LUNA氨基柱的使用方法
盐酸氨基葡萄糖颗粒的含量测定方法研究
h t t p ://X B Y Z .c b pt .c n k i .n e t ㊃药物分析㊃盐酸氨基葡萄糖颗粒的含量测定方法研究但晓梦,谢育媛,郭江红*,姜 红*湖北省药品监督检验研究院,国家药品监督管理局血液制品质量控制重点实验室,武汉 430073摘要:目的 分析盐酸氨基葡萄糖颗粒剂中辅料蔗糖㊁乳糖等对主药氨基葡萄糖质量控制的影响,建立测定盐酸氨基葡萄糖颗粒剂含量的高效液相色谱法(h i g h p e r f o r m a n c e l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y,H P L C ),并提高其质量标准㊂方法 采用H P L C -紫外检测法㊂色谱柱为C A P C E L L P A K N H 2柱(150mmˑ4.6mm ,3μm );以磷酸盐缓溶液(取磷酸氢二钾3.5g ,加水1000m L 使溶解,加入0.25m L 氨水,用磷酸调节p H 值至7.5)-乙腈(25ʒ75)为流动相;流速为1.5m L ㊃m i n -1;检测波长为195n m ;进样量为20μL ㊂结果 采用优化后的质量控制方法,能有效分离盐酸氨基葡萄糖颗粒中主药氨基葡萄糖与其辅料(蔗糖㊁乳糖㊁聚维酮K 30),盐酸氨基葡萄糖质量浓度在1.46~10.99m g㊃m L -1范围内与峰面积呈良好的线性关系(r =0.9991),平均回收率为100.6%,R S D 值为0.5%,检测下限和定量限为0.4和1.0μg㊂结论 该方法能准确测定盐酸氨基葡萄糖颗粒含量,方法简便㊁准确㊁专属性强㊂关键词:盐酸氨基葡萄糖颗粒;质量控制;含量测定;高效液相色谱法D O I :10.3969/j.i s s n .1004-2407.2022.02.006中图分类号:R 927.2 文献标志码:A 文章编号:1004-2407(2022)02-0027-04S t u d y o f t h e c o n t e n t d e t e r m i n a t i o n m e t h o d o f G l u c o s a m i n e H yd r o c h l o r i de G r a n u l e s D A N X i a o m e n g ,X I E Y u y u a n ,G U O J i a n g h o n g *,J I A N G H o n g*H u b e i I n s t i t u t e f o r D r u g C o n t r o l ,NM P A K e y L a b o r a t o r y f o r Q u a l i t y Co n t r o l o f B l o o d P r o d u c t s ,W u h a n 430073,C h i n a A b s t r a c t :O b j e c t i v e T o a n a l y z e t h e e f f e c t s o f s u c r o s e a n d l a c t o s e e x c i p i e n t s o n t h e q u a l i t y c o n t r o l o f G l u c o s a m i n e H yd r o c h l o r i de G r a n u l e s ,e s t a b l i s h a h i g h p e rf o r m a n c e l i q u i d c h r o m a t og r a ph y (H P L C )m e t h o d f o r d e t e r mi n i n g th e c o n t e n t o f G l u c o s a m i n e H y d r o c h l o r i d e G r a n u l e s ,a n d t o i m p r o v e i t s s t a n d a r d .M e t h o d s H P L C c o u p l e d w i t h u l t r a -v i o l e t s p e c t r o m e t r y w a s u s e d b y u s i n gL u n a N H 2c o l u m n (150mmˑ4.6mm ,3μm ),a n d t h e m o b i l e p h a s e w a s a mm o n i u m p h o s p h a t e b u f f e r (d i s s o l v i n g d i po t a s s i u m p h o s p h a t e 3.5g a n d a mm o n i u m h y d r o x i d e 0.25m L i n t o 1000m L w a t e r ,a d j u s t i n g t h e p H t o 7.5w i t h p h o s ph o r i c a c i d )-a c e t o n i t r i l e (25ʒ75).T h e f l o w r a t e w a s 1.5m L ㊃m i n -1a n d t h e d e t e c t i o n w a v e l e n g t h w a s s e t a t 195n m.T h e i n je c t i o n v