小鼠干扰素应答基因_Ifrg15_的克隆_原核表达及其融合蛋白的亲和纯化
小鼠ISG15基因5′调控区序列的克隆及序列分析
小 鼠 ＩＧ 因 ５调 控 区序列 的克 隆及 序 列 分 析 Ｓ１ ５基
滕 美 丽 柳 林 孙 晓凤 潘 庆 杰 ， ， ，
（ ．青岛农业大学动物科技学 院， １ 山东 青岛 ２ ６０ ２ ６ １９； ．烟台动物疾病预防与控制 中心）
摘要 ： 用 Ｌ 采 Ａ—Ｐ Ｒ 技 术 扩 增 小 鼠 ＩＧ ５基 因 １９ ｂ Ｃ Ｓ１ １４ ｐ的 ５调 控 区 序 列 ， 建 了 重 组 克 隆 载 体 ｐ Ｇ Ｐ—Ｎ 构 Ｅ Ｆ １一
Ｃｌ ｎｉ ｎｄ Ａｎａ ｙ ｉ ｆ５ Ｒｅ ｕｌ ｔｏ Ｓｅ ｕ ｎｃ ｆ Ｉ １ ｅ ｅ ｆ ｏ ｏ ｓ ｏ ｎｇ ａ ｌ ｓｓ ｏ ｇ ａ ｉ ｎ ｑ ｅ ｅ ｏ ＳＧ Ｇ ｎ ｒ ｍ Ｍ ｕ ｅ ５
Ｔ Ｎ ｉ ｉ，ＬＵ Ｌｎ ，Ｓ Ｎ Ｘ ａ— ｎ Ａ ｉｇ ｉ Ｅ Ｇ Ｍｅ ｌ — Ｉ ｉ Ｕ ｉ ｆ ｇ ，Ｐ Ｎ Ｑｎ －ｅ ｏｅ ｊ
ｉｅ ｔ ｅ ｙ Ｐ ｄ ｎｉ ｄ ｂ ＣＲ ｍｐ ｉ ｃ ｔｏ ｉ ｆ ａ ｌｆ ａｉ ｎ，ｒ ｓｒｃｉｎ ｅ ｄ ｎ ｃ ｅ ｓ ｎ ｉ ｅ ｔｉｔｏ ｎ ｏ ｕ ｌａ ｅ ａ ｄ ＤＮＡ ｅ ｕｅ ｃ ｎ ． Ｔ ｅ ｕ ｔ ｈ ｗｅ ｈａ ｅ ｏ ｓｑ ｎ ｉｇ ｈｅ ｒ ｓ ｌｓ ｓ ｏ ｄ ｔ ｔｒ ｃ ｍｂｉ — ｎ ｎ ｌ ｓ ｄ ｉ ｃｕ ｎ ｒ ｍｏ ｅ ｅ ｉ ｎ ｓ ｑ ｎ ｅ ｏ Ｓ １ ｅ ｅ ｗａ ｕｃ ｅ ｓｕ ｌ ｏ ｔｕｃｅ ． Ｔｈ ｒ ｒ ｏ ｈ — ａ ｔｐ ａ ｍｉ ｎ ｌ ｄｉｇ ｐ ｏ ｔｒ ｒ ｇｏ ｅ ｕｅ ｃ ｆＩ Ｇ ５ ｇ ｎ ｓ ｓ ｃ ｓ ｆ ｌｙ ｃ ｎｓｒ ｔ ｄ ｅ ｅ ｗｅ ｅ ｌｗ ｏ ｍｏｏ ｉｓｗｉ ｆｅ ｅ ｔｓ ｅ ｉ ｓ Ｔｈ ｏ ｏｏ ｉ ｓｏ ｈ ｏ ｉ ｌｐ ｏ ｔｒｒ ｇ ｏ ｅ ｅ ｅ ｆｔ ｅ Ｉ Ｇ １ ｅ ｅ ｆｏ ｌｇｅ ｔ ｄｉ ｒ ｎ ｐ ｃｅ ． ｈ ｆ ｅ ｈ ｍ ｌ ｇｅ ｆｔ ｅ ｐｒｘ ｍａ ｒ ｍｏｅ ｅ ｉｎ ｓ ｑｕ ｎｃ ｓｏ ｈ Ｓ ｇ ｎ ｒ ｍ ５ ｍｏ ｓ ｔ ｕ ｅ ｗｉｈ，Ｈｏ ａ ｉｎｓ Ｂｏ ａ ｒ ｓ ａ ａ ｎ ｒ ｕｓ ｗｅ ｅ ４１ ３ ｍｏ ｓ ｐ ｅ ， ｓ Ｔ ｕ ｕ ｎｄ Ｃｈ ｎ ａ ａ ｇ ｒ ． ６％ ，３ ８ ７． ９％ ａ ８． ％ ， ｒ ｓ ｃ ｉｅｙ ｎｄ ３ ７１ ｅ ｐｅ ｔ ｌ ． ｖ
乌鳢(Channa argus)干扰素刺激基因Viperin和ISG15及其启动子的克隆与特征分析.pdf
止!鲫 鱼% 河 豚 " %斑马鱼和 * F & X $ *3 * # 3 $ ) ($ = ; ’ ’ ( (! % > ?! 斑点 叉 尾 ! 的 G @ ] " !同源物已被克隆 % 7在 报 道 的 鱼 类 干 扰 素 刺 激 基 因 中! 已 对 虹 鳟 M $ [ 和 ; ! 河豚 4. ! 鳜 鱼 M 4. V $ ) 3 $ % !鲫鱼和 ’ ’ ( % (! > $ 大西洋鳕鱼 " 基因启动子 U & + * (/ " 3 7 * &T < U V W %
"! %( 态’ 7机体早期的抗病毒反应为非特异性 ! 因而 干 ’")" ( " #( ( ?! 也取 得 显 著 进 展 ’ ! 4. ! V! 4. [ 和 4. \" > ! 和M 等干扰素 刺 激 基 因 由 于 在 免 疫 反 M $ $ V" [" ; ; 应中占有重要地位而引起广泛关注 7 ’ ( ’ (
’ ( " !! % ! ’ ( " ( ’ ( " )
] F [][] S ] S F ][][ ’ C . 1 0 . 2! nT[ F +第 9 二轮 O F [][] F S F T ] F [][[ F S ’ F [] ] ] F [] ][[] F S ] ] F F ] S S S[ ’ F [[[][ F F [] [] S S S ] F F F [ F S ] ’ S[S F [S F S ] C . 1 0 . 2 ( n T[ F + 9 O F T G @ ] " !! n T[ F +第 一轮 O F T G @ ] " !! n T[ F +第 二轮 O F T
干扰素诱导蛋白IFIT1的克隆与原核可溶性表达
