免疫共沉淀试剂盒说明书
免疫沉淀磁珠及试剂盒
免疫沉淀磁珠及试剂盒（Beads Protein A(or A/G)Immunoprecipitation Kit）货号：M2400规格：20T保存：2-8℃产品内容：Beads Protein A/G Matrix免疫沉淀磁珠及试剂盒系列产品是利用纳米表面技术使Protein A/G高密度定向包被到超顺磁性微球表面，与当前国际免疫磁珠市场上同类产品相比，该产品具有更多的抗体结合位点，磁珠使用量更少，非特异性结合率低，可便捷高效地进行免疫沉淀实验。
每毫升免疫沉淀磁珠结合Human IgG的能力可达到300μg以上，单个沉淀反应仅需25μL磁珠即可完成检测。
微米级磁珠提供的超大比表面积，大幅缩短抗体与抗原吸附所需的平衡时间，15min内即可完成抗体吸附过程，30min 内完成抗原沉淀操作。
简短的操作时间避免长时间操作造成目标蛋白水解，保证了目标蛋白的活性及蛋白复合物的完整性。
免疫沉淀磁珠试剂盒配有经过优化预制的缓冲液，为免疫沉淀实验提供了最佳的反应条件，增强了免疫沉淀实验的稳定性。
本产品可广泛应用于细胞裂解物、细胞分泌上清、血清、腹水等样品中抗原的免疫沉淀反应。
操作者可以参考本操作说明书，附表1的数据了解不同种属来源及亚型的抗体与Protein A磁珠、Protein A/G的结合能力。
产品特性：产品名称规格免疫沉淀磁Beads Protein A/G for IP①1mL结合缓冲液IP Binding Buffer②30mL磷酸盐缓冲液PBS(10×,用之前请稀释到1×)③20mL洗涤缓冲液IP Washing Buffer④20mL洗脱缓冲液IP Elution Buffer⑤0.5mL中和缓冲液IP Neutralization Buffer⑥0.2mL储存条件2~8o C保存保存期1年注：磁珠结合Human IgG能力（Antibody Capacity）分别为：Protein A：0.4~0.5mg/mL;Protein A/G：0.5~0.6mg/mL操作步骤：1.抗原样品制备：本操作说明书提供以下四种样品处理方法，建议您根据不同来源的抗原样品选择适当的方式进行预处理，使待检测抗原释放至样品溶液中。
整理）Co-IP免疫共沉淀样品制备
整理）Co-IP免疫共沉淀样品制备Co-IP免疫共沉淀样品制备一、所需试剂1、Pierce?交联磁珠式免疫沉淀/免疫共沉淀试剂盒（货号88805 4℃保存）（1）Pierce 蛋白A/G 磁珠1 mL，贮存于含有0.05% NaN3的水中，浓度为10 mg/mL （2）Pierce 免疫沉淀裂解/漂洗缓冲液（pH 7.4）<1>0.025M Tris，0.15M NaCl：这个盐浓度可以保持大部分蛋白之间的相互作用<2>0.001M EDTA: 乙二胺四乙酸，螯合金属离子，抑制一些含巯基的酶<3>1% NP40：表面活性剂，可以温和裂解膜，拮抗非特异性的蛋白相互作用<4>5% 甘油: 其粘性可以保护蛋白质之间的相互作用起（3）20×交联缓冲液，25 mL, 稀释后含10 mM 磷酸钠，150 mM NaCl；pH 7.2（4）DSS（辛二酸二琥珀酰亚胺酯，具有胺反应性的同源双功能交联剂，具体见附/1），No-Weigh?形式，每包加217μDM SO溶解成10X储存液（4）中和液，1.0 mL，pH 8.5（5）洗脱液，25 mL，pH 2.0（如需自己配见附录2）（6）电泳上样缓冲液：非还原性，（5×）, 5 mL，pH 6.8，0.3M Tris·HCl，5% SDS，50%甘油，泳道标记示踪染料（好像不含巯基乙醇，减少IP抗体的变性）2、Protease cocktail（货号：cw2200s）：蛋白酶抑制剂混合物，具体什么就不管了3、IP抗体和IB抗体（两者抗体种属最好不一样！理由见附录3），对照IgG抗体4、ddH2O二、具体步骤（冰上进行）第一天：<一>蛋白样品制备一般用超大皿来提蛋白，裂解蛋白只需10-15min，裂解蛋白离心期间可以进行第<二>和第<三>一部分<二>抗体—A/G蛋白磁珠结合1、1×改良的交联缓冲液制备：0.1 mL的20×交联缓冲液+0.1 mL 的免疫沉淀裂解/漂洗缓冲液+1.8 mL超纯水2、向离心管中加入25 μL磁珠（使用前涡旋），将离心管置于磁力架上1分钟，收集磁珠。
