗性种质材料的遗传筛选和鉴定及综合防治等方面的主要研究进展，并提出了今后的研究方向和发展目标．参２６关键词：苜蓿病害；抗病性：综合治理０１０１７４０７２０・０农业工程１７
关于农机与农艺谁为谁服务的问题长期未解决．在总结国内外经验与教训的基础上提出：单方面要求农机服务于农艺的思维已经过时．今后应各自调整、相互适应、相互融合，从而既满足农艺要求又便于机械化，共同为农业生产的综合效益服务．因农业的功能已由农产品生产扩展到有关资源利用、环境保护、生态建设和可持续发展等领域，现代化农业的研究就更需要多学科的通力合作．随着机械化和现代化的发展，上述的各自调整、相互适应将日益迫切．并就如何培育这种学术观念提出了建议．参ｌ关键词：农业机械：农艺：关系

植物4-香豆酸：辅酶A连接酶(4CL)研究进展

Ｋｅｒｓ４ｃｕｒｔ；ｏｎｙｇｓ（Ｃ；ｎｔｎｒｓａｃｒｇｅｓｙｗｏｄ－ｏｍａａｅｅｅｚｍｅａｉａｅ４Ｌ）ｆｃｉ；ｅｅｒｈｐｒｓｌｕｏｏ
４香豆酸：一辅酶Ａ连接酶（Ｃ）木质素生物合成的关４Ｌ是键酶之一，位于苯丙酸途径与木质素特异合成途径的转它折点上。Ｃ４Ｌ催化肉桂酸及其羟基或甲氧基衍生物生成相应的辅酶Ａ酯，些中间产物随后进入苯丙烷类衍生物支这路合成途径［］以前的研究大都集中在各物种的４Ｌ基因１。－２Ｃ及其同工酶基因的发现和表达调控，年来其催化反应和近
现代农业科技
２１００年第８期
农业基础科学
植物４香豆酸：一辅酶Ａ连接酶（Ｃ研究进展４Ｌ）
冯春燕
（京林业大学生物科学与技术学院，京１０８）北北００３
摘要
综述了４香豆酸：酶Ａ连接酶（Ｃ的功能、能与结构的关系及晶体学方面的研究进展，一辅４Ｌ）功以期为４Ｌ蛋白质的结构和功能Ｃ
底物偏好选择的分子机理成为研究热点。目前的研究进展
表达水平在一个生长季节中呈现 “ 峰 ” 式， “ 一强一双模即弱弱一强一弱” 分别在６月底至７月初、，７月底至８月初达到峰值，早材和晚材的形成阶段相符合四４Ｌ基因的表达与。Ｃ

反义4CL与UGPase双价基因在烟草中的转化及表达分析

室保存。
１．２菌株和质粒大肠杆菌ＤＨ５ｏ￣、根癌农杆菌ＬＢＡ４４０４由本实验室保存；质粒ｐＢＵ和ｐＢａ４ＣＬ分别含有来源于紫穗槐的
ＵＧＰａｓｅ基因和４ＣＬ反义基因，由本实验室构建。１．３酶和试剂Ｓａｃｌ、ＥｃｏＲＩ和ＢａｍＨＩ酶均购自宝生物（大连）有限公司：ＤＮＡ片段回收试剂盒购自北京鼎国生物工程公司：Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交试剂￣（ＤＩＧＨｉｇｈＰｒｉｍｅＬａｂｅｌｉｎｇａｎｄＤｅｔｅｃｔｉｏｎＳｔａｒｔｅｒＫｉｔｌ１）购自Ｒｏｃｈｅ生物公司。１．４双价基因植物表达载体构建
－
实验简报－
反义４ＣＬ与ＵＧＰａｓｅ双价基因在烟草中的转化及表达分析
梁海泳，夏秀英，高晓蓉，苏乔
大连理工大学环境与生命学院，大连１１６０２６
摘要构建了携带紫穗槐尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（ＵＤＰ・ｇｌｕｃｏｓｅｐｙｒ０ｐｈ０ｓｐｈ０ｒｙＩａｓｅ，ＵＧＰａｓｅ）基因和４・香豆酸：辅
首先用引物Ｆ１：５ ’ ＡＴＧＣＧＡＧＣＴＣＧＡＴＣＧＴＴＣ．
基金项目：辽宁省博士启动金（Ｎｏ．２００３１０８０）通讯作者。Ｅ－ｍａｉｌ：ｘｉａｘｉｕｙｉｎｇ＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ

