5_氮杂胞苷对小麦生长发育及DNA甲基化的影响

第41卷第1期河南大学学报(自然科学版)Vol.41　No.1 2011年1月Journal of Henan University(Natural Science)Jan.201152氮杂胞苷对小麦生长发育及DNA甲基化的影响陈芳,王子成3(河南大学生命科学学院农业生物技术研究所,河南开封475004)摘　要:以小麦(T riticum aestivum L.)品种周98165为材料,对52azaC处理前后的幼苗形态及生长指标进行了研究,并采用A FL P和MSA P技术对其遗传稳定性和DNA甲基化变化作了初步探讨.结果表明,一定浓度(5～50μmol/L)的52azaC不仅能使小麦的分蘖能力有所提高,而且还影响抽穗和花期、千粒重等指标,100μmol/L以上的52azaC对小麦根和苗的生长有显著的抑制效应.A FL P分析表明,不同浓度52azaC处理之间未见明显差异片段, 52azaC处理过程中材料基因组碱基序列保持一致,未发生变异.运用MSA P技术分析了52azaC处理前后样品的甲基化水平,与对照相比,52azaC处理后的材料均产生了不同程度的甲基化变化,其中去甲基化条带占总变异带的60%以上.DNA去甲基化的程度随52azaC剂量的增大而提高,且不同浓度处理引起的甲基化变化的模式基本一致.关键词:小麦;52氮杂胞苷;A FL P;MSA P;甲基化变化;生长发育;产量中图分类号:Q945;Q946 文献标志码:A文章编号:1003-4978(2011)01-0061-06E ffects of52azaC on Development and D NA Methylation in WheatC H EN Fang,WAN G Zi2cheng3(I nstitute of A g ricultural B iotechnology,College of L i f e Science,Henan Universit y,Henan Kai f eng475004,China)Abstract:Seedling morphogenesis and growth indexes after52azaC treatment of wheat cultivars were studied, meanwhile genetic stability and DNA methylation variation of the samples were initially researched by A FL P and MSA P.The results showed that not only the tiller ability of wheat was promoted,but also other growth indexes such as heading and anthesis time,10002grain weight were affected by5～50μmol/L52azaC.Nevertheless the growth of wheat’s roots and seedlings were all significantly inhibited by52azaC over100μmol/L.No polymorphic bands were found among different samples with52azaC by A FL P analysis.The results revealed that no nucleotide sequence had altered during52azaC treatment.The DNA methylation status of samples was analysed by MSA paired to the control,some methylation alterations were found in the samples after52azaC treatment.The DNA demethylation bands were over60%of the total variation fragment.It is clear that the main role of52azaC is to make DNA methylation decrease.The level of DNA demethylation