PCR和RT-PCR
三种PCR技术
《反义PCR在肿瘤检测中的应用》 肿瘤患者总是存在转移灶而加速病情的恶化， 转移灶的检测对肿瘤患者的诊断分期、治疗、复发、 预后判断、术后综合治疗的选择都有极大的意义。 反义PCR是是近年来发展的一种在亚显微水平检 测隐匿性肿瘤转移的方法,具有高特异性、高敏感性、 操作简便的特点。 在临床检测中，从早期的IE染色到现在常用的免 疫组织化染色，都存在低估转移数目的局限性，如： 免疫组织化方法可以从2xl05个骨髓细胞中检 出1个McF-7细胞。而反义PCR法可从106个淋巴细胞中 检出1个McF--7细胞。 此外，反义PCR采用mRNA为标志物,反义PCR法 有效地解决了从多个正常等位基因中分离突变基因的 问题。
易错PCR存在的问题 碱基的变异具有倾向性：种碱基比例不平衡的情 况下，A.T--CG的变异比率通常高于CG--AT,的变 异比率 易错 PCR 产量和变异水平偏低 模板的要求较高，最好是只含目的基因的DNA片段 解决方法 寻找新的影响酶功能、同时又不带来碱基变异偏 好的因素，开发更多的易错 PCR方法 易错 PCR多种诱变条件的简化 《定向进化-易错PCR方法提高华根霉Rhizopus chinensis CCTCC M201021脂肪酶的活力 》
《反向PCR法扩增花粉特异表达基因PSG076启动子》 在植物的有性生殖过程中，花粉的正常发育受阻 将会产生雄性不育，这是杂种优势利用中的关键材料。 因此可利用花粉特异性启动子驱动破坏花粉生长的基 因表达，促使花粉败育，从而获得雄性不育转基因材 料。 PSG076是小麦花粉特异性表达基因，本研究对其 上游启动子序列进行分离，并选择了已知序列上有切 点的酶进行切割，获得了1.4Kb的上游启动子序列。
RNA提取：Trizol试剂方法提总RNA EV71和Cox.A16的鉴别诊断 RT-PCR
PCR及RT-PCR概述
PCR及RT-PCR概述一、目的掌握聚合酶链式反应(PCR) 及逆转录－聚合酶链式反应(RT-PCR)的基本方法二、原理PCR用于扩增位于两段已知序列之间的DNA区段。
在由Taq DNA聚合酶催化的一系列合成反应中，使用两段寡核苷酸作为反应的引物。
一般情况下，这两段寡核苷酸引物的序列互不相同，并分别与模板DNA 两条链上的各一段序列互补，而这两段模板序列又分别位于待扩增的两侧。
反应时它包括三个基本步骤: (1) 变性(Denature):目的双链DNA 片段在94℃下解链; (2) 退火(Anneal):两种寡核苷酸引物在适当温度(50℃左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对;(3) 延伸(Extension):在Taq DNA 聚合酶合成DNA 的最适温度下,以目的DNA 为模板进行合成.由这三个基本步骤组成一轮循环,理论上每一轮循环将使目的DNA 扩增一倍（图4）,这些经合成产生的DNA 又可作为下一轮循环的模板,所以经25-35 轮循环就可使DNA 扩增达106倍。
RNA的多聚酶链式反应（RT-PCR）是以RNA为模板，联合逆转录反应（reverse transcrip－tion, RT）与PCR，可用于检测单个细胞或少数细胞中少于10个拷贝的特异DNA，为RNA病毒检测提供了方便；并为获得与扩增特定的RNA互补的cDNA提供了一条极为有利和有效的途径。
RNA扩增包括两个步骤：①在单引物的介导下和逆转录酶的催化下，合成RNA的互补链cDNA；②加热后cDNA与RNA链解离，然后与另一引物退火，并由DNA聚合酶催化引物延伸生成双链靶DNA，最后扩增靶DNA。
在RT-PCR中关键步骤是RNA的逆转录，cDNA的PCR与一般PCR条件一样。
由于引物的高度选择性，细胞总RNA无需进行分级分离，即可直接用于RNA的PCR。
但RT-PCR对RNA制品的要求极为严格，作为模板的RNA分子必须是完整的，并且不含DNA、蛋白质和其它杂质。
rt-pcr反应步骤
rt-pcr反应步骤
RT-PCR（逆转录聚合酶链式反应）是一种用于检测RNA的技本。
它可以将RNA转录成DNA，然后进行聚合酶链式反应来扩增特定的DNA片段。
以下是RT-PCR的一般步骤：
1. 样品处理，首先需要从样品中提取RNA。
这包括细胞或组织
的裂解以释放RNA，并使用适当的试剂将RNA纯化出来。
2. 逆转录，提取的RNA经过逆转录反应，使用逆转录酶（如
M-MLV逆转录酶）将RNA转录成相应的cDNA（互补DNA）。
3. PCR准备，为了进行PCR，需要将逆转录产生的cDNA与引物（primer）和DNA聚合酶（如Taq聚合酶）放入PCR反应管中。