毛白杨4-香豆酸：辅酶A连接酶(4CL3)的酶学特征研究

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａｎｅｗ４ＣＬｇｅｎｅｆｒｏｍＰｏｐｕｌｕｓｔｏｍｅｎｔｏｓａＣａｎ．ｗａｓｃｌｏｎｅｄａｎｄｎａｍｅｄａｓ４ＣＬ３．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓｍｅｔｈｏｄ
ｔｉｖｉｔｙｔｏｗａｒｄｓｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｕｂｓｔｒａｔｅ．Ｔｈｅ４ＣＬ３ｐｒｏｔｅｉｎｈａｄｔｈｅｂｉｇｇｅｓｔｅｎｚｙｍａｔｉｃａｃｔｉｖｉｔｙａｔｔｈｅｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｏｆ４０
ＲＡＯＧｕｏ．ｄｏｎｇ＇，ＺＨＡＮＧＹｏｎｇ。ｚｈｕｏ。ＷＥＩＨｏｎｇ — ｙｉ，ＪＩＡＮＧＸｉａｎｇ — ｎｉｎｇ，ＬＵＨａｌ，ＺＨＡＮＧＪｉａｎ — ｇｕｏ
ｗａｓｕｓｅｄｔｏａｎａｌｙｓｉｓｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆｔｈｉｓ４ＣＬ３ｇｅｎｅａｌｉｇｎｉｎｇｗｉｔｈｔｗｏｏｔｈｅｒ４ＣＬｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｔｈｅａｕｔｈｏｒｓｆ０ｕｎｄ
林业科学研究
ＦｏｒｅｓｔＲｅｓｅａｒｃｈ
２０１３，２６（５）：５４２～５４７
文章编号：１００１・１４９８（２０１３）０５－０５４２－０６

植物木质素的合成与调控研究进展

植物木质素的合成与调控研究进展丁霄;曹彩荣;李朋波;吴翠翠;曹美莲;杨六六【摘要】木质素作为植物次生细胞壁的重要组分,分布于输导组织和木质化组织细胞壁中,不仅具有提高细胞壁的隔水性和机械强度,而且在提高植物的抗病抗逆方面也发挥着重要作用.对植物木质素的种类、合成调控和利用基因工程从源头调控植物木质素含量等方面的研究现状进行了概述;随着转基因技术的发展,有望通过更多更有效的途径来改变植物木质素的组成.【期刊名称】《山西农业科学》【年(卷),期】2016(044)009【总页数】6页(P1406-1411)【关键词】木质素;合成与调控;基因工程【作者】丁霄;曹彩荣;李朋波;吴翠翠;曹美莲;杨六六【作者单位】山西省农业科学院棉花研究所,棉花种质资源利用与分子设计育种山西省重点实验室,山西运城044000;山西省农业科学院棉花研究所,棉花种质资源利用与分子设计育种山西省重点实验室,山西运城044000;山西省农业科学院棉花研究所,棉花种质资源利用与分子设计育种山西省重点实验室,山西运城044000;山西省农业科学院棉花研究所,棉花种质资源利用与分子设计育种山西省重点实验室,山西运城044000;山西省农业科学院棉花研究所,棉花种质资源利用与分子设计育种山西省重点实验室,山西运城044000;山西省农业科学院棉花研究所,棉花种质资源利用与分子设计育种山西省重点实验室,山西运城044000【正文语种】中文【中图分类】Q943.2木质素是植物经类苯丙酸途径合成的单体经进一步分化形成的3个苯丙烷衍生物通过化学键聚合而成的高分子化合物[1]。