干扰素诱导蛋白IFIT1的克隆与原核可溶性表达李洪涛;粟永萍;徐建明;冉新泽;王军平;艾国平;程天民【摘要】目的研究干扰素诱导蛋白IFIT1的原核可溶性表达.方法通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)获得IFIT1编码序列,克隆入原核表达载体,电穿孔转化大肠杆菌,筛选阳性克隆,诱导细菌表达,蛋白凝胶电泳观察.结果构建的原核表达平台实现了较丰富的麦芽糖结合蛋白融合IFIT1(MBP-IFIT1)可溶性表达.结论 MBP-IFIT1的原核可溶性表达为后续IFIT1蛋白结合分析及免疫分析提供了材料及方法学基础.%Objective To investigate the soluble prokaryotic expession of interferon induced factor with tetratricopeptide repeats-1.Methods By reverse transcription PCR,murine IFIT1 cDNA coding sequence was acquired,and cloned into the prokaryotic expression vector.Then the E.coli was transformed by electroporation with the recombinant.The screened positive cloning was induced to express target recombining protein which was observed with SDSPAGE.Results The aplenty soluble fusion proteins MBP-IFIT1 could be obtained by this prokaryotic expression construction.Conclusion Accomplishment of the soluble expression of MBP-IFIT1 provides basements of the IFIT1 followup functional studies.【期刊名称】《重庆医学》【年(卷),期】2011(040)019【总页数】3页(P1873-1875)【关键词】创伤和损伤;细胞应激;重组;原核表达【作者】李洪涛;粟永萍;徐建明;冉新泽;王军平;艾国平;程天民【作者单位】第三军医大学军事预防医学院全军复合伤研究所,创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室,重庆,400038;第三军医大学军事预防医学院全军复合伤研究所,创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室,重庆,400038;Dept.of Molecular and Cellular Biology,Baylor College of Medicine,77030 Houston USA;第三军医大学军事预防医学院全军复合伤研究所,创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室,重庆,400038;第三军医大学军事预防医学院全军复合伤研究所,创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室,重庆,400038;第三军医大学军事预防医学院全军复合伤研究所,创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室,重庆,400038;第三军医大学军事预防医学院全军复合伤研究所,创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室,重庆,400038【正文语种】中文IFIT1(interferon induced factor with tetratricopeptide repeats-1,IFIT1)受Ⅰ型干扰素诱导迅速合成,且含有多个串联排列的 TPR模体(tetratricopeptide repeats motif),所以得名[1]。
小鼠干扰素应答基因(Ifrg15)的克隆、原核表达及其融合蛋白的亲和纯化
下成功纯化 了 ＧＳ ＆６ Ｈ ｓ ｆ ｌ 融 合蛋 白。 Ｔ ｘ ｉＩｇ ５ —
关键 词 干扰 素应答基 因（ ｒｌ ）基 因克隆 ， １ｇ５， ｆ 原核表达 ， 亲和层 析
Ｃｌｎ ｎ ｎ ｒ ｋ ｒ ｏ ｉ ｐ ｅ ｓ ｎ ｏ ｏ ｓ ｎ ｅ ｆ ｒ ｎ Ｒｅ ｐ ｎ ｉ ｅ Ｇｅ ｅ ｏ ｉ ｇ ａ ｄ Ｐ ｏ ａｙ ｔ Ｅｘ ｒ ｓｉ ｆＭ ｕ ｅ Ｉ ｔｒｅ ｏ ｓ ｏ ｓ ｎ ｃ ｏ ｖ
农业 生物 技 术 第 期 第 １８ １７
Ｊ ｒ ｌｆ ｇｃｌｒ ｉｅｈｏ ｇ，００Ｖ １８Ｎ － 鱼二 ！兰 ｏ ｎ Ａ ｒｕｕａＢｏ ｃｎｌ ｙ２１， ｏ １， ｊ ！ ｕ ａｏ ｉ ｔ ｌ ｔ ｏ ． ｏ ６