Pierce免疫共沉淀(Co-IP)试剂盒26149
说明书Pierce®免疫共沉淀（Co-IP）试剂盒26149 2181.6货号描述26149 Pierce免疫共沉淀（Co-IP）试剂盒，包含足够进行50次免疫沉淀反应的试剂（每次使用25 μL树脂固相化抗体）试剂盒组分：加强型AminoLink®偶联树脂，2 mL固相树脂以50%的浆液形式提供（例如，100 μL 50%的浆液含有50 μL固相树脂）20×交联缓冲液，25 mL，使用时稀释至：0.01M Na3PO4，0.15M NaCl；pH 7.2氰基硼氢化钠溶液（5 M），0.5 mL淬灭缓冲液，50 mL ，1M Tris-HCl洗涤缓冲液，60 mL，1M NaClIP裂解/洗涤缓冲液，2 × 50mL，0.025M Tris，0.15M NaCl，0.001M EDTA，1% NP-40，5%甘油；pH 7.4改良型杜氏PBS （20×），25mL，使用时稀释至：0.008M Na3PO4、0.002M K3PO4、0.14M NaCl、0.01M KCl；pH 7100×条件缓冲液，5 mL，中性pH缓冲液洗脱缓冲液，50 mL，pH 2.8，含有伯胺非还原型泳道标记上样缓冲液，（5×），5 mL，0.3M Tris•HCl，5% SDS，50%甘油，泳道标记示踪染料；pH 6.8Pierce离心柱-带螺帽，100个柱子，包含相应配件微量离心收集管，2 mL，100个微量离心样品管，1.5 mL，50个Pierce对照用琼脂糖树脂（4％琼脂糖珠交联），2 mL固相树脂以50%的浆液形式提供（例如，100 μL 50%的浆液含有50 μL固相树脂）储存：收到试剂盒后将其储存于4°C。
将DSS于4°C干燥保存。
常温运输。
产品简介Thermo Scientific Pierce免疫共沉淀（Co-IP）试剂盒通过将纯化的抗体直接固定在琼脂糖基质上，从细胞裂解液或其它复杂混合物中分离天然蛋白复合体。
免疫共沉淀实验·基础篇
免疫共沉淀实验·基础篇What is Co-IP？Co-IP全称Co-Immunoprecipitation，中文学名免疫共沉淀，是一种以抗体和抗原识别专一性为基础，用于研究蛋白质之间相互作用的经典方法。
通俗点来说，假设我们需要研究样品中A蛋白和B蛋白之间是否存在一些相互作用，首先我们通过合适的方法处理样本，将蛋白提取出来（同时不能破坏蛋白之间的相互作用），然后用预先结合了琼脂糖珠或者磁珠的A蛋白抗体捕获样本中的A蛋白，那么与A蛋白结合的B蛋白也能一起沉淀下来。
再将蛋白从珠子上裂解下来，对B蛋白进行检测，能检测到，说明B蛋白在之前的沉淀过程中随着A蛋白一起被拉下来了，进而证明二者之间存在相互关系。
How to do？实验流程A few tips：如何理解文献中的结果？各名称解析：IB：全称immunoblotting，即免疫印迹，也就是常规的Western Blotting，用于显示目的蛋白。
IP：全称immunoprecipitation，即免疫沉淀，这一步主要是为了纯化富集目的蛋白。
Input：全细胞裂解液，含有细胞内所有的蛋白，可认为是阳性组。
也就是处理完样本得到的细胞裂解液，在做IP实验之前，需要先跑WB，确认样本中含有蛋白A和蛋白B。
Anti-A：A蛋白的免疫共沉淀抗体IgG：Anti-A的同型对照抗体，即跟Anti-A同来源同种型，如Anti-A是兔来源IgG型，则同型对照抗体需要选择Rabbit IgG （abs20035）结果图解析：该结果是为验证蛋白A与蛋白B是否存在相互作用。
