丙酮沉淀与盐析
盐析沉淀蛋白质时
收。 • 利用这个性质，可以对蛋白质进行定性鉴定。 • 初步定量，若精细定量用考马斯亮蓝染色
蛋白质的分离与纯化方法
分离纯化之前保证蛋白质一定的纯度 依据：大小、形状、溶解度、酸碱性、吸附性及对配体的亲和性 若要研究蛋白质的功能则要求高级结构完整 难度大，迄今几百个蛋白质的单晶（单晶的天然结构都没有发生变化）
最准确可靠的方法是超离心法（Svedberg于1940年设计）：蛋白质颗粒在25-50*104 g离心力作 用下从溶液中沉降下来。
沉降系数（s）：单位（cm）离心场里的沉降速度。
v s = ————
ω2x
v =沉降速度（dx/dt） ω=离心机转子角速度（弧度/s） x =蛋白质界面中点与转子中心的距离（cm）
（一）盐析与有机溶剂沉淀： 盐溶
1. 盐析： 在蛋白质溶液中加入大量中性盐，以破坏蛋白质的胶体性质，使蛋白质从溶液中沉淀析出，称 为盐析。
常用的中性盐有：硫酸铵、氯化钠、硫酸钠等。 盐析时，溶液的pH在蛋白质的等电点处效果最好。 盐析沉淀蛋白质时，通常不会引起蛋白质的变性。
分段盐析： 半饱和硫酸铵溶液可沉淀血浆球蛋白，而饱和硫酸铵溶液可沉淀血浆清蛋白。
乙醛酸试剂及浓 H2SO4
α-萘酚、NaClO
紫色 红色
N 胍基
酚试剂反应 (Folin-Cioculteu 反 应)
茚三酮反应
碱性CuSO4及磷钨 酸-钼酸 茚三酮
蓝色 蓝色
酚基、吲哚基 自由氨基及羧基
有此反应的 蛋白质或氨 基酸 所有蛋白质
Tyrห้องสมุดไป่ตู้
蛋白沉淀方法
蛋白沉淀方法蛋白沉淀是蛋白质分离与纯化的一种常用方法，通过加入化学物质使目标蛋白质与其它蛋白质或者杂质分离，并沉淀于溶液底部或者浮于溶液表面。
本文将从蛋白沉淀的原理、化学物质的选择、实验操作、蛋白沉淀后处理等方面进行介绍。
一、蛋白沉淀的原理蛋白质的沉淀是基于化学物质与蛋白质之间的物理或者化学相互作用，包括：1. 盐析沉淀在高浓度盐溶液中，蛋白质远离其同样带电的水分子，而形成大分子团聚，从而沉淀。
在酸性环境下，大多数蛋白质通过质子化而失去电荷，降低了疏水性，从而沉淀。
在碱性环境下，蛋白质通常解离出一个氨基酸残基的羧基，从而带有负电荷，易于被阳离子与之形成沉淀。
4. 有机溶剂沉淀如乙醇、丙酮、甲醇等，可与蛋白质形成复合物，使其聚合而沉淀。
以上几种原理可单独或结合使用，根据情况进行选择。
二、化学物质的选择常用的盐类有氯化铵、硫酸铵、硫酸钠等。
浓度通常在10-60%之间，具体浓度根据具体实验条件进行选择。
2. 酸类常用的酸包括二元酸、有机酸等。
浓度为0.1-1M之间，酸性度通常为pH 4-6。
3. 碱类常用的有机溶剂包括乙醇、丙酮、甲醇等。
浓度通常为50-90%之间，根据实验要求进行选择。
三、实验操作1. 样品制备待分离的蛋白质必须经过预处理，通常包括离心、裂解、过滤等步骤。
裂解方式可以使用生理盐水、水、甲醇等，使蛋白质从细胞中释放出来。
过滤可以使用滤纸、滤膜、分子筛等方式，去除杂质。
2. 化学物质的加入将选择好的化学物质加入样品中，此时需注意化学物质前后也要进行科学操作，如一些电解质类物质可能带有杂质，需要先进行过滤；有机溶剂可能会引起蛋白质的变性，需加入适量的缓冲液进行保护。
将混合物小心地混合均匀后，离心使混合物分层，此时目标蛋白沉在沉淀层，上清液中还有一些蛋白，需要将其过滤或沉淀以去除杂质。
4. 纯化将沉淀分解，得到的产物通过离心、层析等步骤进行纯化，最终得到目标蛋白。
沉淀后需要进行洗涤，以去除杂质，保证目标蛋白的纯度和酶效。
蛋白质沉淀的方法
蛋白质沉淀的方法
蛋白质沉淀的方法有以下几种：
1.盐析法
在蛋白质溶液中加入大量的硫酸饺、硫酸钠或氯化钠等中性盐，破坏蛋白质的水化膜和中和电荷，使蛋白质颗粒相互聚集，发生沉淀。
2.等电点沉淀
等电点沉淀法是利用蛋白质在等电点时溶解度最低而各种蛋白质又具有不同等电点的特点进行分离的方法
3.有机溶剂沉淀
