新型轮状病毒反向遗传学系统的开发及应用
用于构建流感病毒的反向遗传系统的载体及应用[发明专利]
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专利名称：用于构建流感病毒的反向遗传系统的载体及应用专利类型：发明专利
发明人：刘金华,刘芹防,马广鹏,蒲娟,王帅
申请号：CN200810119705.X
申请日：20080905
公开号：CN101343636A
公开日：
20090114
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种用于构建流感病毒的反向遗传系统的载体及应用。
所述载体为环状载体，包含原核复制起点、筛选标记基因、多聚腺苷酸加尾信号和两个转录方向相同的启动子，所述多聚腺苷酸加尾信号位于所述两个转录方向相反的启动子的下游，其中，所述两个转录方向相同的的启动子和所述多聚腺苷酸加尾信号之间含有pol I元件，所述pol I元件自上游至下游依次为RNA聚合酶I 启动子、连接片段和RNA聚合酶I终止子，所述连接片段含有如下1)或2)的序列：
1)GGGGAGCGAAAGCAGG；2)GGTTATTAGTAGAAACAA GG。
所述载体可用来构建流感病毒反向遗传系统质粒，用于病毒拯救。
申请人：中国农业大学
地址：100094 北京市海淀区圆明园西路2号
国籍：CN
代理机构：北京纪凯知识产权代理有限公司
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BmBDV、BmCPV反向遗传学系统的建立及不同抗性家蚕对BmCPV的感染应答
BmBDV、BmCPV反向遗传学系统的建立及不同抗性家蚕对BmCPV的感染应答家蚕浓核病毒(Bm BDV)能特异性地侵染家蚕中肠组织的柱状细胞,是家蚕软化病的病原。
Bm BDV的基因组由两种不同的单链DNA,VD1(6,543 nts)和VD2(6,022 nts)构成,病毒粒子中只含有两种DNA分子中的一种。
目前还没有一种细胞系可感染Bm BDV,也不能通过基因操作改变Bm BDV的基因研究病毒基因的功能。
家蚕质型多角体病毒(Bm CPV)基因组由10个分节ds RNA片段组成,每个ds RNA片段含有一个完整的开放阅读框(ORF)。
由于Bm CPV为ds RNA,且缺乏Bm CPV的敏感细胞系,无法通过基因敲除或敲入研究Bm CPV基因功能,导致Bm CPV基因功能研究几无进展。
不同的家蚕品种对Bm CPV的抗性存在差异,但品种间的抗性差异机制仍有许多不明之处。
基于目前的研究现状和存在问题,我们开展了基于Bm BDV基因组DNA质粒拯救病毒研究、基于体外转录的病毒RNA转染细胞拯救Bm CPV研究,期望为Bm BDV 和Bm CPV基因的功能研究提供新的系统;同时,利用RNA-Seq技术,研究了不同抗性品种家蚕感染Bm CPV后,中肠组织基因组转录水平的变化,期望为理解家蚕对Bm CPV的感染应答及抗Bm CPV的分子机制提供新的线索。
1、Bm BDV反向遗传学系统的研究为了提供Bm BDV基因功能的研究平台,将含有Bm BDV VD1基因组的重组质粒p GEM-VD1转染家蚕卵巢(Bm N)细胞,发现细胞表现出明显的细胞病变;Western blotting与免疫荧光皆能检测到Bm BDV基因的表达。
同时,我们通过Bac-to-Bac载体表达系统构建了装载VD1全基因组的重组杆状病毒Bm Bac-VD1,该重组病毒基因组DNA转染Bm N培养细胞,可观察到细胞出现明显病变,将培养上清转接正常Bm N细胞,表现出相同的病变;Westernblotting与免疫荧光试验可检测到Bm BDV病毒结构蛋白的表达;透射电镜可同时观察到球形病毒粒子与杆状病毒粒子,通过差速离心将两种病毒粒子分离,分子生物学鉴定结果显示,球形病毒样颗粒中包裹有重组病毒基因组。
反向遗传学及其相关技术
2）随机插入突变
A. T-DNA插入突变 以农杆菌介导的转化为基础的一种插入突变研究 方法，根据插入位点的基因序列与植物表型变异 等的相互关系可以从基因组中分离出相应的基因 并鉴定其功能。
构建T-DNA载体→转化→突变体的筛选及遗传分 析→分离T-DNA 插入位点的侧翼序列→基因的 定位、结构与功能分析。
II.RNA干扰 （一）概念
