蛋白酶的盐析沉淀
盐析法沉淀蛋白质的原理
蛋白质在水溶液中的溶解度是由蛋白质周围亲水基团与水形成水化膜的程度，以及蛋白质分子带有电荷的情况决定的。
当用中性盐加入蛋白质溶液，中性盐对水分子的亲和力大于蛋白质，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失。
同时，中性盐加入蛋白质溶液后，由于离子强度发生改变，蛋白质表面电荷大量被中和，更加导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。
盐析法是指在药物溶液中加入大量的无机盐，使某些高分子物质的溶解度降低沉淀析出，而与其他成分分离的方法。
盐析法主要用于蛋白质的分离纯化。
常作盐析的无机盐有硫酸钠、硫酸镁、硫酸铵等。
还有其他方法能够沉淀蛋白质，比如重金属盐沉淀蛋白质
蛋白质可以与重金属离子如汞、铅、铜、银等结合成盐沉淀，沉淀的条件以pH稍大于等电点为宜。
因为此时蛋白质分子有较多的负离子易与重金属离子结合成盐。
重金属沉淀的蛋白质常是变性的，但若在低温条件下，并控制重金属离子浓度，也可用于分离制备不变性的蛋白质。
临**利用蛋白质能与重金属盐结合的这种性质，抢救误服重金属盐中毒的病人，给病人口服大量蛋白质，然后用催吐剂将结合的重金属盐呕吐出来解毒。
蛋白酶的分离纯化原理
蛋白酶的分离纯化原理蛋白酶是一类能够对蛋白质进行水解的酶，其在生物体内起着重要的调节和催化作用。
蛋白酶的分离纯化是研究蛋白酶的功能和特性的基础，也是生物医学研究和工业应用的重要环节之一。
蛋白酶的分离纯化的原理主要基于蛋白酶的特性以及其与其他分子间的相互作用。
下面将从多个方面详细讨论蛋白酶的分离纯化原理。
1. 选择性沉淀：蛋白酶的分离纯化常常以选择性沉淀为起点。
选择性沉淀通过改变蛋白酶溶液的pH 值、温度和添加特定试剂或溶剂等方法，使蛋白酶发生变性、沉淀或与其他蛋白质结合，利用这些特性差异实现蛋白酶的分离。
例如，可以通过调节溶液pH 值使蛋白酶发生电荷改变，导致其溶液中的部分蛋白酶发生离子态变化而沉淀出来。
此外，还可以利用特定的有机溶剂如乙醇、异丙醇或氯仿等，将蛋白酶从溶液中沉淀出来。
2. 胶束层析：胶束层析是一种常用的蛋白酶分离纯化方法，其原理是根据蛋白酶与胶束的亲和性差异实现分离。
胶束层析常使用表面活性剂如SDS（十二烷基硫酸钠）或聚乙烯吡咯烷酮（PVP）等形成胶束，利用胶束与蛋白酶形成复合物，通过调节胶束与蛋白酶之间的亲和力，实现蛋白酶的分离。
例如，可以通过改变溶液中SDS 的浓度，控制蛋白酶与SDS之间的作用力，从而实现不同蛋白酶的分离。
3. 电泳分离：电泳是一种利用电场将蛋白质分离的方法，通过对蛋白酶溶液进行电泳，可以根据蛋白酶的电荷、大小和形状的差异实现蛋白酶的分离。
电泳分离常用的方法有凝胶电泳和等电点聚焦电泳。
在凝胶电泳中，蛋白酶在电场中迁移，根据蛋白质的分子量和电荷差异，将蛋白酶从溶液中分离出来。
在等电点聚焦电泳中，蛋白酶在具有梯度pH值的凝胶中迁移，直到达到等电点位置停止迁移，实现蛋白酶的分离。
4. 亲和层析：亲和层析是一种基于蛋白质与亲和配体之间的高度特异性结合作用实现蛋白质的富集和纯化的方法。
蛋白酶亲和层析可以利用蛋白酶与特定亲和配体的结合实现蛋白酶的富集和分离。
常见的亲和配体有抗体、亲和柱和亲和分子等。
盐析法沉淀蛋白质的原理
在溶液中加入中性盐使生物大分子沉淀析出的过程称为“盐析”。
除了蛋白质和酶以外，多肽、多糖和核酸等都可以用盐析法进行沉淀分离。
盐析法应用最广的还是在蛋白质领域，已有八十多年的历史，其突出的优点是：
①成本低，不需要特别昂贵的设备。
②操作简单、安全。
③对许多生物活性物质具有稳定作用。