有机溶剂能降低溶液的电解常数，从而增加蛋白质分子上不同电荷的引力，导致溶解度的降低，另外，有机溶剂与水的作用，能破坏蛋白质的水化膜，故蛋白质在一定浓度的有机溶剂中的溶解度差异而分离的方法称有机溶剂分段沉淀法。
常用于蛋白质或酶的提纯。
使用的有机溶剂多为乙醇和丙酮。
4.重金属盐沉淀法
其原理是重金属盐可与蛋白质形成不溶于水的蛋白盐沉淀，从达到沉淀蛋白质的目的。
5.生物碱试剂/酸沉淀
蛋白质又可与生物碱试剂以及某些酸结合成不溶性的盐沉淀，沉淀的条件应当是pH小于等电点，这样蛋白质带正电荷易于与酸根负离子结合成盐。
沉淀技术(1)
盐析操作(加盐方式）
硫酸铵的加入有以下几种方法：
1）加入固体盐法 用于要求饱和度较高而不增大溶液体积的情
况；工业上常采用这种方法，加入速度不能太快，应分批加入， 并充分搅拌，使其完全溶解和防止局部浓度过高；
2）加入饱和溶液法 用于要求饱和度不高而原来溶液体积不大
的情况；它可防止局部过浓，但加量较多时，料液会被稀释。
白质溶液后，蛋白质表面电荷大量被中和，静电斥力 降低，导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集 而沉淀。
盐析过程
当中性盐加入蛋白质分散体系时可能出现以下两 种情况： （1）“盐溶”现象(salt-in)—低盐浓度下，增加蛋 白质分子间静电斥力，蛋白质溶解度增大 。 （2）“盐析”现象(salt-out)—高盐浓度下，中和 电荷、破坏水化膜，蛋白质溶解度随之下降 。
一、概述
沉淀法不仅用于实验室中，因其不需专门设 备，且易于放大，也广泛用于生产的制备过 程， 是分离纯化生物大分子，特别是制备蛋白质 和酶时最常用的方法。
优点：操作简单、经济、浓缩倍数高
缺点：针对复杂体系而言，分离度不高、选
择性不强
二、蛋白质的表面性质
在水溶液中，多肽链中 的疏水性氨基酸残基具 有向内部折叠的趋势， 但仍有部分疏水性氨基 酸残基暴露在外表面， 形成疏水区。 亲水性氨基酸残基基本 分布在蛋白质立体结构 的外表面。
60
80
100
硫酸铵盐析过程 最适饱和度是30%，55%
分段盐析法分离酵母醇脱氢酶
过滤液经过30%丙酮沉淀杂蛋白后，然后进行分段盐析
分段盐析法分离酵母醇脱氢酶
丙酮沉淀杂蛋白后粗酶的比活上升4.94倍．
分段盐析中饱和度在50％～55％区段中析出的组分与粗 酶相比其比活上升9.62倍，
Ch4 沉淀法(Pricipitation)2
3、 高浓度的盐能促使蛋白质沉淀或聚结的现象 ， 、 高浓度的盐能促使蛋白质沉淀或聚结的现象， 还不能很好地从理论上来解释。 还不能很好地从理论上来解释。 Cohn经验方程式： 经验方程式： 经验方程式
Lgs=β-Ks ×I（µ、m） （ 、 ） β=lgS0 I=
1 2
∑ ciZi
2
4、β的物理意义 、 的物理意义 的物理意义: Ks盐析常数的物理意义 盐析常数的物理意义: 盐析常数的物理意义
第二节
盐析法
一、中性盐盐析法
盐析法（ （一）盐析法（Salting-out）的概念和基本原理： ）的概念和基本原理： 1、概念： 、概念： 2、基本原理 （P41） 、 ）
从以上分析可知， 从以上分析可知，在蛋白质溶液中加入中性 盐后会压缩扩散双电层， 电位， 盐后会压缩扩散双电层，降低ζ电位，即中性 盐既会使蛋白质脱水， 盐既会使蛋白质脱水，又会中和蛋白质所带 的电荷，使颗粒间的相互排斥力失去， 的电荷，使颗粒间的相互排斥力失去，在布 朗运动的互相碰撞下， 朗运动的互相碰撞下，蛋白质分子结合成聚 集物而沉淀析出。 集物而沉淀析出。
二、等电点沉淀法 (一)等电点沉淀的概念: 等电点沉淀的概念:
（二）操作条件： 操作条件： 离子强度低， 离子强度低 ， pH≈pI（ 略小于 在中性盐 （ 略小于pI在中性盐 存在下） 用无机酸（ 存在下 ） ， 用无机酸 （ HCl、H2SO4 、 H3PO4 等 ） 、 调节pH 调节