was increasing when52azaC concentration was added.Demethylation levels increased with52azaC concentration,meanwhile,the patterns of methylation variation were consistent in different treatments.K ey w ords:wheat;52azaC;A FL P;MSA P;methylation variation;development;production DNA甲基化(DNA met hylation)是生物基因组遗传信息的重要组成部分,是重要的表观遗传信号.在植物发育和分化过程中DNA甲基化是控制基因表达的一种调控机制,甲基化水平的变化会影响植物的表型变化[1].一些表观变异,可传递给后代[224],花期和株高[5]、抗病性[6]和产量[7]等一些重要的农艺性状也可受DNA甲基化变化的影响,并且甲基化多态性所产生的某些表型变异可为育种选择提供原料.DNA甲基　收稿日期:2010209208　基金项目:河南大学校内基金重点资助项目(06ZDZR011)　作者简介:陈芳(1975-),女,河南开封人,硕士研究生.研究方向:植物表观遗传学.　3通讯作者,E2mail:wzc@　河南大学学报(自然科学版),2011年,第41卷第1期62化抑制剂52氮杂胞苷(52azaC)和52氮脱氧胞嘧啶核苷(azadC)是一类能使基因组甲基化水平降低的碱基类似物,已广泛用于调节植物DNA甲基化水平,进行植物生长发育调控等方面的研究.在一些植物中,如亚麻[5]、水稻[6]等,利用DNA甲基化抑制剂已诱导出了表型或发育异常的植株,且这些变化同已变化的甲基化状态可传递给后代.甲基化抑制剂处理植株后,整体甲基化水平降低,诱导一些有益的新性状如亚麻的矮化和早熟[5],水稻白叶枯病抗性[6]等可用于育种,并产生一定的生产和社会效益.目前涉及甲基化研究的植物有水稻[6,8]、亚麻[5,9]、拟南芥[10]、小麦[11]等.小麦(T riticum aesti v um L.)是我国重要的粮食作物,有研究表明去甲基化试剂处理可以部分地代替低温春化处理促进小麦开花[11],但对小麦其他性状,尤其是产量性状有什么影响还缺乏研究.目前,DNA甲基化修饰在小麦育种的研究还未见报道.本研究以小麦为材料,对甲基化抑制剂52azaC对小麦生长发育和DNA甲基化的影响进行了一些探索,以期为利用表观遗传学的手段研究小麦育种及生产提供一定的依据.1　材料和方法1.1　材料研究材料为小麦(T riticum aesti v um L.)品种周98165.1.2　方法1.2.1　小麦的培养小麦种子用75%的酒精消毒后用无菌水浸泡数小时,当小麦露嘴时,移入铺有两层滤纸的培养皿中,置光照培养箱中培养.培养条件:温度(22±1)℃,湿度70%,光照时间12h/d,光照强度40μmol・m-2・s-1.1.2.2　甲基化抑制剂处理分别用0.5、1、5、10、50、100、500、1000μmol/L的52azaC处理小麦幼苗,同时设1个空白(蒸馏水处理)对照组,共9个处理,每个处理设3个重复.每次每个培养皿加入5mL52azaC溶液,每2d换一次溶液,10d 后每个处理随机取10株幼苗嫩叶混合提取DNA,其余麦苗移载大田并观察田间生长情况.1.2.3　分子标记检测遗传变异情况采用C TAB法提取小麦嫩叶DNA,参照Micheli等[12]方法.A FL P分析参照Hao Y J等[13]的方法,略有不同.EcoR I/Mse I酶切分步进行:20μL体系含200ng DNA和3U EcoR I,37℃酶切8h,沉淀DNA,抽干,加10μL无菌双蒸水溶解,随后加入3U Mse I,2μL10×buffer(100mmol/L Tris2HCl,p H7.5;100 mmol/L MgCl2和10mmol/L dit hiot hreitol),无菌双蒸水补足20μL,65℃酶切8h.连接:EcoR I接头, Mse I接头,T4连接酶,25℃连接2.5h.预扩:引物为E2A、M2C,Taq酶,扩增2h;7对引物组合用于A FL P 选扩.选扩产物94℃变性5min后上样于6%PA GE,恒功率55W电泳2.5h,固定、银染漂洗与显色后拍照并分析结果.MSA P分析参照Cervera等[14]方法.