RNA干扰(RNA interference，RNAi)： 与靶基因序列同源的双链RNA所诱导的 一种序列特异性转录后基因沉默现象。
基因沉默
基因沉默
转录水平的基因沉默 (Transcriptional Gene Silencing, TGS)
转录后水平的基因沉默(Posttranscriptional Gene Silencing, PTGS)
➢ 转录水平的基因沉默（TGS）是指基因在细胞核内RNA
合成受到了阻止而导致基因沉默。转录水平基因沉默可以 通过有性世代传递，表现为减数分裂的可遗传性。
➢ 引起转录水平基因沉默的机制主要有以下几种：
1. 基因及其启动子甲基化：通常发生在DNA的CG序列的碱基上， 该区域碱基甲基化往往导致转录受抑制。
T-DNA法敲除植物基因 及突变体筛选：
a. 引 物 设 计 。 LP 和 RP 分别代表插入基因两端的引 物 ， LB 是 指 载 体 上 的 一 段 引物。旁邻序列是经测序后 获得的DNA序列。
b. PCR产物电泳结果。 分别代表野生型、杂合子和 纯合子PCR条带。
T-DNA插入特点：
不能控制其在生物体基因组中的插入位点。在植物 中用T-DNA 插入来敲除一个特定基因仍需要运气。
► 显微注射命中率较高，技术难度相对大些。电穿孔 法命中率比显微注射低，操作使用方 便。
3种常发冠状病毒的反向遗传技术及应用进展
·综述·Chinese Journal of Animal Infectious Diseases中国动物传染病学报3种常发冠状病毒的反向遗传技术及应用进展摘 要：冠状病毒是一类引起动物和人类疾病的有包膜RNA 病毒，可导致人和动物发病，危害严重，如严重急性呼吸综合征病毒、中东呼吸综合征病毒、新型冠状病毒等，尤其是2019年末暴发的新型冠状病毒更是呈现全球大流行，严重危害了人健康和阻滞了全球经济发展。
而鸡传染性支气管炎病毒和猪流行性腹泻病毒则是2种常见的严重危害家禽和生猪养殖的病原。
本文简述了新型冠状病毒、鸡传染性支气管炎病毒和猪流行性腹泻病毒3种冠状病毒的流行趋势，着重介绍了反向遗传学技术在这3种病毒研究中的应用现状，以期能为冠状病毒等单股正链RNA 病毒的研究提供一定参考的意义。
关键词：新型冠状病毒；鸡传染性支气管炎病毒；猪流行性腹泻病毒；反向遗传学中图分类号：S852.65文献标志码：A文章编号：1674-6422（2023）06-0184-10Research and Application Progress of Reverse Genetics of Three CommonCoronavirusesXIONG Ting 1, LIU Dingxiang 3, CHEN Ruiai 1,2(1. College of Veterinary Medicine of South China Agriculture University, Guangzhou 510642, China; 2. Zhaoqing Branch Center of Guangdong Laboratory for Lingnan Modern Agriculture Science and Technology, Zhaoqing 526238, China; 3. Integrate MicrobiologyResearch Center of South China Agriculture University, Guangzhou 510642, China)收稿日期：2021-09-07基金项目：广东省重点领域研发计划（2021B0707010009）；肇庆市科技计划项目（2021C001）；岭南现代农业科学与技术广东省实验室肇庆分中心自主立项项目（P2*******-0301）作者简介：熊挺，男，博士，主要从事动物传染病学研究通信作者：陈瑞爱，E-mail：*****************.com Abstract: Coronaviruses represent a type of enveloped RNA viruses that cause diseases in animals and humans, such as severe acute respiratory syndrome virus (SARS-CoV), Middle