本实验一共分为两大组：Input组及IP组，其中IP组又分为IgG组（阴性对照组）和实验组，并通过WB去验证蛋白A和B在每一个组里面是否存在。
由Input组的条带可以得到结论：蛋白A与蛋白B都是存在的，证明样本处理提取蛋白的步骤没有任何问题。
阴性对照IgG组和实验组平行进行免疫沉淀实验，结果蛋白A与蛋白B均没有条带，说明利用IgG抗体没有把蛋白A和B沉淀下来，证明蛋白A和B与IgG没有结合，排除了蛋白与抗体非特异性结合的可能性；而实验组蛋白A和B均有条带，表示利用蛋白A的抗体进行沉淀实验，成功把蛋白A沉淀下来了，与此同时蛋白B也被沉淀下来，进而得到结论：蛋白A与蛋白B之间存在相互作用。
Pierce交联磁珠式免疫沉淀免疫共沉淀试剂盒
说明书Pierce™交联磁珠式免疫沉淀/免疫共沉淀试剂盒888052309.4货号描述88805 Pierce交联磁珠式免疫沉淀/免疫共沉淀试剂盒，包含足够完成40个反应的试剂，每个反应使用25 µL磁珠试剂盒组成:Pierce 蛋白 A/G 磁珠1 mL，贮存于含有 0.05% NaN3的水中，浓度为10 mg/mLPierce 免疫沉淀裂解/漂洗缓冲液，2 × 50 mL，pH 7.4，0.025M Tris，0.15M NaCl，0.001M EDTA，1% NP40，5% 甘油20×交联缓冲液，25 mL, 稀释后含10 mM 磷酸钠， 150 mM NaCl；pH 7.2DSS（辛二酸二琥珀酰亚胺酯），No-Weigh™形式， 8 × 2 mg 微型管中和液，1.0 mL，pH 8.5洗脱液，25 mL，pH 2.0电泳上样缓冲液，非还原性，（5×）, 5 mL，pH 6.8，0.3M Tris·HCl，5% SDS，50%甘油，泳道标记示踪染料贮存条件：收到本产品后于4°C贮存。
冰盒运输。
目录产品简介 (2)流程简述 (2)重要产品信息 (2)所需额外试剂和仪器 (3)Pierce经典磁珠式免疫沉淀试剂盒流程 (3)A. 将抗体结合于蛋白A/G磁珠上 (3)B. 交联结合的抗体 (4)C．哺乳动物细胞裂解 (4)D. 手动抗原免疫沉淀 (5)E. 自动免疫沉淀 (5)问题解决 (7)网站附加信息 (7)Thermo Scientific KingFisher 仪器的常见问题 (8)Thermo Scientific相关产品 (8)产品简介Thermo Scientific™ Pierce™ 交联磁珠式免疫沉淀/免疫共沉淀试剂盒通过共价键将抗体交联于Thermo Scientific™ Pierce™ 蛋白 A/G磁珠上能够高效完成抗原免疫沉淀（IP）及免疫共沉淀（Co-IP）实验。
整理)Co-IP免疫共沉淀样品制备
Co-IP免疫共沉淀样品制备一、所需试剂1、Pierce™交联磁珠式免疫沉淀/免疫共沉淀试剂盒（货号88805 4℃保存）（1）Pierce 蛋白A/G 磁珠1 mL，贮存于含有0.05% NaN3的水中，浓度为10 mg/mL （2）Pierce 免疫沉淀裂解/漂洗缓冲液（pH 7.4）<1>0.025M Tris，0.15M NaCl：这个盐浓度可以保持大部分蛋白之间的相互作用<2>0.001M EDTA: 乙二胺四乙酸，螯合金属离子，抑制一些含巯基的酶<3>1% NP40：表面活性剂，可以温和裂解膜，拮抗非特异性的蛋白相互作用<4>5% 甘油: 其粘性可以保护蛋白质之间的相互作用起（3）20×交联缓冲液，25 mL, 稀释后含10 mM 磷酸钠，150 mM NaCl；pH 7.2（4）DSS（辛二酸二琥珀酰亚胺酯，具有胺反应性的同源双功能交联剂，具体见附/1），No-Weigh™形式，每包加217μDMSO溶解成10X储存液（4）中和液，1.0 mL，pH 8.5（5）洗脱液，25 mL，pH 2.0（如需自己配见附录2）（6）电泳上样缓冲液：非还原性，（5×）, 5 mL，pH 6.8，0.3M Tris·HCl，5% SDS，50%甘油，泳道标记示踪染料（好像不含巯基乙醇，减少IP抗体的变性）2、Protease cocktail（货号：cw2200s）：蛋白酶抑制剂混合物，具体什么就不管了3、IP抗体和IB抗体（两者抗体种属最好不一样！