与前面A FL P方法类似,其中内切酶组合为EcoR I/H a p II和EcoR I/Ms p I.接头为EcoR I接头和H2M接头,预扩引物为E2A和H a p II2Ms p I,选扩引物组合10对.2种分子标记检测所用的接头及引物来自上海生工公司,详见文献[15]中的表1.1.3　数据分析采用软件SPSS10.0多重比较,Origin7.5作图.2　结果与分析2.1　52azaC对小麦幼苗生长的影响不同浓度的52azaC对萌发的小麦幼苗处理10d后发现,3个较高浓度(100、500、1000μmol/L)处理不仅对小麦幼苗根系生长有显著抑制效应,也影响地上部的生长(图1).低浓度(50μmol/L以下)52azaC处理的根和苗的生长情况与对照类似,初生根数基本与对照(6个)一致.经500、1000μmol/L处理的幼苗根系不发达,根长不到对照的1/3,且初生根明显减少,分别为4-5、3-4个.总之,较高浓度的52azaC具有抑制根和苗生长的作用,当浓度大于50μmol/L时,根和苗的长度随处理浓度的增加而降低,与对照相比差异显著(图1).当52azaC浓度达到1000μmol/L时,虽未见有枯萎及致死现象,但根长仅为2.4cm,相当于对照萌发4d时根的长度,株高为5.60cm,明显低于对照(7.82cm)及其他处理,且95%以上的苗初生根只有3陈芳,等:52氮杂胞苷对小麦生长发育及DNA甲基化的影响63-4个.2.2　52azaC对小麦主要生长和产量性状的影响2.2.1　52azaC对小麦抽穗和花期的影响经不同浓度52azaC处理过的小麦植株,移栽至大田后至生育后期发现处理组和对照组的抽穗和开花时间有差异,其差异程度主要受52azaC浓度的影响(图2).当52azaC处理浓度低于1μmol/L时,处理组的抽穗和开花时间与对照组相比没有明显区别;当浓度为5～100μmol/L时,则处理组抽穗和开花时间比对照组早1d以上.其中,浓度在50μmol/L时抽穗和开花时间均比对照组提前3d,其成熟期也相应提前.而浓度增大到500μmol/L以上时,则二者差异并不显著.图　1　不同浓度52azaC处理10d对小麦幼苗生长的影响Fig.1　Effects of differernt concentrations of52azaC treated for10days on wheat seedlingsgrowth图2　不同浓度52azaC对小麦抽穗和花期的影响Fig.2　Effects of different concentrations of52azaC on wheat heading and anthesis time2.2.2　52azaC对小麦有关产量指标的影响田间观察表明,在整个生育期间,处理组与对照组都能正常生长发育,其叶形、叶色、穗形、籽粒颜色等农艺性状基本一致.不同浓度52azaC处理过的植株的分蘖数均明显高于对照(0.5μmol/L除外),且52azaC浓度为50μmol/L和100μmol/L时小麦的分蘖数和分蘖率最大(表1).与对照相比,5、10、50μmol/L处理植株的株高和千粒重都有所增加,且差异显著,以50μmol/L处理植株的株高最高(表1).浓度为100μmol/L 时,株高与对照无显著差别,但千粒重最大,明显高于对照.穗长和穗粒数各处理间变化不大.表1　不同浓度52azaC处理对小麦生长和产量性状的影响Tab.1　Effects of different concentrations of52azaC on wheat growth and production characters 处理浓度/(μmol・L-1)分蘖数分蘖率/%株高/cm穗长/cm穗粒数千粒重/g0 2.6±0.2476.051.0±1.058.4±0.2057.7±1.6649.9±0.560.5 2.6±0.2178.453.2±0.848.2±0.1357.3±0.9349.0±0.17132.9±0.1685.153.5±0.908.6±0.1554.3±2.6851.0±0.48533.1±0.2088.4355.7±1.008.8±0.2054.7±1.61352.7±0.29 1033.1±0.2288.2355.6±0.708.7±0.1957.7±1.75352.5±0.15 5033.2±0.1595.6360.0±0.908.7±0.1558.1±1.19353.3±0.36 10033.2±0.1791.254.8±0.758.6±0.1058.3±2.38353.8±0.47 50033.1±0.1889.953.8±0.958.5±0.1457.4±2.3751.5±0.23 100033.0±0.2576.152.0±0.878.5±0.2152.7±1.4050.2±0.51表示与对照相比有显著性差异α=5%;分蘖率=分蘖的植株数/全部植株数×100%2.3　基因组序列的A FL P检测结果选用7对引物组合对52azaC不同浓度处理的9个样品进行扩增,均能扩增出清晰的条带,共扩增出2930条可统计条带,平均每对引物扩增40多条清晰带.