o l u m e w a s 20μL .R e s u l t s T h e o p t i m i z e d q u a l i t y c o n t r o l m e t h o d w a s a d o p t e d ,w h i c h c o u l d ef f e c t i v e l y s e p a r a t e t h e m a i n c o m po n e n t s o f G l u c o s a m i n e H y d r o c h l o r i d e G r a n u l e s a n d i t s e x c i p i e n t s ,s u c r o s e ,l a c t o s e a n d K 30.T h e l i n e a r r a n g e o f g l u c o s a m i n e h yd r o c h l o r i de w a s 1.46-10.99m g ㊃m L -1(r =0.9991),a n d t h e a v e r a g e r e c o v e r y wa s 100.6%(R S D=0.5%).T h e d e t e c t i o n l i m i t a n d q u a n t i t a t i v e l i m i t w e r e 0.4a n d 1.0μg ,r e s p e c t i v e l y .C o n c l u s i o n T h e m e t h o d c a n e f f e c t i v e l y de t e r m i n e t h e c o n t e n t of G l u c o s a m i n e H y d r o c h l o r i d e G r a n u l e s ,w h i c h i s s i m pl e ,a c c u r a t e a n d r e l i a b l e .K e y wo r d s :G l u c o s a m i n e H y d r o c h l o r i d e G r a n u l e s ;q u a l i t y c o n t r o l ;c o n t e n t d e t e r m i n a t i o n ;h i g h p e r f o r m a n c e l i q u i d c h r o m a t o g r a -p h y (H P L C )基金项目:国家药典委员会标准提高项目(编号:国药典综发 2016 183号);湖北省药品监督管理局科研项目(编号:20200117)作者简介:但晓梦,女,主管药师*共同通信作者:郭江红,女,副主任药师;姜红,女,主任药师盐酸氨基葡萄糖是人体关节软骨基质合成蛋白聚糖必需的重要成分,主要用于预防和治疗各种类型的骨性关节炎,如膝关节㊁髋关节㊁脊柱㊁肩㊁手腕和踝关节等部位以及全身性的骨性关节炎[1-3]㊂氨基葡萄糖是软骨基质和滑液中合成氨基葡聚糖和蛋白聚糖的组分和首选底物㊂氨基葡萄糖可刺激软骨细胞产生具有正常多聚体结构的糖蛋白,抑制损害关节软骨的酶(如胶原酶和磷脂酶A 2等)的活性,抑制损伤细胞的超氧化物自由基的产生,从而减少损伤细胞内毒素因子的释放㊂又因其属于生物提取物质,故安全性较高,不良反应极少,因而被广泛用于医药及保健食品领域,用于治疗全身各种骨性关节炎[4-6]㊂随着人们对身体健康重视程度的逐年提高,盐酸氨基葡萄糖类药物应用于治疗骨性关节炎的使用量也随之显著增长㊂近年来,盐酸氨基葡萄糖类药物上市剂型由经典的胶囊剂㊁普通片剂衍生出了更多的剂型,如颗粒剂㊁散剂㊁泡腾片剂,提示该类药物的市场需求量较大[7-8]㊂通过检索国家食品药品监督管理局网站上的基础数据库可知,盐酸氨基葡萄糖颗粒在国内有2家生产企业,分别为企业A (企业注册标准Y B H 02202009)和企业B (企业注册标准Y B H 00352014)㊂企业A 生产的盐酸氨基葡萄糖颗粒的辅料为蔗糖㊁聚维酮K 30,企业B 的辅料为蔗糖㊁聚维酮K 30㊁乳糖等㊂现阶段氨基葡萄糖类药物国家质量标准尚未统一[9-13],相关生72西北药学杂志 2022年3月 第37卷 第2期产企业仅凭各自的企业注册标准对氨基葡萄糖类药物进行检测,而其中含量测定等关键项目质量控制方法差异较大且并不适用于盐酸氨基葡萄糖颗粒剂的检测,主要原因在于盐酸氨基葡萄糖颗粒剂的辅料中包含蔗糖㊁乳糖等物质,均为小分子糖类,在企业注册标准中含量测定色谱条件下较难分离,故不能有效控制产品含量[14-16]㊂因此,亟待对盐酸氨基葡萄糖颗粒标准进行深入研究㊂1仪器与试药1.1仪器W a t e r s e2695A l l i a n c e高效液相色谱仪,包括柱温箱㊁在线真空脱气机㊁2489紫外检测器以及E m p o w e r色谱工作站(美国W a t e r s公司);X P205电子天平(梅特勒-托利多公司)㊂1.2试药盐酸氨基葡萄糖颗粒(企业A,批号12A170303㊁12A170304;企业B,批号190202㊁190204㊁190205)㊂盐酸氨基葡萄糖对照品(批号140649-201606,质量分数100%,中国食品药品检定研究院);盐酸氨基葡萄糖原料药(批号1803-2018-H020,浙江诚意药业有限公司);蔗糖(批号20190409,嘉兴市白浪淀粉制品有限公司);聚维酮K30(批号200816,安徽山河药用辅料有限公司);乳糖(批号200801,企业A);氯化钠㊁磷酸氢二钾㊁氨水㊁磷酸(分析纯,国药集团化学试剂有限公司);乙腈(色谱纯,美国T