２ ６ ４ ， ｉ ａ ２ Ｃｏ ｌ ｇ ｆ ｉ ｌ ｉｎｃ ｎ ｃ ｎ ｌ ｇ ， ｈ ｉ ｒｃ ｌ ｒ ｌ ｉ ｅ ｓｔ Ｈｅ ｅ ３ ０ ６ Ｃｈｍａ ３ ０ １ Ｃｈ ｎ ； ｌ ｅ ｏ Ａｎ ｍａ ｅ ｅａ ｄ Ｔｅ ｈ ｏ ｏ ｙ Ａ ｕ ｅ Ｓｃ ｎ Ａｇ ｉｕ ｔ ａ ｖ ｒｉ ｕ Ｕｎ ｙ， ｆ ｉ ０ ３ ， ２
摘
要
为研 究一个 可 能 的干 扰素 应答 基 因（ ｔｒ ｒｎｒｓｏ ｓ ｅ ｅ ｅ１ ， ｒｌ 所编 码 蛋 白质 的 生物 学功 ｉ ｅｆ ｏ ｐ ｎｉ ｎ ５ Ｉｇ ｎ ｅ ｅ ｖｇ ｆ
PCV2-ORF2去信号肽基因的克隆与原核表达及对小鼠免疫效力的评价
PCV2-ORF2去信号肽基因的克隆与原核表达及对小鼠免疫效力的评价王云龙;朱永喜;李玉林;霍雯;李恒思;王真;邓黎黎;黄欣【期刊名称】《中国医药生物技术》【年(卷),期】2009(004)003【摘要】目的通过基因工程的方法表达猪圆环病毒2型的ORF2蛋白,并对表达蛋白进行小鼠免疫效力评价,为猪圆环病毒病疫苗的研制提供技术支持.方法根据GenBank中猪圆环病毒2型(PCV-2)ORF2基因序列,设计了1对引物.从疑似断奶仔猪多系统衰竭综合症(PMWS)的死亡仔猪病料中提取基因组DNA,用PCR方法扩增出ORF2去信号肽基因,将该基因克隆至原核表达载体pET32α,获得重组质粒,经PCR、酶切以及序列分析鉴定,表明插入的片段为目的基因,插入的位置、大小和阅读框均正确,成功构建了重组质粒pet32α-ORF2,阳性重组质粒转化大肠杆菌Blgold(DE3),用IPTG诱导表达并确定表达的最佳条件,表达产物经纯化后,以每只小鼠0.2mg免疫5周龄的雌性小鼠,然后用ELISA检测免疫小鼠血清中抗体的产生情况.结果纯化的重组蛋白能使小鼠产生了抗猪圆环病毒的特异性抗体,从第7d开始产生抗体,第28d抗体水平达到最高,抗体可维持7周以上,并具有良好的安全性.结论表达目的蛋白能在小鼠体内产生特异性抗体,为进一步研究猪圆环病毒亚单位疫苗奠定了基础.【总页数】5页(P219-223)【作者】王云龙;朱永喜;李玉林;霍雯;李恒思;王真;邓黎黎;黄欣【作者单位】453002,新乡,河南师范大学;450121,郑州,郑州职业技术学院;453002,新乡,河南师范大学;450001,郑州,河南省生物工程技术研究中心;450001,郑州,河南省生物工程技术研究中心;450001,郑州,河南省生物工程技术研究中心;450001,郑州,河南省生物工程技术研究中心;450121,郑州,郑州职业技术学院;450121,郑州,郑州职业技术学院【正文语种】中文【中图分类】R3【相关文献】1.小鼠干扰素应答基因(Ifrg15)的克隆、原核表达及其融合蛋白的亲和纯化 [J], 丁彪;刘一飞;张运海;李文雍2.去N端信号肽的水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E的原核可溶性表达及其免疫原性评价 [J], 魏明童;夏兵兵;何志远;周炜;刘兴东;赵俊;陈敬贤;王明丽3.牦牛日本血吸虫Sjp38MAPK基因克隆、原核表达及免疫保护效果研究 [J], 杜敏4.小鼠DHRS4基因原核表达载体的构建、表达及多克隆抗体的制备 [J], 张廷银;闫银侠;黄东阳5.单增李斯特菌内化素基因inlG基因原核表达及小鼠免疫保护性分析 [J], 刘圆园;曹启航;孙亚楠;委慧玲;薛惠文;苟惠天因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
重组小鼠IL15Fc融合蛋白的制备和活性鉴定
万方数据华西药学杂志第２３卷有结构完整、具高度牛物活性的ＩＬ—１５或其融合蛋白是开展疾病研究的莆要基础。
由于单纯重组细胞因子在纯化上比较困难，成本高，体内应Ｈｊ剂量大，半衰期短。
因此，将细胞冈子与／Ｆｃ片段融合，可克服单纯承组细胞冈子的缺点。
引入Ｆｃ片段，不但可使细胞因子形成聚合体而增强抗体Ｆｃ片段的功能，而且可使检测和纯化简单、易行。
实验性自身免疫性葡萄膜炎（ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌａｕｔｏ—ｉｍｍｕｎｅｕｖｅｉｔｉｓ，ＥＡＵ）是一种由Ｔ细胞介导的自身免疫性疾病，通常作为研究ｏｇｔ—Ｋｏｙａｎａｇｉ—Ｈａｒａｄａｓｙｎｄｒｏｍｅ、Ｂｅｃｈｃｅｔ’ｓｄｉｓｅａｓｅ、ｂｉｒｄｓｈｏｔｒｅｔｉｎｏｃｈｏｒｏｉｄｏｐ－ａｔｈｙ和ｓｙｍｐａｔｈｅｔｉｃｏｐｈｔｈａｌｍｉａ等眼部疾病的动物模型。