理由见附录3），对照IgG抗体4、ddH2O二、具体步骤（冰上进行）第一天：<一>蛋白样品制备一般用超大皿来提蛋白，裂解蛋白只需10-15min，裂解蛋白离心期间可以进行第<二>和第<三>一部分<二>抗体—A/G蛋白磁珠结合1、1×改良的交联缓冲液制备：0.1 mL的20×交联缓冲液+0.1 mL 的免疫沉淀裂解/漂洗缓冲液+1.8 mL超纯水2、向离心管中加入25 μL磁珠（使用前涡旋），将离心管置于磁力架上1分钟，收集磁珠。
免疫共沉淀操作步骤
免疫共沉淀操作步骤免疫共沉淀（immunoprecipitation）是一种常用的实验技术，用于检测特定蛋白与其他分子的相互作用。
本文将介绍免疫共沉淀的操作步骤，包括前期准备、取样、免疫共沉淀、洗涤、洗脱和分析结果等。
一、前期准备1. 准备所需试剂：PBS缓冲液（含0.1%的Tween-20）、蛋白质抽提缓冲液（含有适当的蛋白酶抑制剂）、抗体（单克隆或多克隆抗体）、控制组织或细胞苗、蛋白质A/G磁珠等。
2.对样品进行处理：收集样品，如细胞或组织，并用蛋白质抽提缓冲液裂解细胞膜或组织。
3. 确定抗原-抗体反应的条件：进行Western blot或其他实验，确定抗体和目标蛋白的最佳工作浓度和最佳条件。
二、取样1.将裂解的细胞或组织样品通过离心等手段去除细胞碎片和残留的细胞核。
2.将上清液收集到新的离心管中，并测定样品的总蛋白浓度，以便后续计算抗体的用量。
3.根据总蛋白浓度将样品分成相等的小样本，并放入不同的离心管中。
三、免疫共沉淀1.将试验管中的抗体与适量的蛋白质A/G磁珠混合，孵育一段时间，使抗体与磁珠形成固定复合物。
2.将磁珠与固定复合物加入到每个含有样品的离心管中，混匀并在冰上孵育一段时间。
3.离心管置于磁珠磁架上，使磁珠在离心管底部附着，将上清液小心地转移至新的离心管中，以减少非特异性结合的背景。
4.用PBS缓冲液洗涤磁珠至少3次，以去除非特异性结合的蛋白质。
5.转移沉淀到新的离心管中，并用PBS缓冲液洗涤磁珠至少3次，以去除残留的非特异性结合蛋白质。
四、洗涤1.将磁珠与背景低的洗涤缓冲液混合，孵育一段时间，混匀后在冰上孵育。
2.将磁珠与洗涤缓冲液加入到每个含有沉淀的离心管中，混匀并在冰上孵育一段时间。
3.离心管置于磁珠磁架上，使磁珠在离心管底部附着，将上清液小心地转移至新的离心管中。
4.用洗涤缓冲液洗涤磁珠至少3次，以去除非特异性结合的蛋白质。
五、洗脱1.将洗涤缓冲液去除，加入适量的脱附缓冲液，孵育一段时间，混匀并在冰上孵育。
ChIP试剂盒染色质免疫共沉淀全套解决方案
ChIP试剂盒染色质免疫共沉淀全套解决方案染色质免疫沉淀-芯片试剂盒染色质免疫沉淀(芯片)的完整溶液是研究体内DNA与蛋白质相互作用的最佳方法。
其基本原理是将蛋白质-DNA复合物固定在活细胞状态，将其随机切割成一定长度范围内的小染色质片段，然后通过免疫学方法沉淀复合物，特异性富集与靶蛋白结合的DNA片段。
通过目标片段的纯化和检测，可以获得关于蛋白质和DNA之间相互作用的信息。
芯片不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态相互作用，还可以研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。
