第三章突变的应用微生物遗传育种

二、诱变育种方案的设计
➢ 制定明确的选育目标：一次诱变目标不可太高太 多；
➢ 建立可行的筛选方法：关键问题是确立一种测定 产物的方法；
➢ 确定诱变筛选流程：是诱变育种工作方案设计的 中心内容。对于既往诱变史较少的低产菌株，采 用一次高效法有利于提高育种工作的进度；而对 于已进行多次诱变处理的高产菌株，多步积累法 优于一次高效法。
突变菌株
突变型
产量(mg/ml)
钝齿棒杆菌 钝齿棒杆菌 钝齿棒杆菌
HseThr Thr - +Met -
17.93 2.33 2.00
钝齿棒杆菌 AECr
20.0
AECr, Hse-
50.0
北京棒杆菌 Hse-
36.6
Hse-,AECr
45.0
二、营养缺陷型的筛选
➢ 诱变处理：同前 ➢ 后培养：在CM中进行，消除突变细胞的表型
➢ 根据形态变异淘汰低产菌株或筛选高产菌 株；
➢ 根据平皿反应淘汰低产菌株或直接挑取高 产菌株
2.筛选：包括初筛，复筛和终筛等。
➢明确筛选目标：产量突变还是其它突变型；产 量准备提高多少等；
❖一次诱变目标不要太高。
➢制定筛选方案：筛选准备分几步；筛选采用的 培养方法和培养条件；每一步准备筛选多少菌株； 每一步准备采用的分析方法等。
➢ 尽量选择既往诱变史少的高产菌株： 由 自然界分离获得的野生型菌株，突变可 能性较大;经自然分离的生产菌株，对生 产环境适应，又具野生型特性，也是良 好的出发菌株;经过诱变改造的菌株，负 突变可能性较大，可结合其它育种方法 改变其遗传保守性
（一）出发菌株的选择
➢ 挑选纯系（遗传纯）菌株：避免使用丝 状真菌菌丝体（异核体）；要尽量选择 单倍体单核细胞（孢子），以减少诱变 菌的分离延迟（结合诱变剂选择）
与营养要求有关的三种遗传型
基本培养基MM
完全培养基CM 或补充培养基MM+A、MM+B
诱变
野生型[A+B+]
营养缺陷型[A+B-]或[A-B+]
原养型[A+B+]
回复突变或重组
（二）营养缺陷型突变株的应用
➢ 科研上： ❖ 研究代谢途径； ❖ 基因重组的遗传标记菌种； ❖ AA、碱基、维生素生物测定的试验菌种 ➢ 生产上： ❖ 氨基酸，核苷酸等发酵产品生产菌种的代
➢ 复筛时量的矛盾已不突出，而对准确性有了更高的 要求，因此复筛一般要培养2~3瓶，分析方法一般 选用经典方法或标准方法，有时要进行几次复筛。
筛选的一般步骤
1株出发菌株 ↓诱变处理 400个单细胞菌株 ↓初筛每株1瓶 80株 ↓复筛每株三瓶 16株 ↓复筛，三种工艺条件，每株各三瓶 3株（对应于不同工艺条件） ↓ 供生产或再次诱变使用
四、诱变育种工作中应注意的问题
➢ 安全问题：各种诱变剂几乎都有致癌作用， 因此在操作中应时刻注意安全问题：个人安 全和环境安全。
❖ 个人安全：操作时注意防护，不同诱变剂要 求不同防护方法，如γ-射线辐射防护要求较 高，uv要求较低，而化学诱变剂则要求不与 身体有关部位直接接触；
❖ 环境安全：所用物品要经解毒处理；液体经 解毒或充分稀释才可以排放。
三、诱变育种的一般步骤
出发菌株 ↓纯化、活化、前培养（同步培养） 培养液 ↓离心收集细胞、洗涤，制备均一的菌悬液（玻璃株打散、过滤） 单细胞或单孢子悬液 ↓活菌计数，诱变预备试验 诱变处理 ↓活细胞计数，致死率计算 后培养（中间培养） ↓ 平板分离 ↓变异率计算 初筛→复筛→ 保藏及扩大试验
（一）出发菌株的选择
复，染色体畸变、移码等不易回复 ➢ 对一些既往诱变史少的低产或野生菌株，uv线往往
是首选；对于经多次诱变处理的菌株，常需要能诱发 染色体发生重排等较大损伤的强辐射进行处理。 ➢ 结合细胞的透性和生理状态进行选择 ➢ 经常变换诱变剂或复合处理
2.诱变剂量的选择
➢高产菌株在低剂量时效果较好，而对多核细胞、孢子、 低产菌株或质量性状处理剂量不宜过低。 ➢经多次诱变处理已钝化的菌株可用一次高剂量处理来 激活；一次较高剂量的强诱变后，通常接着进行2~3次 较低剂量的温和诱变，以利于菌株遗传性状的稳定。 ➢在一次诱变中，可以分别采用不同剂量处理出发菌株， 从中选出最佳剂量
一、营养缺陷型及其应用ห้องสมุดไป่ตู้
➢ 营养缺陷型（auxotroph）：是指丧失了合成一 种或多种必需生长因子能力的菌株，它们只能在 补充了相应的生长因子的培养基上才能正常生长。
➢ 野生型（wild type)：从自然界分离到的任何微 生物在其发生营养缺陷突变前的原始菌株，均称 该微生物的野生型。
➢ 原养型（prototroph) ：营养缺陷型突变株经回 复突变或重组后产生的、其营养要求在表型上与 野生型相同的菌株。
诱变剂量的控制方法
化学诱变剂：诱变剂的浓度、处理时间和处理条件； 物理诱变剂：照射距离、照射时间和照射条件