由于在等电点附近， 由于在等电点附近，溶质仍然有一定的溶解 等电点沉淀法往往不能获得高的回收率， 度，等电点沉淀法往往不能获得高的回收率， 因此等电点沉淀法通常与盐析、 因此等电点沉淀法通常与盐析、有机溶剂沉淀 法联合使用 操作时的注意事项： 操作时的注意事项： （1）由于无机离子的影响，蛋白质的等电点 ）由于无机离子的影响， 通常会发生“漂移” 通常会发生“漂移”，阳-高，阴-低 高 低 （2）溶质的稳定性 ） （3）盐析效应 ）
13种蛋白质的浓缩方法及应用过程
13种蛋白质的浓缩方法及应用过程1、丙酮沉淀法：三氯醋酸沉淀法试验要求的仪器简单，但是常常导致蛋白质变性。
2、免疫沉淀法：得有特异性抗体3、硫酸铵沉淀法：利用高浓度盐将蛋白质析出(盐析)，选择硫酸按是因为：盐析有效性，pH范围广，溶解度高，溶液散热少，经济，大多数的蛋白都可以用资格方法4、聚乙二醇沉淀法：使用PEG时旨在个别情况下才会是蛋白质稍有变性!他溶解是散热低，形成沉淀的平衡时间短，通常达到30%时蛋白质就会达到最大量的沉淀!5、离子交换层析：可用阴离子交换树脂进行浓缩。
6、透析袋浓缩法：利用透析袋浓缩蛋白质溶液是应用最广的一种。
将要浓缩的蛋白溶液放入透析袋(无透析袋可用玻璃纸代替)，结扎，把高分子(6 000-12 000)聚合物如聚乙二醇(碳蜡)、聚乙烯吡咯、烷酮等或蔗糖撒在透析袋外即可。
也可将吸水剂配成30%-40%浓度的溶液，将装有蛋白液的透析袋放入即可。
吸水剂用过后，可放入温箱中烘干或自然干燥后，仍可再用。
主要用于更换蛋白质的缓冲液，得有透析袋。
不需要特殊的仪器。
一般用得是PEG20000进行实验，简单，快速，对蛋白没什么影响7、冷冻干燥浓缩法：这是浓缩蛋白质的一种较好的办法，它既使蛋白质不易变性，又保持蛋白质中固有的成分。
它是在冰冻状态下直接升华去除水分。
具体做法是将蛋白液在低温下冰冻，然后移置干燥器内(干燥器内装有干燥剂，如NaOH、CaCl2和硅胶等)。
密闭，迅速抽空，并维持在抽空状态。
数小时后即可获得含有蛋白的干燥粉末。
干燥后的蛋白质保存方便，应用时可配成任意浓度使用。
也可采用冻干机进行冷冻干燥。
8、吹干浓缩法：将蛋白溶液装入透析袋内，放在电风扇下吹。
此法简单，但速度慢，且温度不能过高，最好不要超过15 ℃。
9、超滤膜浓缩法：此法是利用微孔纤维素膜通过高压将水分滤出，而蛋白质存留于膜上达到浓缩目的。
有两种方法进行浓缩：一种是用醋酸纤维素膜装入高压过滤器内，在不断搅拌之下过滤;另一种是将蛋白液装入透析袋内置于真空干燥器的通风口上，负压抽气，而使袋内液体渗出。
沉淀生成和溶解的原理
沉淀生成和溶解的原理
利用与水互溶的有机溶剂（如甲醇、乙醇、丙酮等）能使蛋白质在水中的溶解度显著降低而沉淀的方法，称为有机溶剂沉淀。
有机溶剂引起蛋白质沉淀的另一种解释认为与盐析相似，有机溶剂与蛋白质争夺水化水，致使蛋白质脱除水化膜，而易于聚集形成沉淀
影响因素
1、有机溶剂的挑选在实际生产中，常用的有机溶剂存有乙醇、丙酮、异丙醇、乙醚等。
丙酮的介电常数大，结晶能力弱；而乙醇无污染，广为应用于药品生产中。
2、温度的控制有机溶剂沉淀时，温度是重要的控制指标。
根据沉淀对象不同，采用的温度不同，为防止生物大分子在较高温度时发生变性，一般要求在低温下进行，同时还要考虑有机溶剂与水混合时的放热现象。
3、ph值等电点时，蛋白质的溶解度最高。
在有机溶剂结晶时，应当挑选ph值在等电点附近，但是ph值的掌控还必须考量目的药物的稳定性条件，通常生产中常用缓冲液去掌控溶液的ph值。
4、离子强度在有机溶剂和水的混合液中离子强度是一个特别重要的因素。
因为盐在一定的浓度范围内能增加蛋白质或酶在有机溶剂中的溶解度，使有机溶剂沉淀收率降低，因此当采用盐析沉淀法得到蛋白质或酶后，如需进一步用有机溶剂沉淀法纯化，一定要先透析除盐。
蛋白质的沉淀反应实验报告
蛋白质的沉淀反应实验报告一、实验目的1、掌握几种常用的使蛋白质沉淀的方法。
2、理解蛋白质沉淀的原理和应用。
二、实验原理蛋白质是一种大分子化合物，在溶液中以胶体状态存在。
当溶液条件发生改变时，蛋白质的胶体稳定性被破坏，从而发生沉淀。