e d i a天地试剂公司);水为超纯水㊂2方法与结果2.1色谱条件色谱柱:C A P C E L L P A K N H2柱(150mmˑ4.6mm,5μm);流动相:磷酸盐溶液(取磷酸氢二钾3.5g,加水1000m L使溶解,加入0.25氨水,用磷酸调p H值至7.5)-乙腈(25ʒ75);流速:1.5m L㊃m i n-1;进样量:20μL;柱温:30ħ;检测波长:195n m㊂2.2溶液的制备2.2.1空白辅料定位溶液蔗糖溶液:精密称取蔗糖213.0m g,置于10m L量瓶中,加水使其溶解并稀释至刻度,摇匀,过滤,取续滤液稀释至质量浓度为10m g㊃m L-1,即得㊂聚维酮K30溶液:精密称取聚维酮K30205.1m g,置于10m L量瓶中,加水使其溶解并稀释至刻度,摇匀,过滤,即得㊂乳糖溶液:精密称取乳糖112.5m g,置于10m L量瓶中,加水使其溶解并稀释至刻度,摇匀,过滤,即得㊂2.2.2氯离子(C l-)溶液精密称取12.8m g氯化钠置于10m L量瓶中,加水使其溶解并稀释至刻度,摇匀,作为C l-定位溶液㊂2.2.3供试品溶液精密称取盐酸氨基葡萄糖颗粒粉末(相当于氨基葡萄糖约200m g),置于50m L量瓶中,加水使其溶解并稀释至刻度,摇匀,过滤,取续滤液作为供试品溶液㊂2.2.4对照品溶液精密称取盐酸氨基葡萄糖对照品,加水使其溶解并定量稀释制成每1m L中约含盐酸氨基葡萄糖4.0m g的溶液㊂2.3专属性实验精密量取2.2.1~2.2.4项下的溶液各20μL,按照2.1项下色谱条件测定,记录色谱图㊂在上述色谱条件下,盐酸氨基葡萄糖颗粒剂中成盐离子氯离子(R t=2.30m i n)㊁辅料蔗糖(R t=11.14m i n)㊁乳糖(R t=15.96m i n,倒峰)及聚维酮K30(R t=1.26m i n)对氨基葡萄糖(R t=13.05m i n)的测定均无干扰㊂结果见图1㊂注:A.溶剂空白;B.盐酸氨基葡萄糖颗粒供试品溶液;C.C l-;D.蔗糖;E.乳糖;F.聚维酮K30;1.氨基葡萄糖;2.C l-;3.蔗糖;4.乳糖;5.聚维酮K30㊂图1盐酸氨基葡萄糖颗粒含量测定系统适用性H P L C图F i g.1H P L C c h r o m a t o g r a m s o f s y s t e m s u i t a b i l i t y t e s t o f t h e c o n t e n t d e t e r m i n a t i o n m e t h o d o fG l u c o s a m i n eH y d r o c h l o r i d e G r a n u l e s 82西北药学杂志2022年3月第37卷第2期h t t p://X B Y Z.c b p t.c n k i.n e t2.4线性关系考察精密称取盐酸氨基葡萄糖对照品146.64m g,置于10m L量瓶中,加水使其溶解并稀释至刻度,摇匀,配制成含盐酸氨基葡萄糖质量浓度为14.6m g㊃m L-1的溶液,作为储备液㊂分别量取储备液适量,用水稀释制成1m L含盐酸氨基葡萄糖1.46㊁3.66㊁5.86㊁7.33㊁8.79㊁10.99m g的溶液,分别吸取上述溶液各20μL 注入液相色谱仪,记录色谱图㊂以峰面积为纵坐标(y)㊁质量浓度为横坐标(x)进行线性回归㊂结果表明,盐酸氨基葡萄糖质量浓度在1.46~10.99m g㊃m L-1范围内时,与峰面积呈良好的线性关系㊂回归方程为y=277074x-12990,R=0.9991㊂2.5检测限与定量限实验精密称取盐酸氨基葡萄糖对照品17.63m g,置于5m L量瓶中,加水使其溶解并稀释至刻度,摇匀;再精密量取上述溶液1m L,置于25m L量瓶中,用水稀释至刻度,摇匀,在H P L C色谱仪检测器稳定操作的条件下进样8μL,所得信噪比(S/N)为13.2,即定量限为1.1 g㊂在高效液相色谱仪检测器稳定操作的条件下进样上述溶液3 L,所得信噪比(S/N)为3.1,即定量限为0.4 g㊂2.6精密度实验取盐酸氨基葡萄糖颗粒适量,用水配制成质量浓度约为4m g㊃m L-1的盐酸氨基葡萄糖溶液,重复进样测定6次,记录其峰面积㊂计算得R S D值为0.2%,表明该方法的精密度良好㊂2.7加样回收率实验取盐酸氨基葡萄糖颗粒(企业B,批号190205) 2.6356g,加水300m L使其溶解并稀释至刻度(盐酸氨基葡萄糖的质量浓度为2.0m g㊃m L-1),摇匀,作为盐酸氨基葡萄糖颗粒回收率本底溶液㊂用于精密配制含盐酸氨基葡萄糖对照品(质量浓度4m g㊃m L-1) 80%㊁100%㊁120%3种不同的9份模拟样品,扣除回收率本底溶液后已知药物的质量浓度分别约为3.2㊁4.0㊁4.8m g㊃m L-1,作为加样回收率供试品溶液㊂按照拟定的含量测定方法测定;另取盐酸氨基葡萄糖对照品104.2m g,置于25m L量瓶中,加水使其溶解并稀释至刻度,摇匀,作为对照品溶液㊂根据盐酸氨基葡萄糖加入量与测得量计算回收率,计算得平均回收率为100.6%,R S D值为0.5%㊂结果见表1㊂2.8重复性实验按照2.2.3项下方法,称取盐酸氨基葡萄糖颗粒样品(企业B,批号190205)适量,制备6份供试品溶液,精密量取20 L注入液相色谱仪,记录色谱图㊂计算得6份供试品溶液的平均含量为99.6%,R S D 值为0.6%,说明该方法的重复性良好㊂表1盐酸氨基葡萄糖颗粒的回收率实验结果T a b.1R e s u l t s o f r e c o v e