其大量存在于植物的木质部纤维素纤维之间，通过形成交织网来硬化细胞壁，能够使木质部维持极高的硬度，以形成植株的形态，承载整株植物的重量，并形成较强的抗压能力，因此，木质素在维管植物的进化中发挥着重要作用[2]。

在木本植物中，木质素占25%～30%；在草本植物中，木质素占16%；在自然界有机物中的含量仅次于纤维素，是植物转化太阳能形成的重要有机物之一[3]。

龙眼体胚发生早期4CL基因家族鉴定与功能分析

热带作物学报2021, 42(4): 909 919Chinese Journal of Tropical Crops龙眼体胚发生早期4CL基因家族鉴定与功能分析洪平静，徐小萍，王静宇，陈晓慧，申序，林玉玲，赖钟雄*福建农林大学园艺植物生物工程研究所，福建福州 350002摘要：为了解龙眼4-香豆酸：辅酶A连接酶（Dl4CL）基因家族的分子特性及生物学功能。

采用生物信息学分析方法进行龙眼4CL基因家族的成员鉴定，蛋白结构域及特性、分子进化树、体胚发生过程和组织器官中的表达规律分析以及可能互作的miRNA预测。

结果显示，Dl4CL基因家族包含43个成员，分为6个亚家族；不同亚家族成员的基本理化性质包括等电点、相对分子量、氨基酸个数及信号肽有所差别；Dl4CL蛋白均属于非分泌型蛋白，具有多个保守的motif；各成员基因结构特性与进化树中家族成员亲缘关系的远近有关；Dl4CL启动子序列包含大量光响应元件、厌氧诱导响应元件及MYB结合位点，推测Dl4CL家族成员可能参与龙眼生长发育过程中黄酮类物种的生物合成以及色素的积累；Dl4CL可能参与不同胚胎发育过程和不同组织器官的形态建成；43个Dl4CL成员共有10个受miRNA调控，并且不同成员受不同的miRNA靶向调控，推测Dl4CL可能通过与miRNA互作参与体胚发生、响应环境胁迫等过程。

研究表明，Dl4CL在龙眼体胚发生早期除了参与木质素的合成之外，还可能参与色素合成、组织器官特异表达等多种生物代谢途径，表现其生物学功能的复杂性。

关键词：龙眼；4CL基因家族；基因鉴定；功能分析中图分类号：S667.2 文献标识码：AIdentification and Functional Analysis of 4CL Gene Family During Early Somatic Embryogenesis in Dimocarpus longan Lour.HONG Pingjing, XU Xiaoping, WANG Jingyu, CHEN Xiaohui, SHEN Xu, LIN Yuling, LAI Zhongxiong* Institute of Horticultural Biotechnology, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, Fujian 350002, ChinaAbstract: To understand the molecular characteristics and biological functions of the 4-coumarate: coenzyme A ligase (Dl4CL) gene family in Dimocarpus longan Lour., bioinformatics analysis was used to identify the members of the 4CL gene family of longan, to analyse the protein domain and characteristics, molecular evolutionary tree, expression pat-terns in somatic embryogenesis and tissue-organ, and to predict the possible interaction of miRNAs. There were 43 members of the Dl4CL gene family, which could be divided into six subfamilies. The basic physical and chemical prop-erties of different subfamilies including isoelectric point, relative molecular weight, amino acid number and signal pep-tide were different. Dl4CL proteins belonged to the non-secretory pathway, there were multiple conserved motifs. The structural characteristics of the genes were related to the kinship of family members in the evolutionary tree. The Dl4CL promoter sequence contained a large number of light responses elements, anaerobic induction response elements, and MYB binding sites, which suggesting that the Dl4CL gene family may be involved in the biosynthesis of flavonoids and the accumulation of pigments during the growth and development of longan. Dl4CL gene family might be involved in different somatic embryogenesis process and tissue-organ morphogenesis. A total of 10 Dl4CL members were likely to be regulated by miRNA, and different members were targeted by different miRNA, it was speculated that Dl4CL may interact with miRNA regulation process to participate in somatic embryogenesis, response to environmental stress and other biological processes. This study shows that Dl4CL might not only participate in lignin synthesis, but also partici-收稿日期 2020-04-22；修回日期 2020-05-11基金项目国家自然科学基金项目（No. 31572088）；福建省高原学科建设经费项目（No. 102/71201801101）；福建农林大学科技创新专项基金项目（No. CXZX2017314）。