此外，芯片与其他方法的结合扩大了其应用范围:通过芯片与基因芯片的结合建立的芯片-芯片法已广泛用于高通量筛选特异的反式因子靶基因；芯片结合体内足迹法寻找反式因子的体内结合位点；核糖核酸芯片用于研究核糖核酸在基因表达调控中的作用因此，随着ChIP的进一步完善，它必将在基因表达调控研究中发挥越来越重要的作用。
就目前国内研究状况而言，教师在研究领域有分化、转录、发育、诱导多能性、肿瘤干细胞、表观遗传学等。
会做ChIP实验，一些老师会自己购买抗体，手动配置试剂。
然而，因为实验本身具有复杂的实验步骤，并且其中许多步骤非常关键，需要更多的试剂，所以很容易导致配置之间的错误，并且实验周期长。
如果没有设置阴性和阳性对照，结果就无法分析，从而导致无休止的混乱。
经典染色质免疫沉淀(ChIP)试剂盒(p-2002):提供细胞样品上染色质免疫沉淀反应所需的所有试剂此外，试剂盒包含阳性对照抗体(核糖核酸聚合酶2抗体)、阴性对照抗体(正常小鼠的IgG)和GAPDH引物(可用作阳性对照，以确保试剂盒中的试剂和操作步骤没有问题)在大多数生长中的哺乳动物细胞中，核酸聚合酶II富集在GAPDH基因启动子上，为启动转录做准备，因此启动子可以与核酸聚合酶II进行免疫沉淀反应，但不能与正常的小鼠IgG进行免疫沉淀反应。
在该染色质免疫沉淀反应中，细胞与甲醛偶联以提取其中的染色质染色质被适当破坏，然后加入微孔中，与吸附在微孔表面的抗体反应特异性结合在微孔上的DNA从抗体-捕获蛋白-DNA复合物中释放出来，通过我们公司专门设计的高速离心柱进行翻转和纯化。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
Storage: Upon receipt store at 4°C. Product shipped at ambient temperature.
Introduction
The Thermo Scientific Pierce Co-Immunoprecipitation (Co-IP) Kit enables isolation of native protein complexes from a lysate or other complex mixture by directly immobilizing purified antibodies onto an agarose support. Co-IP is a common approach to study protein:protein interactions that uses an antibody to immunoprecipitate the antigen (bait protein) and coimmunoprecipitate any interacting proteins (prey proteins). Traditional co-IP methods that use Protein A or G result in coelution of the antibody heavy and light chains that may co-migrate with relevant bands, masking important results. The Pierce Co-IP Kit resolves this issue by covalently coupling antibodies onto an amine-reactive resin. The kit includes optimized buffers for protein binding and recovery, reagents to perform control experiments and efficient spin columns and collection tubes, which shorten the protocol and minimize handling and mixing.