蛋白质和酶均易溶于水，因为该分子的－COOH、－NH2和－OH都是亲水基团，这些基团与极性水分子相互作用形成水化层，包围于蛋白质分子周围形成1nm～100nm颗粒的亲水胶体，削弱了蛋白质分子之间的作用力，蛋白质分子表面极性基团越多，水化层越厚，蛋白质分子与溶剂分子之间的亲和力越大，因而溶解度也越大。
亲水胶体在水中的稳定因素有两个：即电荷和水膜。
因为中性盐的亲水性大于蛋白质和酶分子的亲水性，所以加入大量中性盐后，夺走了水分子，破坏了水膜，暴露出疏水区域，同时又中和了电荷，破坏了亲水胶体，蛋白质分子即形成沉淀。
通过盐析沉淀蛋白质的原理实际上是降低蛋白质的溶解度，从而使蛋白质聚集并最终从溶液中沉淀出来。
蛋白质的沉淀实际上是蛋白质分子聚集而从溶液中沉淀出来的现象。
一般来说，检查是对富含蛋白质的物质进行的。
如果在实验过程中需要分离和提取步骤，则需要有效去除大量干扰测定的蛋白质沉淀，以使所测毒物完整保留
在溶液中，因此需要盐析以沉淀出蛋白。
蛋白质沉淀法实际上是在实验室分析有毒物质过程中对生物样品进行预处理的相对通用和常用的方法。
酶的沉淀分离
三 盐析中通常采用的盐 ₮ 强酸弱碱盐，如硫酸铵等(最常用) 强酸弱碱盐，如硫酸铵等(最常用)
优点: 优点: 不影响酶的活性 ˧
˧ 硫酸铵在水中的溶解度大而温度系数小
(在25℃时，溶解度为767g/L；在0℃时， 溶解度为697g／L) 。 分离效果好 ˧
˧ 价廉易得
缺点 硫酸铵进行盐析时缓冲能力差（溶液变酸) ˧
₮优点
˧ 有机溶剂沉淀法分辨率比盐析法要高 ˧ 有机溶剂容易除去或回收 无须脱盐 ˧ ˧ 酶沉淀易于离心分离或过滤
₮缺点
˧ 容易引起酶的变性失话 ˧ 必须在低温条件下操作 ˧ 沉淀析出后要尽快分离
S:蛋白酶在离子强度为 时的溶解度( S:蛋白酶在离子强度为I时的溶解度(g/L) 蛋白酶在离子强度为I S。:蛋白酶在离子强度为0时(即纯溶剂 蛋白酶在离子强度为0 的溶解度( 中)的溶解度(g/L) Ks —盐析常数 盐析常数 I — 离子强度
与蛋白特性、溶液温度、pH、盐的特性和浓度有关 与蛋白特性、溶液温度、pH、
蛋白酶分离纯化技术
沉淀分离
徐杰
2008 2008
第五节 沉淀分离
一、盐析沉淀法 ₮ 盐溶的定义和原理 一般在低盐浓度的情况下，蛋白酶 的溶解度随盐浓度的升高而增加 原理 盐正负离子使电荷的相互排斥作用 増强；同时离子的存在使溶液中水之 间的作用加大。
₮ 盐析的定义和原理 盐浓度提高到一定浓度后，蛋白酶 盐浓度提高到一定浓度后， 的溶解度随盐浓度的升高而下降 原理
˧ 铵离子会干扰蛋白质测定
硫酸铵分部沉淀
蛋白酶经15% 35%硫酸铵分部沉淀 蛋白酶经15%-35%硫酸铵分部沉淀 15%-
˧W:将1L的S1饱和度的溶液提高到S2饱和度时，所
实验二 碱性蛋白酶的盐析沉淀
实验二碱性蛋白酶的盐析沉淀一．实验目的和要求1.了解盐析沉淀法的基本原理和实验方法。
2.以2709碱性蛋白酶为实验对象，建立酶溶解度和盐离子强度之间的关系式（Cohn 经验式），并作出曲线图。
3.通过对酶活性的测定和收率计算，综合评价盐析沉淀的最适工艺条件。
二．实验原理盐析沉淀法是生物大分子物质蛋白质（酶）常用的提取方法。
其原理与蛋白质的表面结构有关，盐析产生沉淀是两种因素共同作用的结果，即蛋白质表面疏水键之间的吸力和带电基团吸附层的静电斥力作用。
在盐析溶液中后者作用大于前者，产生盐析现象，但在高盐溶液中作用相反，故产生盐析沉淀。