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植物4-香豆酸:辅酶A连接酶(4CL)研究进展摘要综述了4-香豆酸:辅酶A连接酶(4CL)的功能、功能与结构的关系及晶体学方面的研究进展,以期为4CL蛋白质的结构和功能的进一步研究提供依据。

关键词4-香豆酸;辅酶A连接酶;功能;研究进展ResearchProgresson4-Coumarate:CoenzymeALigase (4CL) ofPlantsFENG Chun-yan(College of Biological Science and Biotechnology,Beijing Forestry University,Beijing 100083)AbstractIn this paper,the research progress of 4-coumarate:coenzyme A ligase(4CL)was overviewed,containing function,relationship between function and structure,and crystallography. It would provide evidence for further study on the structure and function of 4CL proteins.Key words4-coumarate;coenzyme a ligase(4CL);function;research progress4-香豆酸:辅酶A连接酶(4CL)是木质素生物合成的关键酶之一,它位于苯丙酸途径与木质素特异合成途径的转折点上。

4CL催化肉桂酸及其羟基或甲氧基衍生物生成相应的辅酶A酯,这些中间产物随后进入苯丙烷类衍生物支路合成途径[1-2]。

以前的研究大都集中在各物种的4CL基因及其同工酶基因的发现和表达调控,近年来其催化反应和底物偏好选择的分子机理成为研究热点。

目前的研究进展主要是通过研究功能域氨基酸位点的突变体酶蛋白的体外功能和蛋白质晶体结构模型,提出可能的分子机理。

14CL蛋白的功能研究4CL蛋白的研究在20世纪70年代初就已经开始,最初的研究工作主要集中在分离纯化植物中的4CL蛋白酶,并对提取的天然4CL蛋白酶进行生化特性研究方面。

到目前为止,已从大豆、欧芹、云杉、杨树、水稻、丝瓜、刺槐等多种植物中纯化或部分纯化出了4CL蛋白。

随着越来越多植物的4CL基因被发现,人们发现这些植物基因组中4CL基因一般以小的基因家族的形式存在,家族内不同成员可能在苯丙烷类代谢不同分支代谢途径中起作用。

同时人们发现4CL基因是组织特异性表达基因,同一物种中4CL基因家族中不同成员的表达表现出器官、组织和细胞的特异性,这可能与不同成员参与不同的分支途径有关。

如美洲山杨含有结构上和功能上均不同的2个4CL基因Pt4CL1和Pt4CL2,二者差异表达以调控不同的苯丙烷类衍生物的生物合成,它们参与不同的生理功能[3],Pt4CL1在正在发育的木质部组织参与木质素生物合成,而Pt4CL2在表皮细胞中参与其他酚类化合物如类黄酮的生物合成。

人们也对4CL基因的表达调控作了大量的研究。

与植物次生代谢途径中的大多数酶类一样,4CL基因也属于调控基因。

其表达主要受发育的调控,4CL基因在植物生命世代中很早即开始表达。

拟南芥4CL基因在苗期阶段即被活化,拟南芥发芽后2~3 d,4CL基因即开始表达,其活性与子叶和根部木质素沉积的起始密切相关[4]。

毛白杨4CL基因的表达水平在一个生长季节中呈现“双峰”模式,即“弱—强—弱—强—弱”,分别在6月底至7月初、7月底至8月初达到峰值,与早材和晚材的形成阶段相符合[5]。