• The Pierce Spin Columns package includes columns, screw caps, plugs, Luer-Lok® Adapter Caps, large frits and a large frit tool. The large frit is not needed for the standard IP protocol. When scaling-up the IP reaction (i.e., > 200µL of resin), the large frit can be inserted to facilitate washing. The Luer-Lok Caps have a flip top that may be used during wash steps. Use the screw caps for sealing the spin columns during storage. (See the Additional Information Section.)
• To reduce nonspecific protein binding in immunoprecipitations, pre-clear the lysate using the Control Agarose Resin or add Thermo Scientific Surfact-Amps X-100 (10% Triton® X-100, Product No. 28314) to the Modified Dulbecco’s PBS at 0.1-1%. Note: Surfact-Amps® X-100 is not supplied with the kit.
• The IP Lysis/Wash Buffer has been tested on representative cell types including but not limited to the following cell lines: HeLa, Jurkat, A431, A549, MOPC, NIH 3T3 and U2OS. Typically, 106 HeLa cells yield ~10 mg of cell pellet and ~3µg/µL (or 300µg) when lysed with 100µL of IP Lysis/Wash Buffer.
• Gelatin or carrier proteins in the antibody solution will compete for coupling sites on the resin. Remove gelatin and carrier proteins using the Thermo Scientific Pierce Antibody Clean-up Kit (Product No. 44600) or by performing Protein A/G purification (Product No. 20423) and dialysis.
Wash Solution, 60mL, 1M NaCl IP Lysis/Wash Buffer, 2 × 50mL, 0.025M Tris, 0.15M NaCl, 0.001M EDTA, 1% NP-40, 5% glycerol; pH 7.4
Modified Dulbecco’s PBS (20X), 25mL, when diluted results in 0.008M sodium phosphate, 0.002M potassium phosphate, 0.14M sodium chloride and 0.01M KCl; pH 7
• For best results, add Thermo Scientific Halt Protease (Product No. 78430) and Phosphatase (Product No. 78428) Inhibitor Cocktails to minimize degradation and dephosphorylation of cell lysate proteins. These inhibitors are also available as a combined cocktail (Product No. 78440). See the Related Thermo Scientific Products Section for more information.
• Primary amines (e.g., Tris, glycine) in the antibody solution will compete for coupling sites on the resin. Remove primary amines before antibody immobilization using Thermo Scientific Zeba Spin Desalting Columns or Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes.
Conditioning Buffer (100X), 5mL, neutral pH buffer
Elution Buffer, 50mL, pH 2.8, contains primary amine
Lane Marker Sample Buffer, Non-reducing, (5X), 5mL, 0.3M Tris•HCl, 5% SDS, 50% glycerol, lane marker tracking dye; pH 6.8
• When centrifuging spin columns, the flow-through volume should not exceed 600µL when using a 2mL collection tube and 300µL when using a 1.5mL collection tube. Exceeding these volumes can cause back pressure in the column and incomplete washing or elution.
Pierce Biotechnology 3747 N. Meridian Road
PO Box 117 Rockford, lL 61105 USA
(815) 968-0747 (815) 968-7316 fax
/pierce
Important Product Information
Coupling Buffer (20X), 25mL, when diluted results in 0.01M sodium phosphate, 0.15M NaCl; pH 7.2
Sodium Cyanoborohydride Solution (5M), 0.5mL
Quenching Buffer, 50mL, 1M Tris•HCl
Pierce Spin Columns – Screw Cap, 50 each
Microcentrifuge Collection Tubes, 2mL, 100 each
Microcentrifuge Sample Tubes, 1.5mL, 50 each
Pierce Control Agarose Resin (crosslinked 4% beaded agarose), 2mL of settled resin supplied as a 50% slurry (e.g., 100µL of 50% slurry is equivalent to 50µL of settled resin)