对蛋白质（酶）而言，溶解度与盐离子强度之间关系符合Cohn经验式（式1-4-1）:LgS=β-ksI式中：S—蛋白质（酶）的溶解度I—盐离子强度I= 1/2∑C i Z i2式中：Ci—i离子的物质的量浓度（mol/L）Zi—i离子所带电荷β—常数，与盐的种类无关，而与温度和PH有关Ks—盐析常数，与温度和PH无关，与蛋白质（酶）和盐种类有关上式为LgS对I的线性方程，反映了不同蛋白质（酶）的盐析特征。
通过本实验求出一定的条件下（PH和温度）碱性蛋白酶的Ks 和β，建立其盐析方程。
盐析中，常用的盐析剂为硫酸铵。
硫酸铵的加量有不同的表示方法，常用“饱和度”来表征其在溶液中的最终浓度，“饱和度”的定义为在盐析溶液中所含的硫酸铵质量与该溶液达到饱和所溶解的硫酸铵质量之比。
25℃时硫酸铵的饱和浓度为4.1mol/L（即767g/L），定义它为100﹪饱和度，为了达到所需的饱和度，应加入固体硫酸铵的量可由附五查的。
在一定条件下，无机盐的加量对盐析收率和酶的纯度影响很大，适宜的加量应从收率和纯度两方面综合考虑。
三：实验器材与试剂（一）器材高速冷冻离心机，电子台秤，真空干燥箱，酸度计，移液吸管（或可调式移液器），烧杯，搅拌棒和量筒等。
（二）试剂碱性蛋白酶粗淀粉，硫酸铵和NaOH等。
四.操作方法1.制备酶液称取一定的量粗淀粉，加入适量40—50℃温水，40℃水浴中侵泡并搅拌30min,高速冷冻离心机离心:10℃,9000—10000r/min，30min,取出上清液，。
盐析法沉淀酶
盐析法沉淀酶盐析法沉淀酶是一种常用的生物化学实验技术，通过加入盐类物质使蛋白质等生物大分子从溶液中析出。
本文将介绍盐析法的基本原理、实验步骤、应用以及在实验中的优点和局限性。
1.盐析法的基本原理盐析法是一种物理方法，主要利用盐类物质与生物大分子（如蛋白质）的相互作用，改变溶液中生物大分子的溶解度。
当盐浓度逐渐增加时，生物大分子与盐离子结合，形成不稳定的复合物，从而导致生物大分子从溶液中析出。
2.盐析法沉淀酶的实验步骤盐析法沉淀酶的实验步骤主要包括以下几个：（1）准备样品：通常选用酶溶液，如蛋白质酶、核酸酶等。
（2）梯度盐析：将盐浓度逐渐增加，观察酶溶液中酶的析出情况。
（3）收集沉淀：当盐浓度达到一定程度时，酶溶液中的酶会析出形成沉淀。
可通过离心、过滤等方法收集沉淀。
（4）洗涤沉淀：收集到的沉淀中可能含有其他杂质，可用无盐溶液或低盐溶液进行洗涤，以去除杂质。
（5）重溶解：将洗涤后的沉淀重新溶解在适当浓度的盐溶液中，以测定酶的活性。
3.盐析法在生物化学中的应用盐析法在生物化学领域具有广泛的应用，如分离纯化酶、蛋白质、核酸等生物大分子。
此外，还可用于研究酶的结构与功能、生物分子互作等。
4.盐析法沉淀酶的优点与局限性优点：（1）操作简便：盐析法操作简单，无需使用复杂设备。
（2）可重复性：盐析法具有较好的重复性，适用于大规模生产。
（3）可选择性：可通过调整盐浓度和实验条件，实现对不同生物大分子的沉淀。
局限性：（1）盐析法沉淀酶的纯度较低，适用于初步分离和纯化酶。
（2）盐析法对盐种类和浓度有一定要求，需要优化实验条件。
5.总结盐析法沉淀酶是一种生物化学实验技术，通过调整盐浓度实现对生物大分子的沉淀。
盐析法操作简便、可重复性好，但在纯化酶等方面存在局限。
生物化学实验蛋白质沉淀反应与盐析作用解析
生物化学实验_蛋白质沉淀反应与盐析作用_解析生物化学实验：蛋白质沉淀反应与盐析作用一、引言蛋白质是生物体内的重要分子，其性质和功能对于生物的生命活动具有重要意义。
在生物化学实验中，蛋白质的沉淀反应和盐析作用是常见的实验技术，用于分离、纯化和鉴定蛋白质。
本实验旨在让学生了解和掌握蛋白质沉淀反应和盐析作用的原理和方法。
二、实验原理1.蛋白质沉淀反应蛋白质沉淀反应是指通过改变某些条件（如pH、离子强度、温度等），使蛋白质分子之间或蛋白质分子与其它物质之间发生相互作用，从而导致蛋白质聚集的现象。