引
物是一小段与目标DNA序列互补的DNA片段，它们将指导DNA聚合
酶在特定区域合成新的DNA链。
4. PCR扩增，PCR反应进行数个循环，每个循环包括三个步骤，变性、退火和延伸。
在变性步骤中，反应混合物被加热以使DNA解链。
在退火步骤中，引物与目标DNA结合。
在延伸步骤中，DNA聚
合酶在引物的引导下合成新的DNA链。
这些循环会使目标DNA片段
指数级增加。
5. 结果分析，最后，通过凝胶电泳或其他技术，可以分析PCR 反应产生的DNA片段，确定是否存在感兴趣的基因或RNA。
总的来说，RT-PCR是一个用于检测和定量RNA的强大技术，它结合了逆转录和聚合酶链式反应的步骤，可以在研究和临床诊断中发挥重要作用。
realtimePCR和RT-PCR详解及其区别要点
real-time PCR技术的原理及应用摘要：一、实时荧光定量PCR原理（一）定义：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
（二）实时原理 1、常规PCR技术：对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准一、实时荧光定量PCR原理（一）定义：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
（二）实时原理1、常规PCR技术：对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测。
2、实时定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析3、如何对起始模板定量？通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析.4、几个概念：（1）扩增曲线：（2）荧光阈值：（3）Ct值：CT值的重现性：5、定量原理：理想的PCR反应： X=X0*2n非理想的PCR反应： X=X0 (1+Ex)nn：扩增反应的循环次数X：第n次循环后的产物量X0：初始模板量Ex：扩增效率5、标准曲线6、绝对定量1）确定未知样品的 C(t)值2）通过标准曲线由未知样品的C(t)值推算出其初始量7、DNA的荧光标记：二、实时荧光定量PCR的几种方法介绍方法一：SYBR Green法（一）工作原理1、SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位2、SYBR Green 只有和双链DNA结合后才发荧光3、变性时，DNA双链分开，无荧光4、复性和延伸时，形成双链DNA， SYBR Green 发荧光，在此阶段采集荧光信号。
PCR反应体系的建立及优化:1、SYBR Green 使用浓度:太高抑制Taq酶活性，太低，荧光信号太弱，不易检测2、Primer：引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准3、MgCl2的浓度:可以降低到1.5mM,以减少非特异性产物4、反应Buffer 体系的优化5、反应温度和时间参数:由酶和引物决定6、其他与常规PCR相同（二）应用范围1、起始模板的测定；2、基因型的分析；3、融解曲线分析：可以优化PCR反应的条件，对常规PCR有指导意义，如对primer的评价；可以区分单一引物、引物二聚体、变异产物、多种产物。
实时荧光定量PCR(qPCR,RT-PCR)的原理及应用
病原体检测 转基因食品检测 基因表达研究 •相对定量(Relative Quantification，RQ) 基因在不同组织中的表达差异 药物疗效考核 耐药性研究
RT-PCR技术的数据分析 相对定量通过内标定量
内标（Endogenous Control） 通常是18S、28S、β-actin、GAPDH基因等看家基因
RT-PCR技术的原理及试验流程
RT-PCR技术的原理及试验流程
RT-PCR反应体系 模板 4.5μl Tag mixture 5.0μl F(F’) 0.25μl R(R’) 0.25μl
荧光染料
SYBR Green I
荧光标记的探针TaqMan探针法
RT-PCR技术的原理及试验流程
Monitoring PCR with the SYBR Green I Dye（SYBR Green 法）
克服了普通PCR：1、终点定量重复性不好 2、EB有毒，荧光太贵等缺点
实时荧光定量PCR的定义
PCR技术和荧光检测技术的结合