r y t e s t o f G l u c o s a m i n e H y d r o c h l o r i d eG r a n u l e s编号加入量/m g测得量/m g回收率/%平均回收率/%R S D/% 80%188.889.40100.68284.084.49100.59380.280.68100.60100%1102.4103.99101.552103.5104.14100.623103.3104.30100.97120%1132.9133.06100.122121.9121.6799.813130.3130.87100.44100.60.52.9稳定性实验称取盐酸氨基葡萄糖颗粒适量,用水配制成氨基葡萄糖质量浓度约为4m g㊃m L-1的溶液,分别于0㊁2㊁16㊁37h测定峰面积,考察供试品溶液的稳定性㊂结果表明,供试品溶液在37h内稳定㊂2.10样品测定本实验共收集到5批盐酸氨基葡萄糖颗粒样品,精密称取各批装量差异项下样品(约相当于氨基葡萄糖200m g),按照2.2.3项下供试品溶液配制方法进行配制,以盐酸氨基葡萄糖对照品为外标,结果见表2㊂结果显示,5批样品均符合规定[本品含盐酸氨基葡萄糖(C6H13N O5㊃H C l)应为标示量的90.0% ~110.0%]㊂表25批样品的测定结果T a b.2D e t e r m i n a t i o n r e s u l t s o f5s a m p l e s药物名称生产厂家批号含量/%盐酸氨基葡萄糖颗粒企业A12A17030393.0盐酸氨基葡萄糖颗粒企业A12A17030494.3盐酸氨基葡萄糖颗粒企业B19020299.9盐酸氨基葡萄糖颗粒企业B190204100.8盐酸氨基葡萄糖颗粒企业B19020599.6 3讨论3.1现行标准含量测定方法存在的问题现行质量标准均采用高效液相色谱-紫外检测法(H P L C-U V)测定含量,企业注册标准Y B H02202009采用的流动相体系为p H2.5磷酸二氢钾溶液-乙腈(30ʒ70),企业注册标准Y B H00352014采用的流动相体系为p H7.0的磷酸氢二钾溶液-乙腈(33ʒ67)㊂2种流动相体系p H值差异较大,p H2.5磷酸二氢钾溶液-乙腈体系的p H值较低,会引发氨基柱填料水92西北药学杂志2022年3月第37卷第2期h t t p://X B Y Z.c b p t.c n k i.n e t解;p H7.0的磷酸氢二钾溶液-乙腈体系无法分离氨基葡萄糖峰与其辅料蔗糖峰㊂本文拟采用氨基柱-H P L C-U V法,该方法适用性较强,与柱前衍生等方法相比,操作简单且专属性较强㊂考虑到各企业生产的氨基柱差异较大,拟对氨基柱进行严格的筛选,最终确定以大曹三耀公司生产的氨基柱(C A P C E L L P A K N H2,150m mˑ4.6m m,5μm)为分离色谱柱,以磷酸盐缓溶液(取磷酸氢二钾3.5g,加水1000m L 使溶解,加入0.25m L氨水,用磷酸调节p H值至7.5)-乙腈(25ʒ75)为流动相体系,在该色谱条件下,既能实现氨基葡萄糖与其成盐离子氯离子的较好分离,又能实现盐酸氨基葡萄糖颗粒剂中氨基葡萄糖与其辅料蔗糖㊁乳糖和聚维酮K30的良好分离,从而有效㊁准确地测定其主药成分氨基葡萄糖的含量㊂3.2色谱柱的选择考虑到盐酸氨基葡萄糖颗粒中辅料蔗糖㊁乳糖和聚维酮K30对主药氨基葡萄糖的影响,在拟定的流动相体系下对4个品牌的色谱柱进行了筛选和考察㊂结果显示:①美国P h e n o m e n e x公司生产的氨基柱(L u n a N H2150mmˑ4.6mm,5μm)虽能较好地分离氨基葡萄糖峰与其成盐离子峰,峰形较好,但无法分离辅料蔗糖峰和氨基葡萄糖峰,调整流动相比例后仍无法分离;②纳谱分析氨基柱(250mmˑ4.6mm, 5μm)分离蔗糖峰和氨基葡萄糖峰的能力较弱,且氨基葡萄糖峰与乳糖峰的保留时间相对较近,调整流动相比例后会出现氨基葡萄糖峰与乳糖峰部分重叠的情况;③W a t e r s氨基柱(150mmˑ4.6mm,5μm)能较好地分离氨基葡萄糖峰与其成盐离子峰和辅料乳糖峰㊁聚维酮K30峰,但无法完全分离氨基葡萄糖峰和辅料蔗糖峰;④大曹氨基柱(C A P C E L L P A K N H2, 150m mˑ4.6m m,5μm)能较好地分离主峰氨基葡萄糖与其成盐离子氯离子峰,亦能较好地分离氨基葡萄糖峰与其辅料蔗糖峰㊁乳糖峰㊂在确定选用大曹三耀公司生产的氨基柱后,为了进一步提高氨基葡萄糖与蔗糖的分离度,对色谱柱的使用温度进行了筛选,在柱温30㊁35ħ下分别进样盐酸氨基葡萄糖颗粒供试品溶液,发现在柱温为30ħ时,氨基葡萄糖峰与蔗糖峰能较好分离㊂经实验最终确定将大曹三耀公司的氨基柱(C A P C E L L P A K N H2,150mmˑ4.6mm, 5μm)作为本研究的方法学色谱柱㊂4小结盐酸氨基葡萄糖颗粒现行各质量标准收载的含量测定方法均不一致,流动相体系差异较大,且均无法分离主药氨基葡萄糖与其辅料蔗糖㊁乳糖等,不能有效控制药物含量㊂在本研究建立的含量测定条件下,盐酸氨基葡萄糖颗粒剂中的主药氨基葡萄糖与其成盐离子(C l-)能被较好地分离,同时氨基葡萄糖与其辅料蔗糖㊁乳糖也能被较好地分离㊂结果表明,该方法专属性强㊁重复性好,能较好地满足相关药物生产企业的检测条件,故该含量测定方法能满足准确测定盐酸氨基葡萄糖颗粒含量的要求㊂该研究可为盐酸氨基葡萄糖颗粒剂或其他剂型的后续研究提供参考,为氨基葡萄糖类药物质量标准的提高提供技术支持㊂参考文献:[1] Z HA N G H K,L U Y T,WA N G Y H,e t a l.D-g l u-c o s a m i n e p r od u c t i o n f r o m c h i t o s a n h y d r o l y z a t i o n o ve r ag l u c o s e-d e r i v e d s o l i d a c i d c a t a l y s t[J].R S C A d v a n c e s,2018,8(10):5608-5613.