常见的蛋白质沉淀反应包括盐析、有机溶剂沉淀、等电点沉淀、重金属盐沉淀等。
2.盐析作用盐析作用是指在高浓度盐溶液中，蛋白质的溶解度降低，从而析出成沉淀的现象。
这种现象是由于高浓度盐溶液中的离子强度较高，导致蛋白质分子表面的电荷减少，进而减弱了蛋白质分子之间的相互作用，使蛋白质聚集成为沉淀。
三、实验材料与设备实验材料：牛血清蛋白（BSA）、硫酸铵、乙醇、苯酚、考马斯亮蓝G-250；实验设备：离心机、分光光度计、电子天平、容量瓶、三角瓶、滴管。
四、实验步骤1.蛋白质沉淀反应（1）在5个100mL的三角瓶中分别加入20mL 0.1M NaCl溶液，再分别加入5mg BSA，摇匀。
（2）向每个三角瓶中分别加入0.1M醋酸溶液或0.1M NaOH溶液，使溶液的pH分别为5、6、7、8、9。
（3）观察各瓶中溶液的颜色变化，记录沉淀出现的时间和数量。
（4）将各瓶中的溶液进行离心分离，收集沉淀。
用考马斯亮蓝G-250染色法测定各沉淀中蛋白质的质量。
2.盐析作用（1）将牛血清蛋白配制成0.05M的溶液，并分别加入不同浓度的硫酸铵溶液（如0M、0.1M、0.2M、0.3M、0.4M），充分摇匀。
（2）将各溶液放入离心机中，在3000rpm下离心30分钟，收集沉淀。
（3）分别用乙醇和苯酚处理各沉淀，测定各沉淀中蛋白质的质量。
五、实验结果与分析1.蛋白质沉淀反应结果与分析在不同pH值下，BSA的溶解度不同。
盐析法沉淀蛋白质的原理
盐析法沉淀蛋白质的原理盐析法沉淀蛋白质原理：蛋白质在水溶液中的溶解度取决于蛋白质分子表面离子周围的水分子数目，亦即主要是由蛋白质分子外周亲水基团与水形成水化膜的程度以及蛋白质分子带有电荷的情况决定的。
蛋白质溶液中加入中性盐后，由于中性盐与水分子的亲和力大于蛋白质，致使蛋白质分子周围的水化层减弱乃至消失。
同时，中性盐加入蛋白质溶液后由于离子强度发生改变，蛋白质表面的电荷大量被中和，更加导致蛋白质溶解度降低，之蛋白质分子之间聚集而沉淀。
由于各种蛋白质在不同盐浓度中的溶解度不同，不同饱和度的盐溶液沉淀的蛋白质不同，从而使之从其他蛋白中分离出来。
简单的说就是将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质在水溶液中的稳定性因素去除而沉淀。
①蛋白质变性主要发生在二硫键和非共价键，不涉及一级结构的破坏；②变性的蛋白质易于沉淀，但沉淀的蛋白质不一定变性；③变性的蛋白质不一定凝固，但凝固的蛋白质一定变性；④蛋白质变性最主要的表现是：生物学活性的减弱或者丧失。
蛋白质变性后的特点：溶解度降低（易于沉淀）、黏度增加、结晶能力消失、生物学活性丧失（大家都沉淀在一起，不能各司其职）、易被蛋白酶水解。
另外，造成蛋白质变性的主要因素包括：加热、酒精、强酸强碱、重金属离子、生物碱试剂。
蛋白质的空间结构：①一级结构：从N端到C端的氨基酸排列顺序，主要的维系键是肽键；②二级结构：指某一段肽链的局部空间结构，包括α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规卷曲，主要作用键是氢键；③三级结构：所有原子在三维空间的排布位置，例子有结构域、分子伴侣，靠疏水键、盐键、氢键、范德华力维持；④四级结构：蛋白质分子各亚基间的空间排布，靠氢键和离子键维持。
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4—酶反应液为4 ml，取出1 ml测定，故乘以4
10—反应时间为10 min
参考稀释倍数：原酶、饱和度20%，30%，40%， 50%，60%，70%的上清液分别为1000，200，150， 100，100，100，50倍