4CL基因的表达还能被许多环境因子激活,如各种伤害、病原菌侵染、紫外线辐射等。

4CL基因家族的不同成员对于各种环境因子的反应差异说明其在苯丙烷类衍生物代谢中具有不同的功能。

24CL蛋白的结构和功能的关系通过对几种植物的4CL蛋白的氨基酸序列进行同源比对分析结果发现:4CL 蛋白质归类为2组,组I和组II。

拟南芥At4CL1、At4CL2,杂种杨Ptd4CL1、Ptd4CL2和Pt4CL1归类为组I,拟南芥At4CL3及杨树Pt4CL2归类为组II。

组I内蛋白质相互之间的关系比其与组II来自同一种植物的蛋白质之间的关系更为接近,反之亦然(反之亦然)。

组II内拟南芥、杨树和大豆的4CLs主要伴随着类黄酮的生物合成,而组I内的4CLs更为主要地伴随木质素以及其他苯丙烷类衍生物的生物合成。

对4CL蛋白质序列的比对分析还表明,在所有已知的4CL氨基酸序列中存在几个保守的肽基序(motif)。

肽基序Box I、SSGTTGLPKGV在4CL蛋白质序列中几乎绝对保守,而且与荧光素酶、长链脂肪酰基-CoA合成酶、肽合成酶中发现的保守基序相似。

肽基序Box II、GEICIRG在所有4CL中绝对保守,其中心的C残基被认为直接参与催化进程[6]。

Schneider等[7]基于短杆菌肽S-合成酶PheA(Phenyla-lanine-activating)的晶体数据,分子模建了拟南芥At4CL2的蛋白质模型,鉴定了参与At4CL2 SBP的12个氨基酸残基,创造了“功能的获得”(Gain-of-function)突变体,通过增加SBP的空间大小产生了具有转化阿魏酸和芥子酸能力的At4CL2突变体,而通过增加SBP的疏水性导致具有强烈增强的肉桂酸转化的At4CL2突变体。

上述研究结果对于更好地理解苯丙烷类衍生物途径中关键酶的催化过程,对于设计具有新的底物特异性的4CL突变体有很好的帮助。

但这些都没有从根本上揭示4CL同工酶的底物特异性和偏好性的分子机制。

要阐明4CL蛋白的催化机制,最佳方法就是获得4CL蛋白的晶体,并通过X-衍射收集4CL晶体的结构数据,解析4CL蛋白的原子结构,从而更好地解释4CL蛋白的结构与功能的关系。

34CL蛋白晶体学研究现状3.1晶体生长的基本原理和方法蛋白质晶体生长的基本原理是指蛋白质溶液在过饱和状态下,蛋白质在固相沉积的速率大于离开固相进入液相的速率时,溶液中蛋白质分子就会自我聚集成核,在合适的条件下,形成的晶核发育成蛋白质晶体。

蛋白质晶体通常在过饱和状态下出现,蛋白质能达到过饱和状态而不是在达到饱和态就立即沉淀或者结晶出来,主要是因为蛋白质结晶也有类似于化学反应的能垒,成核是一个高能态,使得蛋白质成核过程较慢。

能垒越高,蛋白质形成临界核的速度就越慢,过饱和状态就越容易维持。

同时蛋白质溶液过饱和状态越高,蛋白质形成临界核的可能性就越大。

结晶的方法分为4种:批量结晶、蒸发结晶、液液扩散结晶和透析结晶[8]。

3.2蛋白质晶体解析方法蛋白质空间结构与其生物活性的关系是结构生物学的核心。

空间结构对酶的功能至关重要,即使极其细微的扰乱也会导致酶活力的丧失。

结构与功能关系的研究,一直是蛋白质研究的核心问题之一。

1960年Max Perutz解析出了第1个蛋白质结构——血红蛋白质的三维结构。

这之后蛋白质结构解析工作逐渐开展起来[9]。

蛋白质晶体结构测定可以提供原子(或接近)分辨率的三维精细结构。

经过修正的高于1■分辨率的蛋白质结构,可以确定其结构中的原子的空间坐标及原子之间的关系(如氢键)、结构表面及内部的溶剂分布,以及分子柔性或运动的变化[10]。

目前,可用于完整、准确、实时测定生物大分子三维结构的主要方法包括:X射线晶体结构分析、多维核磁共振(NMR)波谱解析和电子显微镜二维晶体三维重构(电子晶体学,EC)。