通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，对PCR产物进行 标记跟踪，实时在线监控反应过程，通过仪器和相应的软 件分析结果，对待测样品的初始模板进行定量或定性分析。
RT-PCR技术的原理及试验流程
在定量PCR中，需要经过数个循环后荧光信号才能够 被检测到，一般以15个循环的荧光信号作为荧光本底 信号。
RT-PCR技术的数据分析
扣 除 背 景 荧 光 后 的 相 对 荧 光 量
如何定量？-ΔΔCt
PCR扩增循环数
2. Ct 值的定义 在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念 — — Ct值。C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是： 每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的 循环数（如图所示）。
PCR和RT-PCR区别
PCR和RT-PCRPCR和RT-PCR基础PCR基础聚合酶链式反应（PCR）过程利用模板变性，引物退火和引物延长的多个循环来扩增DNA序列。
这是一个指数增长的过程，因为上一轮的扩增产物又作为下一轮扩增的模板，使其成为检测核酸的一种非常灵敏的技术。
一般，经过20-30个循环得到的扩增产物就足够在溴化乙锭染色的凝胶上观察到。
反应包括几个成分（表1）。
模板可以为纯化的基因组或质粒DNA；由RNA转化得到的cDNA；或未经纯化的粗制生物样品，如细菌克隆或噬菌斑。
引物确定了扩增产物的序列和长度。
最常用的热稳定聚合酶是Taq DNA聚合酶。
这种酶适用于常规扩增，但是使用其他热稳定聚合酶会改善结果。
扩增反应还包括缓冲液，三磷酸脱氧核苷及镁离子。
镁离子浓度影响酶的活性、引物退火、模板和PCR产物的熔点（Tm），忠实性以及引物二聚体的形成等。
在随后的章节中将讨论这些成分、循环参数以及其他参与作用的因子相互间各种作用对于成功PCR的影响。
表1.反应成分Component Final ConcentrationTemplate 10^4-10^6 copies of DNA templatePrimer 1 0.1-0.5µMPrimer 2 0.1-0.5µM10X Reaction buffer 1XMagnesium 1.0-3.0mMdNTP mix 200 mM each dNTPThermostable DNA polymerase 1-4 units/100 ml reactionRT-PCR基础RT-PCR将以RNA为模板的cDNA合成同PCR结合在一起，提供了一种分析基因表达的快速灵敏的方法。
RT-PCR用于对表达信息进行检测或定量。
另外，这项技术还可以用来检测基因表达差异或不必构建cDNA文库克隆cDNA。
RT-PCR比其他包括Northern印迹、RNase保护分析、原位杂交及S1核酸酶分析在内的RNA分析技术，更灵敏，更易于操作。
RT-PCR
RT-PCR实验有三步：抽提RNA，RT，PCR。
要求：1.做RT前必需测RNA浓度，逆转录体系对RNA量还是有一些要求，常用500ng或1ug。
2. RT按要求做，一般不会出太大问题。
3. PCR，按常规。
但如需扩长片段，则对前两步要求较高，需要有完整的cDNA存在，不是单改变Mg2+浓度、退火温度能解决的。
1）RT和PCR时的引物设计是不是一定要先知道目的基因的序列？必须在RT时，引物设计有3种方法即a：Random 9mers；b：Oligo dT-Adaptor Primer；和c：特异的下游引物。
如果用a和b方法，是扩增的所有的cDNA（理论上），还要用此产物做PCR 的模板继续扩增。
如果用c方法，那么要去那里查它的序列呢？问题：在做RT-PCR遇到一怪现象，即对同一动物不同组织扩增同一段基因，结果从一种组织中可以扩出我的目的基因，条带非常的好，而另一组织在同样的条件下却得到许多非特异性的条带，尝试其他条件同样无法得到满意的结果，百思不得其解！（注：已肯定该基因在两种组织中都表达，且内参照在两种组织都可扩增出来）从这两种组织中提取的RNA的量是不一样的，我测过吸光度，差异还很大，会不会和这有关呢？请高手指教！解答：1.RT-PCR有两种做法：条件具备的话可用kit进行一步法进行；若条件不太好的话可分两步进行逆转录再PCR。
但后来发现两步法的结果更加理想，条带特异性强且无拖尾现象，我推测是体系更加单一比较利于PCR的进行，当然也可能是我买的kit不太好。
（promega）。