通过给动物注射视网膜感光受体结合蛋白（ｉｎ—ｔｅｌ＇ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒｒｅｔｉｎｏｉｄ—ｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ。
ＩＲＢＰ）、可溶性视黄醇抗原或被动输注抗原活化的特异性Ｔ细胞均可成功诱导ＥＡＵ。
研究表明：ＩＲＢＰ１—２０特异性ＣＤ８＋Ｔ细胞是ＥＡＵ慢性发作的重要致病细胞，其活化不仅需要抗原和抗原提旱细胞，而且需要外源性细胞因子【３Ｊ。
ＩＬ一１５在ＩＲＢＰｌ一２０特异性ＣＤ８＋Ｔ细胞活化、分化中的作用还未见报道。
１实验部分１．１试剂与动物视网膜感光受体结合蛋白ｌ一２０（ＩＲＢＰ１—２０）、ＰｒｏｔｅｉｎＡ—Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ亲合层析纯化试剂盒（Ｓｉｇｍａ公司）；重组小鼠ＩＬ一１５蛋白（Ｒ＆Ｄ公司）；胶回收、质粒ＤＮＡ制备、Ｔ４ＤＮＡ连接、ＲＴ—ＰＣＲ试剂盒、ＣＨＯ—Ｓ细胞、ｐｃＤＮＡ３．１（ａ＋）质粒、ｔｒｉｚｏｌ、引物、核酸内切酶、ＴＯＰＯＴＡｃｌｏｎｉｎｇ＠ｋｉｔ、Ｇ４１８、Ｌｉ—ｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司）；所用荧光标记抗体、抗鼠ＩＬ—１５抗体、ＣＤ４０／Ｆｃ融合蛋白（ＢＤＢｉｏ．ｓｃｉｅｎｃｅ公司）；小鼠ＣＩＭ、ＣＤ８分离纯化试剂盒（ＭｉｈｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃＩｎｃ．，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）；羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯（ＣＦＳＥ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ—ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ公司）。
啮齿类小鼠γ-干扰素原核表达、纯化及功能鉴定
啮齿类小鼠γ－干扰素原核表达、纯化及功能鉴定目的：构建γ-干扰素的高效原核表达载体，进行γ-干扰素表达、纯化和鉴定，并探索优化啮齿类γ-干扰素的制备工艺。
方法：用RT-PCR技术，从ConA 活化的小鼠脾细胞中扩增出mIFN-γcDNA，与原核表达载体pET30a(+)重组，表达和纯化重组蛋白His6-mIFN-γ，并用Western Blot检测该重组蛋白的生物学活性。
结果：构建了啮齿类γ-干扰素的高效原核表达载体，并实现了γ-干扰素的可溶性表达，且验证该γ-干扰素具有生物学活性。
结论：成功优化了生产干扰素的工艺，为国内外进行γ-干扰素研究奠定基础。
[Abstract] Objective:To clone murine interferon-gamma gene, do effective prokaryotic expression and purify recombinant murine IFN-γ for further study.Methods:To amplify mIFN-γcDNA from ConA-activated murine splenocytes by RT-PCR and clone into pET30a(+) vector．Then the target protein His6-mIFN-γ was induced by IPTG and purified with Ni2+-NTA agarose. The biologic activity was identified by western blotting.Results:The prokaryotic expression system of mIFN-γ was constructed．And the fusion protein mIFN-γ was dissoluble and bioactive.Conclusion:The technology of mIFN-γ production is successfully optimized. It lays a foundation of further research of IFN-γ．[Key Words] IFN-γ；Prokaryotic expression；Purification英國国立医学研究所的Isancs和Lindenman在研究病毒的干扰现象时发现了一种可溶性物质，进一步研究表明这一物质能够抑制多种病毒在细胞内的繁殖，于是将其命名为干扰素（interferons，IFN）[1]。