East respiratory syndrome virus (MERS-CoV), and s evere acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2). The outbreak of SARS-CoV-2 at the end of 2019 has been showing a global pandemic, which seriously harms human health and hinders the development of the global economy. Chicken i nfectious bronchitis virus (IBV) and p orcine epidemic diarrhea virus (PEDV) are two common pathogens that seriously harm poultry and piglet. This review briefl y described the epidemic trends of SARS-CoV-2, IBV and PEDV , and mainly focused the advanced research and applications of reverse genetics technology in the research of coronaviruses.Key words: Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2; Infectious bronchitis virus; Porcine epidemic diarrhea virus; reverse genetics2023,31(6):184-193熊 挺1，刘定祥3，陈瑞爱1,2（1.华南农业大学兽医学院，广州510642；2.岭南现代农业科学与技术广东省实验室肇庆分中心，肇庆526238；3.华南农业大学群体微生物中心，广州510642）冠状病毒是一种有包膜单股正链RNA病毒，外形似日冕般外围的冠状，因此被称为冠状病毒。
反向遗传学
反向遗传学技术极其应用俞露摘要: 反向遗传学是直接从遗传物质入手研究生命现象与规律，其相应的操作技术已在生命科学研究的各个领域显示出了广泛的应用前景。
本文主要讲述反向遗传学技术极其应用。
关键词: 反向遗传学技术病毒基因组疫苗反向遗传学(reverse genetics)是相对于正向(经典)遗传学而提出的。
经典遗传学的系统研究是从孟德尔的豌豆花实验开始的，就是通过研究生物的表型、性状来推测其遗传物质组成、分布与传递规律等，从而研究生命过程的发生与发展规律的。
即正向遗传学主要研究生物突变性状的遗传行为，如控制突变性状的基因数口及其在染色体上的位置以及突变性状在后代中的传递规律等。
反向遗传学则是在获得生物体基因组全部序列的基础上，通过对靶基因进行必要的加工和修饰(如定点突变、基因插入/缺失、基因置换等)，再按组成顺序构建含生物体必需元件的修饰基因组，让其装配出具有生命活性的个体，研究生物体基因组的结构与功能，以及这些修饰可能对生物体的表型、性状的影响等方面的内容。
即反向遗传学是直接从生物的遗传物质入手来研究基因的生物学功能，阐述生物生命发生的本质现象与规律，如生物的繁殖复制机制、病毒的致病机制等。
1 反向遗传学技术概述反向遗传学技术是通过构建RNA病毒的感染性分子克隆，在DNA分子水平上对其进行体外操作，从而研究病毒结构与功能的方法。
感染性分子克隆包括感染性互补脱氧核糖核酸和感染性体外转录本。
构建感染性cDNA就是通过反转录一聚合酶链式反应扩增RN A病毒基因组的cDNA片段，然后利用其限制性酶切位点，将cDNA片段顺次相连并克隆于合适的载体，获得基因组全长cDNA克隆，以其转染适当细胞，全长cDNA在细胞内转录并包装成感染性病毒粒子。
而感染性体外转录本也是运用常规克隆方法获得病毒基因组全长cDNA，在体外进行转录，获得基因组全长RNA，用此RNA转染适当细胞以获得感染性病毒粒子。
获得RNA病毒的感染性分子克隆后，就可在DNA水平上通过突变、缺失、插入和互补等手段来研究RNA病毒的基因复制和表达、RNA的自发重组和诱导重组、RNA病毒与宿主的相互作用(如病毒在细胞间的传递机制)等，也可进行抗病毒策略研究，还可用于构建新的病毒载体。