2.RT-PCR应具备的条件高质量的RNA（保留后可做5…，3‟RACE）；引物的（最好产物短点）；若涉及粗略定量的话还应考虑R NA的浓度或是cDNA的浓度（如果由内标分子更好，但我发现其实很不容易将RNA的浓度以及内标分子的表达量调整的完全一样）；体系的均一性等。
3.RACE我做过RACE（3‟RACE是宝生物的Kit；5…RACE是Gibico），但现在再进行另一个同源基因的3…RACE 时却怎么也P不出来，这两个基因是由同一对引物扩增出来的，其中一个已经获得了全序列（RACE的方法），而另一个基因的3‟UTR却增么也扩不出来，我推测是不是该基因的3…UTR太长的缘故，我都快绿了，有无RT-PCR的常用内标b－actin 和GAPDH的使用有选择性吗？比如不同的细胞，不同的刺激。
逆转录PCR原理及步骤
逆转录PCRRT-PCR和逆转录PCR是同义词，已合并。
RT-PCR 为反转录PCR（reverse transcription PCR）和实时PCR（real time PCR）共同的缩写。
逆转录PCR，或者称反转录PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR)，是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。
在RT-PCR中，一条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。
目录1mode逆转录PCR2实时PCR3RT-PCR技术相关试剂4PCR各步骤的目的1 4.1 预变性1 4.2 三种循环1 4.3 延伸时间原因1 4.4 PCR引物的选择1 4.5 注意事项1mode逆转录PCR由一条RNA单链转录为互补DNA(cDNA)称作“逆转录”，由依赖RNA的DNA聚合酶（逆转录酶）来完成。
随后，DNA的另一条链通过脱氧核苷酸引物和依赖DNA的DNA聚合酶完成，随每个循环倍增，即通常的PCR。
原先的RNA模板被RNA酶 H降解，留下互补DNA。
RT-PCR的指数扩增是一种很灵敏的技术，可以检测很低拷贝数的RNA。
RT-PCR广泛应用于遗传病的诊断，并且可以用于定量监测某种RNA的含量。
（检测基因表达的方法，参见Northern Blot法。
RT-PCR的关键步骤是在RNA的反转录，要求RNA模版为完整的且不含DNA、蛋白质等杂质。
常用的反转录酶有两种，即鸟类成髓细胞性白细胞病毒（avian myeloblastosis virus,AMV）反转录酶和莫罗尼鼠类白血病病毒（moloney murine leukemia vrius,MMLV）反转录酶。
RT-PCR有时候也会指代实时PCR(real-time PCR)。
为了与逆转录PCR相区别，通常被写作“定量PCR”(quantitative PCR)或者RTQ-PCR(real-time quantitative PCR)。
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PCR和RT-PCR兰州大学王映珍第一章PCR和RT-PCR基础第二章PCR基础聚合酶链式反应（PCR）过程利用模板变性，引物退火和引物延长的多个循环来扩增DNA序列。
这是一个指数增长的过程，因为上一轮的扩增产物又作为下一轮扩增的模板，使其成为检测核酸的一种非常灵敏的技术。
一般，经过20-30个循环得到的扩增产物就足够在溴化乙锭染色的凝胶上观察到。
反应包括几个成分（表1）。
模板可以为纯化的基因组或质粒DNA；由RNA转化得到的cDNA；或未经纯化的粗制生物样品，如细菌克隆或噬菌斑。
引物确定了扩增产物的序列和长度。
最常用的热稳定聚合酶是Taq DNA聚合酶。
这种酶适用于常规扩增，但是使用其他热稳定聚合酶会改善结果。
扩增反应还包括缓冲液，三磷酸脱氧核苷及镁离子。
镁离子浓度影响酶的活性、引物退火、模板和PCR产物的熔点（Tm），忠实性以及引物二聚体的形成等。
在随后的章节中将讨论这些成分、循环参数以及其他参与作用的因子相互间各种作用对于成功PCR的影响。
表1.反应成分Component Final ConcentrationTemplate 10^4-10^6 copies of DNA templatePrimer 1 0.1-0.5µMPrimer 2 0.1-0.5µM10X Reaction buffer 1XMagnesium 1.0-3.0mMdNTP mix 200 mM each dNTPThermostable DNA polymerase 1-4 units/100 ml reactionRT-PCR基础RT-PCR将以RNA为模板的cDNA合成同PCR结合在一起，提供了一种分析基因表达的快速灵敏的方法。