兔IFRG基因的克隆及表达分析
兔IFRG基因的克隆及表达分析彭丽婵;丁彪;钱怀剑;李文雍【摘要】实验通过对兔子基因组DNA进行PCR获得兔IFRG基因,将其克隆到pGEM-T载体,双酶切鉴定和测序结果表明成功构建了重组克隆载体pGEM-T-IFRG.通过RT-PCR分析发现IFRG基因在兔不同组织中有不同程度的表达.将重组克隆载体pGEM-T-IFRG和表达载体pET-41(c)经过EcoR1和Xho1双酶切后连接构建重组表达载体pET-41(C)-IFRG,将双酶切鉴定正确的重组表达载体转化入E.coli BL21,IPTG诱导融合蛋白的表达,SDS-PAGE结果显示兔IFRG基因在大肠杆菌中得到了良好的表达.【期刊名称】《生物学杂志》【年(卷),期】2010(027)003【总页数】3页(P5-7)【关键词】IFRG基因;基因克隆;RT-PCR;原核表达【作者】彭丽婵;丁彪;钱怀剑;李文雍【作者单位】安徽大学生命科学学院,合肥,230039;安徽农业大学动物科技学院,合肥,230036;安徽大学生命科学学院,合肥,230039;阜阳师范学院生命科学学院,阜阳,236041【正文语种】中文【中图分类】Q785;Q7861957年Isaacs和Lindenmann首先发现了病毒干扰现象，即病毒感染的细胞能够产生一种因子，作用于其他细胞并干扰病毒的复制，因而命名为干扰素[1](interferon IFN)。
在过去的几十年当中，科学家发现许多不同种类的哺乳动物在妊娠早期滋养层细胞能分泌干扰素，并在早期植入前胚胎中也发现了干扰素及其受体。
因而开始了干扰素在早期胚胎发育中的研究。
滋养层蛋白干扰素τ是最早被发现的胚胎来源的干扰素，干扰素τ能够阻止子宫内膜黄体的作用而使母体对怀孕进行识别[2-3]，此外干扰素τ在胚胎植入子宫时也发挥重要的作用[4]。
研究小鼠早期胚胎发育时发现，IFNα在小鼠的卵母细胞和植入前胚胎中都有表达，推测IFNα在胚胎形成中起作用[5]。
猫干扰素ω和干扰素γ的可溶性原核表达、纯化及安全性初步评价
猫干扰素ω和干扰素γ的可溶性原核表达、纯化及安全性初步评价猫干扰素ω和干扰素γ的可溶性原核表达、纯化及安全性初步评价引言：干扰素是一类具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等多种生物学活性的蛋白质。
近年来，人们对干扰素的研究取得了很大进展，但关于猫干扰素的研究较少。
本研究旨在通过原核表达系统，实现猫干扰素ω和干扰素γ的可溶性表达，并对其进行纯化和初步的安全性评价。
材料与方法：1、重组质粒构建：将猫干扰素ω和干扰素γ的基因序列克隆入原核表达载体中。
2、原核表达：将重组质粒转化至大肠杆菌中，通过诱导表达，获得可溶性表达的重组蛋白。
3、蛋白纯化：通过亲和层析柱，将重组蛋白从细菌裂解液中纯化出来，并进行浓缩。
4、SDS-PAGE分析：对纯化后的蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳分析，确定其纯度和分子量。
5、Western blot验证：利用特异性抗体对重组蛋白进行Western blot验证其表达。
结果：成功构建了猫干扰素ω和干扰素γ的重组质粒，并将其转化至大肠杆菌中进行表达。
通过诱导表达后，成功获得了可溶性表达的重组蛋白。
经过亲和层析柱的纯化，得到了纯度较高且浓缩的重组蛋白。
经过SDS-PAGE分析，蛋白呈现单一的条带，证明纯化效果较好。
通过Western blot验证，确认了重组蛋白的表达。
讨论：本研究通过原核表达系统成功实现了猫干扰素ω和干扰素γ的可溶性表达，并对其进行了纯化和初步的安全性评价。
猫干扰素ω和干扰素γ具有抗病毒和免疫调节等多种活性，其研究对于猫传染病的治疗和免疫增强具有重要意义。
然而，本研究还存在一些问题。
首先，需要进一步验证重组蛋白的生物活性，如抗病毒活性和免疫调节能力。
其次，还需要对重组蛋白的安全性进行更加严格的评价，包括毒性测试和过敏原性评估等。
结论：本研究成功实现了猫干扰素ω和干扰素γ的可溶性原核表达，并对其进行了纯化和初步的安全性评价。
猫干扰素在抗病毒和免疫调节等方面具有潜在的应用价值。
hGDF-15基因的克隆及原核表达