每对引物对各处理样品扩增的多态性位置基本相同(如图3a),说明52azaC处理前后小麦幼苗基因组DNA序列保持一致,未发生变异.64　河南大学学报(自然科学版),2011年,第41卷第1期2.4　MSA P 检测甲基化水平变化利用H a p II 和Ms p I 对DNA 甲基化敏感程度不同可检测出CCGG 序列的甲基化状态.为了便于分析,本文将MSA P 方法测出的带型分为A 、B 、C 、D 4种.A 表示H 、M 都有带(图3A ),为未甲基化或内侧胞嘧啶半甲基化(单链)类型;B 表示H 有带、M 无带(图3B ),为外侧胞嘧啶半甲基化或内、外侧胞嘧啶半甲基化类型;C 表示H 无带、M 有带(图3C ),为内胞嘧啶全甲基化(双链)类型.一般认为,MSA P 不能检测到DNA 外侧或内、外侧胞嘧啶完全甲基化位点(m CCGG/GGC m C 或m C m C GG/GG m C m C )[16217],即H 、M 在此酶切位点无带,如果对照有而52azaC 处理材料无带或对照无而处理材料有带,则说明52azaC 处理的材料在此位点发生了甲基化变化,并将这种情况下的带型用D 表示.C :对照;128分别表示52azaC 浓度为0.5、1、5、10、50、100、500、1000μmol/L ;H 、M 表示同裂酶H a p II 和Ms p I 的消化图谱;“π”表示部分变异类型.图3　基因组DNA 的A FL P (a )和MSAP 分析电泳图谱(b )Fig.3　DNA 2A FL P finger 2printing (a )and DNA methylation MSA P finger 2printing map (b )DNA 甲基化增加的带型变化可总结为:A →C ,A →D ,B →C ,B →D.相反,去甲基化变化的带型为:D →B ,D →A ,C →B ,C →A.不能确定DNA 甲基化增加或减少的带型变化为A →B ,C→D ,D →C ,B →A.MSA P 分析统计结果表明,10对引物组合共扩出460条左右清晰条带,其中,A 型带最多,有200多条,C 型带90条左右,比B 型带少40%左右(表2),表明所检测的基因组CCGG 序列多处于未甲基化或半甲基化状态.与对照相比,不同浓度52azaC 处理后的材料均存在甲基化变异带,且变异带的数量随处理浓度的增大而增加.不同浓度52azaC 处理的小麦幼苗的DNA 甲基化均有不同程度的降低,且降低程度明显依赖于52azaC 胁迫的剂量.此外,不同浓度52azaC 处理材料还有少数甲基化增加条带,且甲基化增加的幅度与52azaC 剂量的关系不大.统计的带型中,4种较高浓度处理材料的总带数均高于4种较低浓度和对照,说明高浓度条件下的甲基敏感多态性相对较高,其中较明显的是A 型带,随52azaC 浓度的增加而增加,C 型带随52azaC 浓度的增加而相对减少,表明较高浓度的52azaC 处理时,基因组中在低浓度52azaC 条件下没有发生去甲基化的部分C m C GG/GG m CC 位点可能进一步去甲基化,从而使甲基化敏感内切酶在这些位点产生新的酶切反应.表2　不同处理材料的MSA P 带型统计及甲基化变化情况Tab.2　MSA P 2banding patterns and DNA methylation variational status of samples处理浓度/(μmol ・L -1)A/B/C/总带数总变异带数(变异率/%)甲基化增加带数甲基化减少带数及比率(%)0204/161/90/4550.5209/163/91/46311(2.3)16(1.3)1207/165/91/46313(2.8)17(1.5)5210/162/89/46116(3.5)29(2.0)10214/159/88/46120(4.3)210(2.2)50215/164/87/46625(5.4)116(3.4)100216/165/87/46832(6.8)220(4.3)500221/161/85/46739(8.4)225(5.4)1000249/142/77/46851(10.9)334(7.3) 