利用反向遗传技术产生表达外源基因的重组SA11轮状病毒
利用反向遗传技术产生表达外源基因的重组SA11轮状病毒柴萨萨;蔡昊;刘夏飞;赵静;宋敬东;李金松;裴银辉;李利利;段招军【期刊名称】《中国人兽共患病学报》【年(卷),期】2024(40)2【摘要】目的利用反向遗传技术产生NSP1基因插入和表达外源基因的重组SA11轮状病毒,构建可表达外源基因的轮状病毒载体。
方法本研究将轮状病毒SA11株的NSP1基因片段的223位(5端)至1388位的核苷酸删除,并直接插入连接了终止-再启动元件(P2A)的增强绿色荧光蛋白(EGFP)基因,采用已建立的“12质粒”轮状病毒反向遗传系统拯救NSP1基因插入和表达EGFP的重组SA11轮状病毒。
通过观察细胞病变效应和插入基因(EGFP)的荧光表达初步确定重组病毒的成功拯救,再结合电镜的形态学观察、RT-PCR的测序结果及病毒基因组的检测结果,进一步证明重组轮状病毒的成功拯救和传代扩增。
利用TCID 50法和qRT-PCR法,测定了rSA11和rSA11/NSP1-EGFP的病毒滴度并绘制了基因组复制动力曲线。
结果基于“12质粒系统”成功拯救了重组轮状病毒rSA11/NSP1-EGFP,证明NSP1片段截短并插入外源基因后病毒仍可正常复制,且具有良好的遗传稳定性,但病毒滴度低于其亲本株。
结论基于NSP1基因插入和表达EGFP的重组轮状病毒能够实现稳定遗传,为利用反向遗传学构建表达外源基因的轮状病毒载体的深入探索提供了基础。
【总页数】7页(P140-146)【作者】柴萨萨;蔡昊;刘夏飞;赵静;宋敬东;李金松;裴银辉;李利利;段招军【作者单位】华北理工大学基础医学院河北省慢性疾病基础医学重点实验室;中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所;甘肃中医药大学公共卫生学院【正文语种】中文【中图分类】R373.2【相关文献】1.利用反向遗传操作技术拯救重组新城疫病毒2.利用Red重组工程技术解决外源基因在大肠杆菌染色体lac操纵子中的表达3.用反向遗传操作技术产生致弱的H5亚型重组流感病毒4.利用反向遗传技术构建表达绿色荧光蛋白的H9N2禽流感重组病毒5.用反向遗传技术产生冷适应致弱的重组A型人流感病毒的研究因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
反向遗传学让疫苗研发更高效
新科技反向遗传学让疫苗研发更高效文/谢开飞通讯员欧阳桂莲在现代遗传学中，反向遗传学被认为是一 种不可或缺的工具，它彻底改变了人们对病毒发病机制和疫苗研发的认识。
近曰，一项来自38中国科技财富丨2020年第6期瑞士的研究使用这一工具，依靠已知新冠病毒 基因序列，在酵母菌中快速构建出了活的新冠病毒。
新科技研究人员认为，快速构建出活的新冠病毒，可以成为向卫生部门和实验室提供传染性 病毒毒株的替代方法，从而争取时间对疫情暴 发做出快速反应。
该研究中所用的反向遗传学 技术是什么？在生物科技领域有哪些应用？这 种重建病毒的最新研究如何改变对疫苗研发的 认识？由里及表开辟疫苗研发新思路“一直以来，科学家们研究相关基因的功 能，都是通过杂交等手段，观察表型性状的变 化，从而研究遗传基因的存在与变化，这种由表 及里的研究方法称为正向遗传学。
”厦门大学国 家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心副教 授裎通告诉记者，如在医学领域，可以观察临床 病人病理组织和正常组织的不同表现，从而探究 产生这种表现变化的内在原因。
随着分子遗传学及相关实验技术的发展，科研人员已经能够有目的地对D N A进行重组或 者定点突变。
于是，在现代遗传学中，就出现了 另一条由里及表的认知路线。
研究人员直接从生 物自身基因出发，通过对特定基因进行敲除、定 点突变等人工操作后，观察突变体表型与性状变 化，从而反推基因功能。
由于该路线与正向遗传 学正好相反，所以这个新的遗传学分支被称为 反向遗传学，包括基因剔除技术、基因改造等 研究。
相较于正向遗传学来说，反向遗传学有其独 特的优势。