形态突变型 负突变型 正突变型
X-射线的照射剂量与亚热带链霉菌白霉素高产菌株39#变 异的关系
紫外线照射剂量与龟裂链霉菌土霉素高产菌株293#变异 的关系
3. 处理方法
➢ 单一诱变剂处理;
谢调控育种； ❖ 生产菌株杂交育种的亲本进行遗传标记
营养缺陷型突变株在代谢调控育种中的应用
➢ 阻断代谢途径，积累中间代谢产物
例：利用谷氨酸棒杆菌的精氨酸缺陷型积累鸟 氨酸
谷氨酸
N-乙酰 谷氨酸
鸟氨酸
瓜氨酸
精氨酰 琥珀酸
精氨酸
营养缺陷
反馈抑制
➢阻断分支代谢，积累另一终端代谢产物 例：利用XMP- 生产 AMP
延迟（生理性延迟和分离延迟） ➢ 饥饿培养：洗涤后用无氮基本培养基培养4~6
制定筛选方案时的一些基本原则
➢ 筛选菌株的量要根据实验室的人力物力条件而定；
➢ 初筛的目的是将大多数未变异菌株或负变菌株去除， 这时解决的主要是量的问题，因此每株菌培养时一 般只在一种培养条件下培养一瓶；培养条件一般沿 用出发菌株的培养条件，分析方法也选用适于处理 大量样本的、操作简便而快速的方法，如HPLC, GC， 比色法等（分析方法的精确性可以稍差一些）。
➢ 调节适当的细胞或孢子密度
酵母细胞、霉菌孢子：106~107个/ml； 细菌细胞、放线菌孢子：108个/ml ✓ 估计：血球计数板计数或OD法 计数：平板菌落计数
（四）诱变处理
1.诱变剂的选择 ➢ 在不影响诱变效果的前提下，尽量选择毒性小、易于
防护、安全性强的诱变剂； ➢ 尽量选择操作简便易行、便宜易得的诱变剂； ➢ 尽量选择不易发生回复突变的诱变剂：碱基置换易回
➢ 选择对诱变剂敏感的菌株：选择一些增 变突变株
➢ 采用多出发菌株
➢ 更换出发菌株
➢ 具有特定生产性状的可能性：要确有特 定物的代谢途径
（二）前培养
➢ 前培养的目的：
对数中后期：生长旺盛，细胞浓度较高，对诱 变剂敏感；
同步培养物：诱变剂处理时，群体中变化一致； 细胞内应具有丰富的内源性碱基：DNA被诱变
紫外线的剂量（erg/mm2）： 3, 4-2000；5, 6-4000； 7, 8-6000；9, 10-10000
3. 处理方法
➢ 直接处理：在缓冲液或无菌生理盐水体系中 对出发菌株进行诱变处理，然后涂平板分离 突变株；
➢ 生长过程处理：在摇瓶培养基或固体平板中 加入诱变剂，在菌体生长时进行诱变处理。 （适用？）
剂作用后所造成的损伤能快速通过复制而形成 突变，可以获得较高的突变率。
➢ 前培养的培养基：嘌呤、嘧啶碱基含量要丰
富
（二）前培养
➢ 丝状真菌的前培养
产孢子真菌一般采用其孢子进行诱变，为提高 其对诱变剂敏感性，可以将其同步培养至孢子 刚萌发的高生理活性状态（芽管的长度相当于 孢子直径的0.5~1倍）；
不产孢子的真菌可以采用年幼的菌丝体进行诱 变处理（对尖端菌丝、单菌落边缘菌丝或小段 菌丝悬浮液进行诱变处理）
（三）菌悬液的制备
➢ 选择合适的介质：物理诱变常采用生理盐水作分
散介质，而化学诱变则需要用缓冲液作介质。
➢ 使细胞或孢子要处于良好的分散状态：利于与 诱变剂解除；便于筛选
玻璃株打散，脱脂棉或擦镜纸（双层）过滤
➢ 复合处理：两种或两种以上诱变剂同时处理、 不同的诱变剂交替处理、同一诱变剂连续处理 以及紫外线与光复活交替处理等( 注意！)
突变率/ %
20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
试验号
乙烯亚胺与紫外线复合诱变处理结果
1- 对照； 2-乙烯亚胺（浓度1:7000）； 3, 5, 7, 9-紫外线； 4, 6, 8, 10-乙烯亚胺加紫外线
（五）后培养
后培养：将诱变处理过的细胞在营养丰富的 培养基中进行培养，使突变基因稳定、纯 合并表达。 ➢ 目的：消除表型延迟 ➢ 后培养培养基：营养要求丰富，酪素水解 液(或蛋白胨)可提供大量氨基酸，酵母膏 可提供各种生长因子。
（六）变异菌株的分离及筛选
1.变异株的分离：多为平板分离，结合快速 检出法（平板预筛）
➢ 完全培养基 Complete Medium （CM）含有满 足某微生物的所有营养缺陷型和野生型菌株生长 所需营养物质的天然或半合成培养基。
➢ 基本培养基Minimal Medium（MM）：不含生 长因子仅能满足某微生物的野生型菌株生长需要 的最低成分合成培养基。
➢ 补充培养基Supplemented Medium(SM)：补充 了一种或数种生长因子，以满足某微生物的特定 的营养缺陷型生长的培养基，其中的生长因子多 是通过直接添加AA、碱基或维生素而提供。
➢ 工业与工程需求：发酵工业尤其是抗生素工业生 产菌株选育工作的需要；
➢ 理论与技术基础：Thom和Steinberg（1939）用X 射线在真菌中首次诱发基因突变成功；