3.3蛋白质结晶影响因素X射线衍射是确定所有分子三维空间结构最可靠的方法之一,而获得合适的晶体是进行X射线衍射的基本前题。

结构测定往往由于得不到高质量的晶体而受到阻碍。

蛋白质结晶的影响因素有:结晶蛋白质的纯度、过饱和度、温度、pH 值、结晶剂、压力、外加物理场,其他因素包括:蛋白质结晶液的浓度、蛋白质的来源、细菌及真菌引起的污染程度、样品体积及氧化—还原环境等。

对于蛋白质的结晶,结晶剂的作用主要在于对溶剂产生影响而对蛋白质分子不产生影响。

一般来说,结晶剂主要有盐类,如磷酸盐、硫酸盐等,以及高分子直链聚合物,如PEG 等。

新近发展的高通量蛋白质结晶技术,可以同时进行数千个蛋白质结晶条件实验,大大减少了优化结晶条件的时间,加速了蛋白质结构研究的速度[11]。

近几年来,国际上有几个实验室同时对4CL的结构及其功能关系进行深入地研究,获得了一系列有关4CL蛋白晶体结构与功能之间关系的信息。

但到目前为止,没有获得任何一个物种的4CL蛋白晶体的三维结构。

4存在问题与展望早在20世纪70年代初,4CL蛋白的研究就已经开始进行,已发现近40个4CL 蛋白家族成员,但至今为止,整个家族没有任何一个物种的4CL蛋白的三维结构被解析,所有的分子机理都是从侧面提出,其三维结构的获得成为当前4CL研究中的一个难点,国内外多个研究组都在努力去解析其三维结构。

毛白杨I型4CL1母体蛋白的晶体获得及优化的研究,为最终获得高质量的衍射单晶提供了可能,为整个4CL家族的第一个代表性结构,并能从分子水平上阐明其催化反应和底物偏好选择的分子机理,将为4CL蛋白参与的生物代谢途径的改造提供理论依据。

特别是为现有的植物中木质素生物合成和黄酮的生物合成提供直接的理论依据,因而在苯丙烷类化合物的生物合成中具有极大的应用价值。

5参考文献[1] WHETTEN R,SEDEROFF R.Lignin Biosynthesis[J].Plant Cell,1995,7(7):1001-1013.[2] DUTHIE G,CROZIER A.Plant-derived phenolic antioxidants[J].Curr Opin Clin Nutr Metab Care 2000,3(6): 447-51.[3] HU W J,AKWAOKA A,TSAI C J,et partmentalized expression of two structurally and functionally distinct 4-coumarate:CoA ligase genes in aspen(Populus tremuloides)[J].Proc Natl Acad Sci USA,1998,5(9):5407-5412.[4] LEE D,ELLARD M,WANNER L A,et al.The Arabidopsis thaliana 4-coumarate:CoA ligase(4CL)gene:stress and developmentally regulated expression and nucleotide sequence of its cDNA[J].Plant Mol Biol,1995,28(5):871-84.[5] 赵艳玲,陆海,陶霞娟,等.GRP1.8融合反义4CL1基因调控烟草木质素生物合成[J].北京林业大学学报,2003(4):16-20.[6] STUIBLE H P,KOMBRINK E.Identification of the substrate specificity-conferring amino acid residues of 4-coumarate:Coenzyme A ligase allows the rational design of mutant enzymes with new catalytic properties[J].J.Biol Chem,2001(276):26893-26897.[7] SCHNEIDER K,HOVEL K,WITZEL K,et al.The substrate specificity-determining amino acid code of 4-coumarate:CoA ligase.Proc[J].Natl Acad Sci,2003,100(14):8601-8606.[8] 王弘,于淑娟,高大维.蛋白质大分子的结晶[J].生命的化学,2001,21(5):429-431.[9] 饶子和.发展我国结构生物学的建议[J].中国科学院院刊,1996(3):158-161.[10] 王大成.结构生物学研究的一些新进展[J].生物化学与生物物理进展,1998,25(5):396-403.[11] 赵卫光,李正名,王宝雷,等.高通量蛋白质结晶及其在药物设计中的应用[J].化学进展,2004,16(1):105-109.。