注:A 、B 、C 分别表示扩增的带型对不同的带型变化做了进一步统计分析(表3),发现甲基化增加的带型在不同浓度的52azaC 处理材料中基本上表现为B →D 型,可以确定是由半甲基化向全甲基化状态的转变.3种较高浓度在C →D 型带的还陈芳,等:52氮杂胞苷对小麦生长发育及DNA甲基化的影响65分别有1条,可能是全甲基化位点间的相互转化(C m C GG/GG m CC→m CC GG/GGC m C),也可能是外侧胞嘧啶重新甲基化(C m C GG/GG m CC→m C m CGG/GG m C m C).甲基化减少的各种带型中D→B型最多,C→A型次之,这一与抑制剂剂量密切相关的效应机理还有待深入研究.1000μmol/L52azaC处理的材料各种甲基化减少的带型都有,说明随52azaC浓度的增加去甲基化变化的数目和类型也在增多.另外,B→A型带随52 azaC剂量的增加变化较明显,D→C型在各处理间的变化不大.由于MSA P技术的局限性,不能确定这两种带型变化是外胞嘧啶甲基化向内胞嘧啶位点间的甲基变化还是去甲基化变化.公共带表示不同浓度处理材料中DNA甲基化变化类型相同的情况.表3　不同处理材料的带型变异情况Tab.3　Banding patterns variational status of samples处理浓度/(μmol・L-1)甲基化增加带型3A→B　A→C A→D　B→C B→D　3C→D甲基化减少带型3D→C D→B D→A C→B C→A3B→A0.50000102410121000010260013500002026003310000020260046500000102101056100000021313205650000002131530781000000031317511110公共带/条000010240012 “3”表示带型变化方向不完全确定,即有可能是甲基在CCGG位点间相互转换.3　讨论DNA甲基化抑制剂应用于植物中的研究表明,它可部分代替低温促进植物开花[11],这在植物育种工作中可能会有一定的应用价值.研究发现,植物的体细胞经胁迫后,可通过表观遗传机制在后代中传递[18219],表明了CG序列甲基化在许多表观遗传机制中起着主要作用,暗示了DNA甲基化变化存在的潜在育种价值[20].本研究对小麦幼苗进行了不同浓度的52azaC处理,结果表明,100μmol/L以上的52azaC对小麦幼苗根和苗的生长有明显的抑制作用.经不同浓度52azaC处理的小麦植株,移栽至大田后生长发育也有较明显的变化,如小麦在分蘖数、株高、抽穗及开花时间方面明显异于对照,这与甘蓝的研究结果相似[21].研究表明同一群体内,抽穗时间与穗粒数和粒重有密切关系[22].本研究发现抽穗时间早的处理组的千粒重也较重.在不考虑株高的情况下,50μmol/L和100μmol/L处理的植株分蘖数、分蘖率和千粒重均比其他浓度处理和对照高,表明合适浓度的52azaC处理有可能在一定程度上增加小麦的产量.而甲基化抑制剂处理使小麦花期提前的效应,也有可能在解决杂交育种中亲本花期不育方面发挥一定作用.因甲基化变异存在一定的随机性[23],故利用52azaC进行甲基化诱变育种可能会存在一定的盲目性,从而影响育种的实际效果[20],植株子一代中出现的表观变异和甲基化不足现象在F2代出现共分离[5],直接的、大量的证据支持仍缺乏等问题,预示着植物DNA甲基化修饰从研究到应用还需时日.有证据表明甲基化抑制剂引起的一些表观遗传变异是可遗传的,但基因水平上的证据还有限,仅在水稻的研究方面证实aza2 dC诱导的去甲基化与抗病基因相关[6].有研究表明低温可引起材料的DNA发生甲基化变化[24],超低温保存对植物材料也具有脱甲基化作用[13,15,25226].这些发生了DNA甲基化变化的位点涉及到哪些基因,有何生物功能,52azaC引起的去甲基化与低温处理引起的去甲基化是否存在相关性,还需要进行深入的研究.参考文献:[1]Chan S W L,Henderson I R,J acobsen S E.G ardening the genome:DNA methylation in A rabi dopsis 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