此前，美国哈佛一麻省理工博德研究所科学 家塞克•凯斯利森及其同事，就采用反向遗传学 方法，对〗0503个生活在巴基斯坦的人基因编码 区进行测序分析，识别出了约50000个突变。
这 种反向推定的技术路线，相当于高效收集了正向 敲除1317个基因找到的结果，相较于传统正向 遗传方法，极大地提高了效率。
ClassⅠ新城疫病毒9a5b株反向遗传技术平台的初步建立的开题报告
ClassⅠ新城疫病毒9a5b株反向遗传技术平台的初步建立的开题报告标题：ClassⅠ新城疫病毒9a5b株反向遗传技术平台的初步建立摘要：新型冠状病毒（SARS-CoV-2）感染导致COVID-19大流行，严重危及全球公共卫生。
ClassⅠ新城疫病毒9a5b株是目前做研究的模型病毒，但目前尚缺少可靠的反向遗传技术平台。
本研究通过设计和合成四个片段，包括两个反向遗传RNA（rcRNA）、一个Poly（A）尾的信使RNA（mRNA）以及一个Capped RNA，并利用转染和蛋白质表达技术，成功地构建了一种反向遗传技术平台，使ClassⅠ新城疫病毒9a5b株的全基因组克隆和替换成为可能。
本研究为进一步解析SARS-CoV-2病毒的病理生理学机制提供了有力的支持。
关键字: 反向遗传技术，新城疫病毒，COVID-191. 研究背景新型冠状病毒（SARS-CoV-2）已经导致COVID-19大流行，这是一种危及全球公共卫生的病毒。
针对SARS-CoV-2的感染机制、传播途径、免疫应答等方面的系统研究非常重要，这些研究需要准确、可靠的实验技术。
ClassⅠ新城疫病毒9a5b株是目前用于研究SARS-CoV-2的模型病毒。
由于该病毒质粒极端复杂、基因组大小为29.9 kb，常规克隆技术（如病毒基因组分割、靶向变异等）难以高效地对其进行基因组操作。
因此，需要建立一种高效、可靠的反向遗传技术平台，以方便对其基因组进行克隆和替换。
2. 研究方法本研究使用反向遗传技术构建ClassⅠ新城疫病毒9a5b株的克隆和替换体系。
首先，设计并合成了以下四个重要的RNA片段: rcRNA1、rcRNA2、mRNA和Capped RNA。
在rcRNA1和rcRNA2中，序列重复4次，由于它们可以相互作用形成复杂的螺旋结构，可以提高合成效率和稳定性。
mRNA具有典型的Poly（A）尾，使RNA瑞贴合体系可以被更好地降解。
同时，在Capped RNA结构中，5'端固定了7-甲磺酰鸟苷，模拟自然mRNA的突变事件，并提高了转染效率。
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modern journal of animal husbandry and veterinary medicine 2018年第10期轮状病毒（rotavirus，RV）是呼肠孤病毒科轮状病毒属重要成员，是导致婴幼儿和幼龄动物腹泻的主要病原体之一。
RV的基因组由11个独立片段的dsRNA组成，编码6种结构蛋白（VP1、VP2、VP3、VP4、VP6、VP7）和5/6种非结构蛋白（NSP1、NSP2、NSP3、NSP4、NSP5/NSP6）。
人们对RV11个基因片段功能、作用机制研究并不透彻，且不同毒株之间，重配、重排事件的不断发生，很难有目的地、精确定位地改造基因的精细结构以确定这些变化对表型性状的直接影响。
由于缺乏完全基于质粒的反向遗传学系统，阻碍了对RV复制和发病机制的深入研究。
新型轮状病毒反向遗传学系统的开发及应用葛雨，冉旭华，闻晓波*（黑龙江八一农垦大学动物科技学院，黑龙江大庆163319）摘要：轮状病毒（RV）是导致全球婴幼儿严重腹泻的重要病原体。
由于缺乏完全基于质粒的反向遗传学系统，阻碍了对RV复制和发病机制的深入研究。
经过多年来对轮状病毒反向遗传系统的开发，2018年终于成功研发了完全基于11个RV质粒的反向遗传系统，该技术不需要辅助病毒和辅助质粒的参与，不需要复杂的筛选过程，且重组病毒的拯救效率高。
这项技术的成功研发，将加速RV基础生物学的研究，可应用于RV新型疫苗的设计、筛选RV抗病毒制剂，促进其他病毒反向遗传系统的研发。
本文就轮状病毒反向遗传学系统的研究进展及应用作以简要综述。