[2] M I T C H E L L A,T H I E R MA N N C.S e l e c t i v i t y o f n o n s t e-r o i d a l a n t i i n f l a m m a t o r a r y d r u g s a s i n h i b i t o r s o f c o n s t i t u t i v ea n d i n d u c ib l ec y c l o x y g e n a s e[J].P r o c N a t l A c ad S c i U S A,1993,90(24):11693-11697.[3]张丽.硫酸氨基葡萄糖治疗膝骨关节炎的临床疗效分析[J].世界最新医学信息文摘,2017,17(11):101-102. 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常用液相色谱柱的规范化使用与保养标准操作规程完整
常用液相色谱柱的规范化使用与保养标准操作规程完整.目的：规范液相色谱柱的使用与管理；液相色谱柱标准化老化与再生；剖析液相色谱柱常见问题与解决办法。
延长色谱柱使用寿命，降低色谱柱使用成本。
提高分析人员液相色谱柱使用与维护水平。
范围：适用于使用高效液相色谱仪的仪器分析操作人员及相关管理人员。
责任：设备员、液相操作人员、质控主管、质量管理部经理、质量受权人。
内容：1.定义1.1 液相色谱柱：指用于液相色谱分离的柱形固定相，由柱管、压帽/卡套、筛板（滤片）、填料、接头等组合而成，可用于液相色谱分析与制备。
1.2 色谱柱再生：指色谱柱在非正常情况下，针对异常现象及原因采取的一系列修复补救措施，以提高色谱柱柱效和延长其使用寿命的处理过程。
1.3 运载溶剂：指色谱柱生产厂商在柱出厂测试合格后饱和于色谱柱内的合适溶剂，以利于运输保存，多与保存溶剂相同。
1.4 保存条件：指色谱柱生产厂商根据不同柱类型及其色谱柱填料的制备、键合、装填、高压定型、净化干燥等工艺条件的不同要求而特别制定的色谱柱保存前净化饱和的处理程序与储存条件，包括净化程序、净化溶剂和保存溶剂、保存条件。
1.5 保存溶剂：用于保存色谱柱并指定了溶剂组成与比例的溶液。
1.6 反相色谱柱：以键合非极性基团的载体为填充剂填充而成的色谱柱。
常见的载体有硅胶、聚合物复合硅胶和聚合物等。
常用的填充剂有十八烷基硅烷键合硅胶、辛基硅烷键合硅胶和苯基键合硅胶等。
1.7正相色谱柱：用硅胶填充剂，或键合极性基团的硅胶填充而成的色谱柱，常见的填充剂有硅胶、氨基键合硅胶和氰基键合硅胶等。
1.8氨基柱（-NH2）：可以同时用于正相条件和反相条件，但多用于正相色谱条件。
使用时需注意，正相反相交替使用时必需用异丙醇过度，保证柱保存溶剂与流动相互溶。
[氨基柱出厂保存溶剂多用正相溶剂，例如：正己烷-乙腈（99：1）]。
2.液相色谱柱的使用及保养.2.1普通C8及C8反相色谱柱的老化处理与使用保养程序新购色谱柱出厂前均采用适合的运载溶剂饱和，密封，由于运输过程周期较长，柱床容易干涸，所以新柱使用前需重新饱和与老化。
色谱柱使用手册
正相、反相和极性胶联柱使用手册分类:质量检验 2007.3.22 22:20 作者：LAI | 评论：0 | 阅读：146正相、反相和极性胶联柱使用手册Chrompack HPLC Normal-,Reversed phase and Polar bonded columns 注意:此色谱柱填充的是改性硅胶材料。
向柱内导入碱性溶剂（pH>7.0）或酸性溶剂（pH<2.0）会导致柱子损坏。
在使用这个柱子之前，你要充分地熟悉这本手册讲述的内容。
未正确地使用不能享受保修待遇。
1．简介此柱填充的是反相或者极性胶联型态的硅胶基质材料的硅胶。
硅胶形态的柱子用于正相（非水）条件。
反相（C8，C18，ODS，RP-8和RP-18）通常用于反相条件（水相）。
极性胶联型（APS，diol，CN和NH2）依照应用目的，可以用于正相和反相条件。
建议不要将一个相同的柱子用于差别非常大的条件下，这是因为柱子在特定的条件下，固定相的性质会发生变化，所以在其他的条件下，会影响柱效。
也不建议将硅胶柱用在反相条件下或者将方向柱用在正相条件下，这是因为这种过程会发生重复性差的问题（每一次注射之间和柱与柱之间的比较）。
2．色谱柱老化在开始分析工作以前，柱子必须经过正确的老化。
一个没有正确老化的柱子可能会带来问题，诸如很差的柱效或者分离情况发生变化等等。
A．在反相条件下老化要老化这类柱子，首先要使用乙腈或者甲醇淋洗，然后你选用的洗脱液进行平衡。
在发货以前，每根柱子都已经测试过并进行了老化。
因此没有必要在第一次使用时用水冲洗）。
如果流动相中使用了添加物（例如缓冲液或离子对试剂），建议使用正确比例的但不含此添加物的流动相进行缓冲冲洗。
缓冲冲洗应当首先以低流速进行，最后再使用正常流速。
B．在正相条件下老化柱效可能会受水与固定相的键合的严重影响。
柱子的干燥（激活）或润湿（失活）可能是需要的。
使用的溶剂可能是水饱和的或者是无水的。
干燥柱子可以使用无水的二氯甲烷。
最全的色谱柱使用手册!