hGDF-15基因的克隆及原核表达丛凡淏;赵金乔;刘毅;杨竞平;张林波【期刊名称】《西北农林科技大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2016(044)008【摘要】[目的]克隆人生长分化因子-15(Human growth differentiation factor-15,hGDF-15)成熟肽基因,构建其原核表达载体,并进行诱导表达,为hGDF-15药理活性和生物学功能研究奠定基础.[方法]利用PCR技术克隆人hGDF-15成熟肽基因,将其连接到pET-28a载体上构建pET-28a-hGDF-15原核表达载体,并将此载体转入Rosetta(DE3)大肠杆菌感受态细胞,获得重组大肠杆菌,对目的蛋白分别采用不同温度(16,25,37℃)、IPTG浓度(0.10,0.25,0.50,0.75,1.00 mmol/L)和时间(12,24,36,48 h)进行诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE电泳和Western blot 检测,利用Gel Quant Express软件对菌体破碎离心的上清组分和沉淀组分中的蛋白含量进行测定,通过正交试验,分析上清组分和沉淀组分的最适诱导表达条件.[结果]成功获得hGDF-15成熟肽基因,其长度为339bp;构建了pET-28a-hGDF-15原核表达载体,并诱导表达了hGDF-15蛋白;优化的上清组分最适诱导条件为IPTG浓度0.25 mmol/L、温度16℃、时间24 h,沉淀组分最适诱导条件为温度37℃、时间36 h、IPTG浓度1.00 mmol/L.[结论]成功克隆了hGDF-15基因,在大肠杆菌中诱导表达出其编码蛋白,并优化出了最适诱导表达条件.【总页数】8页(P197-204)【作者】丛凡淏;赵金乔;刘毅;杨竞平;张林波【作者单位】吉林农业大学生命科学学院,吉林长春130118;吉林农业大学生命科学学院,吉林长春130118;吉林农业大学生命科学学院,吉林长春130118;吉林农业大学生命科学学院,吉林长春130118;吉林农业大学生命科学学院,吉林长春130118【正文语种】中文【中图分类】R392.11【相关文献】1.人类扭转蛋白A的基因克隆、表达与蛋白质纯化(Ⅰ)——DYT1基因克隆与原核表达 [J], 周雪莹2.草地贪夜蛾组织蛋白酶L的基因克隆、原核表达及多克隆抗体制备 [J], 程杏安;林贤伟;蒋旭红;刘展眉;钟国华;胡美英3.猪丁型冠状病毒S1基因的克隆、原核表达及多克隆抗体制备 [J], 李成;赵勤;伍锐;张雨迪;黄小波;刘浩宇;刘志鹏;赵玉佳;曹三杰;文心田;文翼平4.枸杞木糖异构酶基因LbxylA的克隆、原核表达及多克隆抗体的制备 [J], 赵建华;李浩霞;尹跃;王亚军;李彦龙;樊云芳;安巍;曹有龙5.二点委夜蛾非典型嗅觉受体AlepOrco的基因克隆、原核表达及多克隆抗体制备[J], 田彩红;刘晓光;黄建荣;王瑛;封洪强因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
从干扰素(interferons,IFNs)被发现至今已有五十余年，期间人们始终没有间断对其进行研究。
近期研究表明，IFN α、IFN τ和IFN γ在哺乳动物早期胚胎发育中均有重要的功能(Roberts et al.,1999;Ushizawa et al.,2004;Cencic and Bonnardiere,2002)，而IFNs 这些功能可能是通过JAK/STAT 信号通路实现的(Truchet et al.,2001;Imaakawa et al.,2002)。
干扰素应答基因(interferon responsive gene 15,Ifrg15)是干扰素与细胞膜上的受体结合后诱导表达的一族基因(Darnell et al.,1994;Stark et al.,1998)，其编码的蛋白产物可抑制病毒的复制，从而实现干扰素抗病毒的生物功能(Der et al.,1998)。
ˇ研究报告A Letter小鼠干扰素应答基因(Ifrg15)的克隆、原核表达及其融合蛋白的亲和纯化丁彪1,2刘一飞1张运海2李文雍1*1阜阳师范学院生命科学学院胚胎发育与生殖调节安徽省重点实验室，阜阳236041；2安徽农业大学动物科技学院，合肥230036*通讯作者，Wyli97303@摘要为研究一个可能的干扰素应答基因(interferon responsive gene 15,Ifrg15)所编码蛋白质的生物学功能，对昆明小鼠(Mus musculus )基因组DNA 进行PCR 扩增获得Ifrg15(393bp)，并将其克隆到pGEM-T 载体，经测序鉴定后用Eco R Ⅰ和Xho Ⅰ酶切下Ifrg15基因片段并和双酶切后的表达载体pET-41(c)进行连接，然后转化入大肠杆菌(Escherichia coli )BL21(DE3)感受态细胞。
对重组克隆用IPTG 诱导融合蛋白的表达，并进行分离纯化。
结果表明，本实验在E.coli BL21(DE3)菌株中成功地高效表达、并在变性亲和层析条件下成功纯化了GST&6xHis-Ifrg15融合蛋白。