关键词：轮状病毒；反向遗传系统；病毒拯救；双链RNA中图分类号：R392.1文献标识码：A文章编号：1672-9692(2018)10-0057-05 Development of Novel Rotavirus Reverse Genetics System and ApplicationGe Yu,Ran Xuhua,Wen Xiaobo*(College of Animal Science and Veterinary Medicine,Heilongjiang Bayi Agricultural University,HeilongjiangDaqing163319)Abstract:Rotavirus(RV)is an important pathogen causing severe diarrhea in infants worldwide. Lack of the reverse genetic system entirely based on plasmids compromises further research on RV replication and pathogenesis.After years in the development of reverse genetics system of rota‐virus,RV reverse genetics system entirely based on11plasmids was successfully developed.The technology does not require a helper virus or additional helper plasmids,does not require com‐plex screening process,which rescue efficiency of recombinant virus was high.Development of no‐val rotavirus reverse genetics system can facilitate RV basic biology research,the design of new vaccines and medicine against rotaviruses,and also contribute to research for other viruses, like reoviruses.This article reviewed development of novel rotavirus reverse genetics systems and their applications.Key words:Rotavirus;Reverse genetic system;Viral rescue;Double-strand RNA收稿日期：2018-05-29作者简介：葛雨（1994-），女，硕士研究生，研究方向：病毒分子进化。
通讯作者：闻晓波（1977-），男，博士，教授，研究方向：动物致病机制及分子进化研究。
基金项目：黑龙江省自然科学基金（QC2013C028，C2015042）；国家自然科学青年基金项目（31502098，31201909）；黑龙江博士后科研启动资助项目（LBH-Q13134）。
葛雨：新型轮状病毒反向遗传学系统的开发及应用57现代畜牧兽医2018年第10期反向遗传系统是指直接从生物的遗传物质入手来阐述生物生命发生的本质现象[1]。
可以设计个别病毒基因中的特定突变，产生感染性病毒颗粒并探索其表型。
RNA病毒的反向遗传系统涉及在cDNA基础上操作其基因组，需要将cDNA转染后，拯救具有感染性的活的子代病毒（野生型或突变型）。
在最初的研究中使用了辅助病毒的共感染或双重感染。
但是，由于携带工程化基因组的病毒颗粒可能很难从辅助病毒中分离出来，因此最终目的是创建仅含质粒或仅含RNA的反向遗传学系统，无需辅助病毒，它可以将工程化突变的表型变化精确表现。
1990年有人提出开发RV反向遗传系统，经过20多年的研究[2]，如今已成功建立了仅RV11个片段质粒的反向遗传系统，现将最新研究进展及其应用作以综述。
1轮状病毒反向遗传系统的研究进展1.1模板依赖性体外RV RNA复制系统建立1990年，首次确定RV SA11株全基因组核苷酸序列[3]后有研究人员提出克隆用于测序的cDNA，并希望从克隆的cDNA中获得具有感染性的病毒粒子，进行RV反向遗传系统的开发。