最全的色谱柱使用手册！色谱又称色层法或层析法，是一种物理化学分析方法，它利用不同溶质(样品)与固定相和流淌相之间的作用力(安排、吸附、离子交换等)的差别，当两相做相对移动时，各溶质在两相间进行多次平衡，使各溶质达到相互分别。
01柱色谱为向玻璃管中填入固定相，以流淌相溶剂浸润后在上方倒入待分别的溶液，再滴加流淌相，由于待分别物质对固定相的吸附力不同，吸附力大的固着不动或移动缓慢，吸附力小的被流淌相溶剂洗下来随流淌相向下流淌，从而实现分别。
02纸色谱以滤纸条为固定相，在纸条上点上待分别的混合溶液的样点，将纸条下端浸入流淌相溶剂中悬挂，溶剂由于毛细作用沿滤纸条上升，样点中的溶质从而被分别。
03薄层色谱是在玻璃板上涂以固定相涂层，然后点样，下端浸入溶剂，同样自下而上分别。
常用于探究柱色谱试验条件，溶剂和固定相的选择等。
常用固定相有石膏、氧化铝、蔗糖、淀粉等，常用流淌相为水、苯等各种有机溶剂。
影响色谱柱使用寿命的主要因素流淌相因素1.流淌相pH不同基质的填料具有不同的pH适用范围。
常温下无定形硅胶在纯水中的溶解度约为100mgL-1，且在pH1～9的范围内溶解的硅胶量几乎是常量，考虑到溶解速度的影响,对于硅胶基质的填料,其所能承受的流淌相pH范围约为1～8。
键合相硅胶填料则由于键合层的屏蔽作用,使填料对流淌相的适应范围大大增加，如现在广泛使用的反相色谱填料C18(十八烷基硅烷键合硅胶)，其pH适用范围可达2～10。
当流淌相pH值超出酸性范围时，键合相易发生水解而流失；当流淌相pH超出碱性范围时，会加速硅胶的溶解而释放出絮状物堵塞柱子，这两种反应均是不行逆反应，特殊是在温度较高（40℃）的环境下，会使柱效快速降低而报废。
2.流淌相变质当前使用最为广泛的是硅基键合相填料，当以水溶液作为流淌相或流淌相中含有肯定浓度的磷酸盐缓冲液时，水溶液中或缓冲盐溶液中会滋生出一些细菌或霉菌，从而堵塞固定相颗粒间的空隙。
特殊是对于多元自动比例混合的高效液相色谱仪来说,水相或缓冲盐相单独存贮，因存放时间较长而简单发生此类问题。
常用液相色谱柱的规范化使用与保养标准操作规程完整
目的：规液相色谱柱的使用与管理；液相色谱柱标准化老化与再生；剖析液相色谱柱常见问题与解决办法。
延长色谱柱使用寿命，降低色谱柱使用成本。
提高分析人员液相色谱柱使用与维护水平。
围：适用于使用高效液相色谱仪的仪器分析操作人员及相关管理人员。
责任：设备员、液相操作人员、质控主管、质量管理部经理、质量受权人。
容：1.定义1.1 液相色谱柱：指用于液相色谱分离的柱形固定相，由柱管、压帽/卡套、筛板（滤片）、填料、接头等组合而成，可用于液相色谱分析与制备。
1.2 色谱柱再生：指色谱柱在非正常情况下，针对异常现象及原因采取的一系列修复补救措施，以提高色谱柱柱效和延长其使用寿命的处理过程。
1.3 运载溶剂：指色谱柱生产厂商在柱出厂测试合格后饱和于色谱柱的合适溶剂，以利于运输保存，多与保存溶剂相同。
1.4 保存条件：指色谱柱生产厂商根据不同柱类型及其色谱柱填料的制备、键合、装填、高压定型、净化干燥等工艺条件的不同要求而特别制定的色谱柱保存前净化饱和的处理程序与储存条件，包括净化程序、净化溶剂和保存溶剂、保存条件。
1.5 保存溶剂：用于保存色谱柱并指定了溶剂组成与比例的溶液。
1.6 反相色谱柱：以键合非极性基团的载体为填充剂填充而成的色谱柱。
常见的载体有硅胶、聚合物复合硅胶和聚合物等。
常用的填充剂有十八烷基硅烷键合硅胶、辛基硅烷键合硅胶和苯基键合硅胶等。
1.7正相色谱柱：用硅胶填充剂，或键合极性基团的硅胶填充而成的色谱柱，常见的填充剂有硅胶、氨基键合硅胶和氰基键合硅胶等。
1.8氨基柱（-NH2）：可以同时用于正相条件和反相条件，但多用于正相色谱条件。
使用时需注意，正相反相交替使用时必需用异丙醇过度，保证柱保存溶剂与流动相互溶。
[氨基柱出厂保存溶剂多用正相溶剂，例如：正己烷-乙腈（99：1）]。
2.液相色谱柱的使用及保养2.1普通C8及C8反相色谱柱的老化处理与使用保养程序新购色谱柱出厂前均采用适合的运载溶剂饱和，密封，由于运输过程周期较长，柱床容易干涸，所以新柱使用前需重新饱和与老化。