关键词干扰素应答基因(Ifrg15)，基因克隆，原核表达，亲和层析Cloning and Prokaryotic Expression of Mouse Interferon Responsive Gene (Ifrg15)and Affinity Purification of Its Fusion ProteinDing Biao 1,2Liu Yifei 1Zhang Yunhai 2Li Wenyong 1*1College of Life Sciences,Fuyang Normal University,Key Laboratory of Embryo Development and Reproductive Regulation,Anhui Province,Fuyang 236041,China;2College of Animal Science and Technology,Anhui Agricultural University,Hefei 230036,China *Corresponding author,Wyli97303@ DOI:10.3969/j.issn.1674-7968.2010.06.021Abstract In order to study the function of a putative interferon responsive gene (Ifrg15),the genomic DNA ofKunming White mouse(Mus musculus )was purified and used as the PCR template for amplifying the Ifrg15coding region.The PCR product was cloned into pGEM-T vector and confirmed by DNA sequencing.The Ifrg15fragment was subcloned into pET-41(c)vector by Eco R Ⅰand Xho Ⅰdouble-digestion.Escherichia coli BL21(DE3)transformants were then selected and tested by IPTG induction for high level expression of GST&6xHis-Ifrg15fusion protein.The results showed that mouse Ifrg15gene was successfully cloned and expressed in the prokaryotic expression system.By using denaturing condition in the affinity chromatographic step,a decent level of purification of GST&6xHis-Ifrg15fusion protein was achieved.KeywordsInterferon responsive gene(Ifrg15),Gene cloning,Prokaryotic expression,Affinity chromatography农业生物技术学报，2010年，第18卷，第6期，第1168~1172页Journal of Agricultural Biotechnology,2010,Vol.18,No.6,1168~1172DOI:10.3969/j.issn.1674-7968.2010.06.021基金项目：本研究由国家自然科学基金项目(No.30871415,31071310)和安徽高校省级自然科学研究规划重点项目(No.KJ2008A136)共同资助收稿日期：2009-11-26接受日期：2009-12-29小鼠干扰素应答基因(Ifrg15)的克隆、原核表达及其融合蛋白的亲和纯化Cloning and Prokaryotic Expression of Mouse Ifrg15Gene and Affinity Purification of Its Fusion Protein齐冰等(2006)用mRNA差异显示技术对兔植入前正常胚胎与克隆胚胎研究发现，存在一个异常表达的基因，经鉴定，该基因编码区DNA序列与小鼠Ifrg15基因有89%同源性，该研究认为Ifrg15可能与兔早期胚胎发育、卵子的发生、成熟等生理过程密切相关。
Vassena等(2007)用基因芯片分析小鼠克隆胚1-细胞和2-细胞期的转录物组时，发现很多基因异常表达，其中Ifrg15在正常胚胎中的表达比克隆胚高2.24倍。