1994年Chen D等[4]建立了“模板依赖性体外RV RNA复制系统”，该系统在RV正链模板RNA上启动并合成全长双链RNA。
许多研究者推测RV反向遗传学系统将会很快成功。
然而，接下来的数年世界各地的研究者们虽然进行了深入的尝试，却没有利用这个系统获得任何重组轮状病毒。
1.2辅助病毒驱动的反向遗传学系统的建立2006年，Komoto等[5]根据轮状病毒在体内的复制周期，提出一个理论：“应当识别并复制源自cDNA（已感染野生型轮状病毒）的正链RNA，通过RNA依赖的RNA聚合酶（RdRp）产生dsRNA，获得来自cDNA具有感染性的轮状病毒。
这为反向遗传系统的研究提供了一个理论基础。
2010年Troupin等报道了基于重排基因片段的优先包装RV的反向遗传学方法，该方法是通过利用辅助病毒来分离单基因替换的重组RV。
2013年Richards等[6]在此基础上使用独立的选择机制产生了含有NSP2基因片段的重组病毒。
在辅助病毒驱动的反向遗传学系统中获得了重组的RV[7-8]。
虽然这种反向遗传系统在技术上是有限的，只能拯救部分片段的感染性，拯救效率也并不高，且需要辅助病毒的参与，重组的病毒难以区分开辅助病毒和轮状病毒，且在之后试验研究中也并没有用此方法再次获得重组病毒。
但在此项试验中改变了轮状病毒基因组，获得了含有由cDNA衍生的VP4[9]、NSP2[10-11]和NSP3[10]基因片段的重组RV。
这一成果为RV的基因工程研究打开了大门。
1.3辅助质粒驱动的反向遗传系统的建立2017年Yuta Kanai等[12]在前人研究基础上开发了完全基于质粒的RV反向遗传系统，针对已建立的呼肠弧病毒科病毒反向遗传学系统，做了2个重要的修改，加入病毒融合的相关小跨膜蛋白（FAST）和减毒痘病毒（VV）加帽酶（D1R和D12L[13-15]）。
FAST是唯一已知的未包膜病毒融合体[16]，可在体内促进病毒复制[17]。
另外，由于RV mRNA3'末端不是聚腺苷酸化的，将VV加帽酶用于重组的RV[18-20]中，T7pol转录物被VV 加帽酶有效地封闭在细胞质中，从而提高翻译效率。
Kanai等将RV的11个基因区段，以及编码FAST和VV 加帽酶D1R和D12L的14个质粒共转染细胞，获得了重组病毒。
在试验中为了排除与亲代病毒污染的可能性，在NSP1-NSP4基因区段设计了独特的酶切位点（作为遗传标记），排除了亲代病毒可能性。
对RT-PCR产物的直接测序，证实rSA11是来自cDNA的重组病毒，且其电泳型与天然SA11的电泳型无差别。
病毒的复制动力学和峰值滴度测试结果也表明天然和重组病毒具有类似的复制特征[12]。
同时Kanai等利用新开发的反向遗传学系统获得的重配病毒rSA11/ KU VP6，和天然SA11的病毒表现出相似的复制动力学。
获得的重配病毒是未曾报道过的，是从此次反向遗传系统中获得的独特遗传组合[12]。
1.4无需辅助质粒的RV的反向遗传系统建立2017年Komoto等[21]开发的完全基于质粒的RV反向遗传学系统已经取得了巨大的进步，但后续的研究发现VV加帽酶（D1R和D12L[13-15]）两种表达的质粒共转染对于获得重组病毒不是必需的，因此2018年Komoto等[22]将此方法进行了优化。
在共转染时将其中一个片段的质粒相对其他质粒的3倍进行转染进行对比，发现分别在NSP2和NSP5的转染量增加时，病毒滴度增加。
基于这个发现又将NSP2质粒和NSP5质粒转染量进行倍数增加对比，发现在NSP2质粒转染量增加3倍和NSP5质粒转染量增加5倍时重组病毒的拯救效率较好，成功建立了不需要辅助质粒的58modern journal of animal husbandry and veterinary medicine 2018年第10期RV的反向遗传系统。
该系统仅用RV的11个基因片段的质粒共转染BHK-T7细胞，获得源自cDNA的重组RV。
虽然NSP2质粒和NSP5质粒转染量增加提高了病毒拯救效率，但其机制仍不清楚，需要进一步的研究。
2RV反向遗传系统的应用2.1RV反向遗传系统在RV致病机制研究中的应用2.1.1研究RV NSP1C端区域功能在RV中NSP1可以通过促进IFN调节因子3（IRF3）的降解来拮抗干扰素（IFN）信号[23]，可利用反向遗传传系统分析C-末端截短的NSP1突变病毒在先天性免疫应答中的作用。