常见的使蛋白质沉淀的方法有以下几种：1、盐析法：在蛋白质溶液中加入大量中性盐（如硫酸铵、氯化钠等），破坏蛋白质的水化膜和电荷，使其溶解度降低而沉淀。
2、有机溶剂沉淀法：向蛋白质溶液中加入一定量的有机溶剂（如乙醇、丙酮等），降低溶液的介电常数，增加蛋白质分子间的静电引力，导致蛋白质沉淀。
3、重金属盐沉淀法：重金属离子（如汞离子、铅离子等）与蛋白质分子中的巯基等基团结合，使蛋白质变性沉淀。
4、生物碱试剂沉淀法：生物碱试剂（如苦味酸、鞣酸等）能与蛋白质分子中的碱性基团结合，生成不溶性盐而沉淀。
三、实验材料和仪器1、材料鸡蛋白溶液：将新鲜鸡蛋的蛋清用蒸馏水稀释 10 倍。
10%硫酸铵溶液、饱和硫酸铵溶液、3%硝酸银溶液、01mol/L 硫酸铜溶液、5%三氯乙酸溶液、95%乙醇、1%醋酸铅溶液、10%氢氧化钠溶液、1%醋酸溶液、苦味酸饱和溶液、鞣酸饱和溶液。
2、仪器试管、试管架、滴管、玻璃棒、离心机。
四、实验步骤1、盐析法取两支试管，分别加入 2mL 鸡蛋白溶液。
向其中一支试管中逐滴加入 10%硫酸铵溶液，边加边振荡，直至出现沉淀。
观察沉淀的生成情况。
向另一支试管中加入 2mL 饱和硫酸铵溶液，振荡均匀。
静置一段时间后，观察沉淀现象。
2、有机溶剂沉淀法取两支试管，分别加入 2mL 鸡蛋白溶液。
向其中一支试管中逐滴加入 95%乙醇，边加边振荡，直至出现沉淀。
观察沉淀的生成情况。
向另一支试管中加入 2mL 丙酮，振荡均匀。
静置一段时间后，观察沉淀现象。
3、重金属盐沉淀法取三支试管，分别加入 2mL 鸡蛋白溶液。
向第一支试管中滴加 3%硝酸银溶液 2~3 滴，振荡均匀，观察沉淀的生成情况。
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Homology (同源性)
Primary structure and homology
Homologous(同源的)： proteins with similar AA sequences and functions are said to be homologous Homologous proteins from different species imply their evolutionary relatedness
O2-binding activity of Mb and Hb
O2-saturation curve of Mb and Hb
Mb: high affinity for O2
a simple hyperbolic curve
(直角双曲线)
Mb和Hb的氧饱和曲线
Hb: low affinity for O2 when [O2] is low
The primary structure of a protein:
determines its spatial structure is related with evolution of living things has a role in its bioactivity
Importance of primary structure in organism evolution
Hemoglobin (Hb) 血红蛋白
Hb: tetramer(四聚体), 4 subunits, α2β2 One Hb contains four heme groups Quaternary structure 具有四级结构
Hb: eight salt bonds link the 4 subunits to make Hb tightly form hydrophilic(亲水的) globular Байду номын сангаасrotein
Myoglobin (Mb) and Hemoglobin (Hb)
肌红蛋白与血红蛋白
Paradigms of protein structure and function Both are typical globular proteins 球状蛋白 Both are conjugated(偶联) with heme (血红素)