计算出各种硫酸铵饱和度下的硫酸铵浓 度，离子强度，蛋白酶溶解度和上清液 酶活残留，并填表。
以log S为纵坐标，I为横坐标作图，将 直线部分线性回归，求出Ks和β的数值， 建立起蛋白酶的盐析曲线。
1.将2%酪蛋白溶液40℃预热3-5min
2. 取3支试管编号0、1、2，分别吸取待测酶液1ml放入试管中 ，40℃水浴中预热1-2min
3.往0号试管加入0.4mol/L三氯醋酸2ml，再往3支试管中加入 2%酪蛋白1ml，计时摇匀，40℃反应10min
4.往1、2号试管中加入0.4mol/L三氯醋酸2ml，摇匀，取出3支 试管静置10min
离子半径小 > 离子半径大
阳离子∶Mg2+>Ca2+>Ba2+>NH4+>Na+>K+>Pb+>Cs+ 阴离子∶PO43->SO42->Cl->Br->NO3->I->SCN-
• 蛋白质的溶解度与盐离子强度间的关系可以用 Cohn经验式来表示：
log S K sI
式中：S—蛋白质的溶解度
I—离子强度
β—常数，与温度和pH有关
Ks—盐析常数，与蛋白质和盐的种类有关
• 其中I 根据下式计算：
I
1 2
c
i
z
2 i
式中：ci—i 离子的浓度（mol/L） zi—i 离子所带的电荷
盐析法最为常用的盐为硫酸铵。
硫酸铵溶液的浓度常用“饱和度”来表示， “饱和度”定义为在盐析溶液中所含的硫 酸铵质量与该溶液达饱和所溶解的硫酸铵 质量之比。25℃时硫酸铵的饱和浓度为4.1 mol/L（767 g/L），定义该浓度为100%饱 和度。
将含有沉淀的酶液小心倒入离心管中，在 天平上称重平衡，用高速冷冻离心机离心 于10℃，10,000 r/min离心20 min。
将上层清液倒入量筒记录其体积，并分别 测定酶活（u/ml），即为该酶的溶解度S。
蛋白酶活力的测定
福林（Folin）试剂在碱性条件下可被酪 氨酸还原成兰色化合物，蛋白酶水解酪 蛋白产生酪氨酸，将产物中未被水解的 酪蛋白除去后与福林试剂作用，根据显 兰色的深浅可以计算出酪氨酸的产生量， 从而推断酶活力的大小。
实验报告
实验报告内容包括：目的、原理、方法 、结果、思考题和讨论（讨论的内容为 各人对实验的理解意见改进收获等等）
实验报告可以提交打印版
蛋白酶的盐析沉淀
稳定蛋白质胶体溶液的两个因素
(1)带同种表面电荷(在非等电点时)，形成 双电层结构
(2)形成水化膜
＋＋＋
＋ ＋＋＋ ＋ ＋
＋
＋＋＋ ＋
＋＋
＋＋
实验步骤
分两个大组进行实验，每大组取6只烧杯编 号，分别加入50 ml蛋白酶液，分别称量5.70， 8.80，12.16，15.66，19.5和23.6固体硫酸铵 粉末（对应20%，30%，40%，50%，60%， 70%饱和度），在磁力搅拌器不断搅拌下， 将其缓慢加入酶液中，加完后再搅拌5 min， 使硫酸铵完全溶解。然后静置使蛋白酶沉淀 完全。
水化膜
盐析法
在蛋白质溶液中加入少量中性盐，蛋白质溶解 度增加，称为盐溶；而加入大量中性盐达一定 浓度，蛋白质就会沉淀，称为盐析。
原理 ： ①大量盐加入后，能与蛋白质争夺水分子，去 除水膜； ②大量盐能中和蛋白质分子 表面电荷，使分子间静电斥 力减弱，疏水作用增强，使 蛋白质沉淀。
盐析效果： 二价离子 > 一价离子
5. 另取3支试管，分别吸取上述清液1ml，各加入0.4mol/L碳 酸钠溶液5ml，福林试剂1ml，于40℃水浴中保温20min显色 。
6.以0号管为对照，在波长680nm处测定1、2号管的吸光度， 求出平均值。
蛋白酶液的稀释、酶活测定和计算
酶活力
4 10
K
N
O.D680
K—在酪氨酸标准曲线上O.D值为l时酪氨酸的微克数 （μg），K值为108.53