氨基柱 保存 方法
氨基柱保存方法
氨基柱是一种用于色谱分离的柱子，通常用于分离和纯化蛋白
质和肽段。
为了保持其性能和延长使用寿命，正确的保存方法至关
重要。
首先，对于氨基柱的保存，应该避免暴露在极端温度下，最好
存放在常温下，远离阳光直射和高温环境。
此外，氨基柱应该放置
在干燥的环境中，避免受潮或受到水分影响，因为水分可能会影响
柱子的性能。
其次，当氨基柱不在使用时，需要用适当的缓冲液或溶剂进行
储存。
通常情况下，可以使用一些常见的缓冲液比如PBS（磷酸盐
缓冲液）或者甲醇等。
在存放之前，应该用缓冲液进行充分的洗脱，然后用同样的缓冲液进行封存。
这可以防止柱子中的样品残留物变干，影响下一次的使用。
另外，为了保护氨基柱，建议在柱子两端安装保护柱（guard column），这样可以延长氨基柱的使用寿命。
同时，定期对氨基柱
进行保养和清洗也是非常重要的。
在使用完毕后，用适当的缓冲液
进行冲洗，并用推荐的储存溶剂进行封存。
总的来说，正确的保存方法对于延长氨基柱的使用寿命和保持其分离性能非常重要。
避免极端温度、湿度和阳光直射，使用适当的缓冲液进行储存，并定期进行保养和清洗，这些都是保护氨基柱的关键步骤。
希望这些信息能够帮助你更好地保存和保护氨基柱。
HP-Amino柱 使用手册
样品与流动相
为了避免色谱柱的堵塞，所有样品和溶剂，包 括缓冲溶液在内，都必须在使用前用 0.45m 或 0.2m 的滤膜过滤。HP-Amino 键合固定相与许多 溶剂相容，这些溶剂既可以是非极性溶剂如异丙醇 /己烷等，也可以是极性溶剂如水、有机试剂与水的 混合物（如甲醇或乙腈的水溶液） ，或缓冲液（如 磷酸盐或硼酸盐）等。流动相在使用前需要脱气。 一个简单的脱气方法是将流动相在由水泵形成的 真空下超声 5min。
稳定性和性能
HP-Amino 柱使用的是被完全覆盖的键合硅胶 填料，因此具有优异的化学稳定性，特别适合于许 多分析物的确认。所采用的化学键合技术可避免形 成复合的氨丙基分子层。具备这种均匀涂层的固定 相具有高选择性和高分离效率的特点。分离可以在 诸如己烷等非极性溶剂或乙腈的水溶液等极性溶 剂中进行。右图是对 4.6250mm HP-Amino 柱进行 测试得到的色谱图。
安全注意事项
HP-Amino 柱通常在高压下运行。如果管路连 接不紧，将会导致有机溶剂和注入样品的泄漏，从 而对操作人员的健康产生影响。一旦发生泄漏，应 佩戴适当的手套进行处理。另外当打开色谱柱时还 应采取适当的保护措施，以防止微小的硅胶颗粒进 入呼吸道。
端口的螺纹相互衔接，然后拧紧管线接头。如果管 线为高分子材料，请转到步骤（d） ；如果是金属管 线，请继续（c） 。 （c） 在用力将管线压入柱端接口之后， 用 1/4”扳手 将已拧紧的螺帽再进一步紧固。 （d）对色谱柱的另一端采用上述方法进行操作。 新的 HP-Amino 柱保存在 QC 测试用的流动相 中。在储存和运输过程中，硅胶填料可能会干涸。 这时推荐用 10-20 倍柱体积的纯有机溶剂进行冲洗 以活化色谱柱，需注意与色谱柱的保存溶剂有很好 的相容性。接着可用用户自己选择的流动相冲洗色 谱柱。 流速由 0.1mL/min 逐渐升至所需的操作条件， 直至基线稳定为止。
NH2柱使用说明书
⑤ 以下使用方法一般会导致色谱柱劣化，故应避免此类操作。 频繁变更流动相的组成和直接变更相溶性差的流动相 色谱柱入口压力的急剧变化 选用粘度高的流动相而导致色谱柱压升高 长时间通水 pH（为了使样品充分离子化，流动相 pH 最好与样品的 pKa 相差 2.0 以上。 ） 盐浓度 有机溶剂量 盐的种类
尾端接头
锥箍 螺头
図-1 过滤筛板
カラムの接続 配管
图 1 色谱柱的连接图 ※ 频繁更换色谱柱，可能会导致螺头的锥箍损坏而发生漏液现象。这种情况下若拧得过紧，螺母的头部 可能会断裂。 使用 PEEK 规格的配管时，请确保配管的前端已插入接头里侧。 6. 尾端接头 ① 内径为 3.0～8mm 的分析用色谱柱采用了过滤筛板埋入式尾端接头，无法只更换过滤筛板。