Mb and Hb
The β-subunit of Hb has tertiary structure very similar to that of Mb
Similarity: O2-binding activity Difference: Mb--storage of O2
Hb--transport of O2
Sickle-cell anemia cause 镰刀型贫血
The changes of key amino acids in its sequence result in function alteration of a protein
What is a relationship between the spatial structure of a protein and its function ?
Mb
Hb
Heme 血红素
Heme: Fe++ binds to protoporphyrin 原卟啉
His F8
Fe2+ and O2-binding
Fe2+ binds O2 reversibly (可逆)
Fe3+ does not bind O2 One heme binds one O2
molecule
Heme and Mb
Mb: one peptide with eight relatively straight segments of α-helix (A～H), with tertiary structure
The flat heme group rests in a hydrophobic pocket (疏水口袋) of Mb
大猩猩
长臂猿 猕猴
鼠
The phylogenetic tree (种系发生树)
根据细胞色素C序列的物 种差异建立的进化树:
分支顶端: 现存物种
沿分支线的数字表示物 种和潜在(假设)的祖先之 间的氨基酸变化
Primary structure related to its function 一级结构与功能的关系
Section III
Relevance of protein structure and function
(蛋白质结构与功能的关系)
The primary structure determines the spatial structure
All of the information necessary for folding the peptide chain into its native structure is contained in the AA sequence of the peptide
Relax state (R state): The binding of O2 to one Hb subunit in the T state triggers a change in conformation to the R state Some of the ion pairs that stabilize the T state are broken and some new ones are formed
The functions of a protein depend on its spatial structure
The native conformation of a protein is essential for its function
Biological activity will be lost when the spatial structure is destroyed
S-shaped curve (S形曲线)
How is the S-shaped curve of Hb formed?
Tense state (T state): subunits tightly bound with 8 salt
bonds
affinity of each subunit to O2 is lower