以上研究均提示Ifrg15在哺乳动物胚胎的早期发育过程中可能有着非常重要的功能，并且其异常表达可能在一定程度上导致克隆胚胎的发育异常。
但目前对Ifrg15蛋白的功能还了解甚少。
小鼠Ifrg15基因的cDNA序列虽在1999年已被测定(Carninci and Hayashizaki,1999)，但除了NCBI中对该基因的简单描述外，至今还未见任何有关其研究的文献报道。
小鼠Ifrg15的开放阅读框包含396bp(GenBank AK032697.1)，编码131个氨基酸，与兔Ifrg15的氨基酸序列具有98%的同源性。
作者通过对GenBank中公开的鼠Ifrg15基因组DNA和mRNA序列进行分析后发现，该基因不存在内含子。
所以在本研究中，首先对小鼠基因组DNA进行PCR扩增获得了Ifrg15的基因片段，进而利用大肠杆菌表达系统成功地高效表达了GST&6xHis-Ifrg15融合蛋白，并通过亲和层析法较好地纯化了该融合蛋白，为下一步研究Ifrg15蛋白的功能提供重要基础。
1结果与分析1.1小鼠基因组DNA提取和Ifrg15扩增小鼠Ifrg15的ORF含393bp(GenBank AK0326 97.1)，上游引物从ORF的5'端起始，下游引物从ORF的3'端起始，加上Eco RⅠ和XhoⅠ两个酶切位点共411bp。
基因组DNA及PCR扩增Ifrg15产物经1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测。
从图1可以看出，基因组DNA条带清晰、明亮，质量较好。
Ifrg15扩增产物大小约为411bp，与理论值相符。
1.2pGEM-T-Ifrg15重组质粒测序及双酶切鉴定将胶回收试剂盒回收、纯化的Ifrg15基因片段经Eco R I和Xho I双酶切后与pGEM-T载体连接，连接后转入大肠杆菌DH5α感受态细胞，对阳性克隆进行质粒提取并送上海生工测序，测序结果与小鼠Ifrg15基因中的编码区序列一致(GenBank AK032697.1)。
将重组质粒进行双酶切后经1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示两条清晰电泳条带，一条为411bp左右的目的基因条带，一条为pGEM-T载体大片段(图2)。
1.3重组表达载体的构建及鉴定用胶回收试剂盒回收经Eco RⅠ和XhoⅠ双酶切pGEM-T-Ifrg15重组质粒的目的基因，与经Eco R Ⅰ和XhoⅠ酶切并回收的pET-41(c)载体片段进行连接反应，连接产物转入BL21(DE3)感受态细胞，挑菌、摇菌后用Promega质粒小提试剂盒对1mL菌液进行质粒提取，然后对提取产物进行双酶切鉴定，酶切产物经1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2，一条为pET-41(c)载体大片段，一条为目的基因条带，大小411bp左右(图3)。
图2克隆载体pGEM-T-Ifrg15重组质粒双酶切鉴定M：DNA marker DL2000；1：重组T载体双酶切产物Figure2Identification of recombinant plasmid pGEM-T-Ifrg15 by double enzyme digestionM：DNA marker DL2000;1：Recombinant T vector digested with Eco RⅠand XhoⅠM1pGEM-TIfrg15bp20001000750250100500图1小鼠肝脏基因组DNA和Ifrg15扩增产物凝胶电泳M：DNA marker DL2000；1：小鼠基因组DNA；2：Ifrg15(411 bp)PCR扩增产物Figure1Electrophoresis of mouse genomic DNA and PCR amplification products of Ifrg15from mouse liver genomic DNA M：DNA marker DL2000;1：Mouse genomic DNA;2：PCR amplification products of Ifrg15(411bp)M12bp200010007505002501169农业生物技术学报Journal of Agricultural Biotechnology 1.4重组蛋白的原核表达pET-41(c)载体表达的融合蛋白包含有GST 和6xHis 蛋白标签，标签序列共288个氨基酸，产物大小约32kD ，小鼠Ifrg15的ORF 编码131个氨基酸，大小约15kD ，融合蛋白的大小约为47kD 。