资生堂(中国)投资有限公司 先端科学事业推进部 地址：北京市建国门外大街甲 6 号 SK 大厦 2208 室 邮编：100022 电话：010-65633288 传真：010-85670598
③ 尿囊素的分析 尿囊素在 pH 2～8 范围内未离子化，但在流动相中采用磷酸缓冲液，按照 HILIC 模式能够实施分析。 流动相例：25 mmol/L KH2PO4 / CH3CN = 20 / 80，pH=2（H3PO4）
4. 色谱柱的保存 ① 请用附带的堵头密封，保存在温差小的阴冷处。 ② 若是一个月以内的保存，请使用与所选用的流动相组成相同的有机溶剂和水的混合溶液(不含酸、 无机盐)进行置换(禁止只用水来进行置换)。 ③ 若是一个月以上的长期保存，在进行了②的处理之后，用出厂时的溶剂置换并保存起来(参照色谱 柱报告)。 5. 色谱柱的连接 按照图 1 所示进行配管连接。 若配管不适合， 特别是直接使用其他类型色谱柱所用配管(SUS 规格)时， 锥箍前端的长度（图 1 中的 V）与尾端接头的长度（图 1 中的 L）经常会不同，因而引发故障。 若 L＞V，会产生死体积，甚至出现色谱峰展宽或拖尾现象，并且分离变差。 若 L＜V，由于锥箍无法密封，所以会导致漏液。
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LUNA氨基柱的使用方法
1. 氨基柱既可以正相使用，也可以反相使用，但是要注意到的是：正相溶剂和反相溶剂往往是不互溶的，正常情况新氨基柱保存在正相环境中，例如LUNA 氨基柱保存在正己烷-乙腈（99：1）中。
2. 正相使用
2.1 新柱子可直接用流动相。
推荐先用正己烷-乙腈（99：1）以0.5ml/min的流速冲10倍柱体积，再根据流动相选用极性相近的氯仿或二氯甲烷以相同的流速冲10倍柱体积，最后换成流动相。
2.1 正相使用时，不宜分析含醛基、羰基的化合物，不可用于还原糖的分析；流动相要彻底脱气，并不得含有羰基化合物和过氧化物（质量不好的乙醚、四氢呋喃含有少量）。
2.3 任何时候更换流动相时都要确保新流动相与柱子原保存液可互溶。
3 反相使用
3.1 新柱启用先用异丙醇以0.4ml/min的流速冲2小时。
3.2 配制流动相时，应各组分分别量取，比例较小的组分要精密量取，需调pH值时要精密到0.1。
3.3 反相条件下使用时，要特别注意控制pH值范围，pH值越低越有发生水解的危险，流动相中水的比例越高当然也越有发生水解的危险。
最理想的pH范围在pH 3.0-7.0
3.4 如果要使用的流动相中还含有缓冲盐类，建议在用分析流动相之前，先用不含缓冲盐的同比例流动相过渡，这样可避免缓冲盐在分析柱内的析出。
3.5 有一种情况是，当使用氨基柱进行酸性物质的分析时，酸性物质的存在意味着质子的存在，可能会使略带负电荷的氨基官能团质子化，导致使用一段时间后对于某些类的分析物保留性质有所改变或表现在柱效下降。
建议：用5-10倍的柱体积的含0.5-1.0％NH3的乙腈-水(50:50)溶液冲洗该柱（冲洗后当然要再用不含碱的流动相洗去多余氨），之后再进行分析这类酸性分析物时建议在流动相中略微添加少许氨如0.1％。
3.6 再生：以0.5ml/min的流速用30倍柱体积的pH11.0的氢氧化钠（LUNA）水溶液冲柱子（注意pH值切不可超过11.0），立即用水（0.5ml/min的流速，30倍柱体积）冲洗，再换成流动相。
4 色谱柱的冲洗：简单说起来，正相条件下使用的氨基柱就参照硅胶柱的清洗方法；反相条件下使用的氨基柱就参照C18的清洗方法。
5 色谱柱的保存
5.1 正相使用时，将柱子冲洗干净后，用正己烷-乙腈（99：1）保存。
5.2 反相使用时，如短期不用，可用甲醇或乙腈保存；长期不用时需将甲醇用异丙醇置换，最后用正己烷保存。
250*4.6mm的柱体积：4.2ml
氨基柱的使用事项：
新柱子让他们记得用异丙醇0.2ml过夜平衡
做鸟氨酸必须多平衡一下，要不不稳。