RT-PCR用于对表达信息进行检测或定量。
另外，这项技术还可以用来检测基因表达差异或不必构建cDNA文库克隆cDNA。
RT-PCR比其他包括Northern印迹、RNase 保护分析、原位杂交及S1核酸酶分析在内的RNA分析技术，更灵敏，更易于操作。
RT-PCR的模板可以为总RNA或poly(A)+选择性RNA。
逆转录反应可以使用逆转录酶，以随机引物、oligo(dT)或基因特异性的引物（GSP）起始。
RT-PCR可以一步法或两步法的形式进行。
在两步法RT-PCR中，每一步都在最佳条件下进行。
cDNA的合成首先在逆转录缓冲液中进行，然后取出1/10的反应产物进行PCR。
在一步法RT-PCR中，逆转录和PCR在同时为逆转录和PCR优化的条件下，在一只管中顺次进行。
图1. RT-PCR概图这本指南阐述了成功RT-PCR和PCR的关键。
高灵敏性（从小量样品中得到足量结果）和高特异性（选择性地仅得到所需的产物）是成功PCR的标志。
可以通过仔细的实验设计（如选择恰当的酶，设计最理想的引物，使用不同的缓冲液和添加剂，确定循环参数及制备高质量的模板等）以获得最佳的RT-PCR和PCR。
第二章增加RT-PCR灵敏度分离高质量RNA成功的cDNA合成来自高质量的RNA。
高质量的RNA至少应保证全长并且不含逆转录酶的抑制剂，如EDTA或SDS。
RNA的质量决定了你能够转录到cDNA 上的序列信息量的最大值。
一般的RNA纯化方法是使用异硫氰酸胍／酸性酚的一步法。
Trizol试剂法（见下图）将一步法加以提高，可以从多种组织和细胞中提取高质量的非降解RNA。
Trizol试剂法可以从最少100个细胞或1mg组织中提取RNA。
TRIzol®试剂步骤略图一般不必使用oligo(dT)选择性分离poly(A)+RNA。
不管起始模板是总RNA还是poly(A)+ RNA，都可以检测到扩增结果（图2）。
另外，分离poly(A)+ RNA会导致样品间mRNA丰度的波动变化，从而使信息的检出和定量产生偏差。
然而，当分析稀有mRNA时，poly(A)+ RNA会增加检测的灵敏度。
图2. 总RNA和poly(A)+ RNA在RT-PCR中的比较以5或1μg Hela细胞总RNA（分别为泳道1和2）或500ng和50ng Hela细胞poly(A)+ RNA（分别为泳道3和4）。
使用oligo(dT)引物和SuperScriptⅡ逆转录酶合成cDNA。
扩增对象为DNA聚合酶εmRNA 5'端377bp片段和复制酶A mRNA的643bp片段，两者都为中等丰度。
将1/10的cDNA合成反应产物使用Taq DNA聚合酶扩增30个循环。
为了防止痕量RNase的污染，从富含RNase的样品（如胰脏）中分离到的RNA需要贮存在甲醛中以保存高质量的RNA，对于长期贮存更是如此。
从大鼠肝脏中提取的RNA，在水中贮存一个星期就基本降解了，而从大鼠脾脏中提取的RNA，在水中保存3年仍保持稳定。
另外，长度大于4kb的转录本对于痕量RNase的降解比小转录本更敏感。
为了增加贮存RNA样品的稳定性，可以将RNA溶解在去离子的甲酰胺中，存于-70℃。
用于保存RNA的甲酰胺一定不能含有降解RNA的杂物。
来源于胰脏的RNA至少可以在甲酰胺中保存一年。
当准备使用RNA时，可以使用下列方法沉淀RNA：加入NaCl至0.2M及4倍体积的乙醇，室温放置3-5分钟，10,000×g 离心5分钟。
在逆转录反应中经常加入RNase抑制剂以增加cDNA合成的长度和产量。
RNase抑制剂要在第一链合成反应中，在缓冲液和还原剂（如DTT）存在的条件下加入，因为cDNA合成前的过程会使抑制剂变性，从而释放结合的可以降解RNA的RNase。
蛋白RNase抑制剂仅防止RNase A，B，C对RNA 的降解，并不能防止皮肤上的RNase，因此尽管使用了这些抑制剂，也要小心不要从手指上引入RNase。
使用无RNaseH活性（RNaseH-）的逆转录酶逆转录酶催化RNA转化成cDNA。
不管是M-MLV还是AMV，在本身的聚合酶活性之外，都具有内源RNaseH活性。
RNaseH活性同聚合酶活性相互竞争RNA 模板与DNA引物或cDNA延伸链间形成的杂合链，并降解RNA：DNA复合物中的RNA链。
被RNaseH活性所降解的RNA模板不能再作为合成cDNA的有效底物，降低了cDNA合成的产量和长度。
因此消除或大大降低逆转录酶的RNaseH活性将会大有裨益。
SuperScriptⅡ逆转录酶，RNaseH- 的MMLV逆转录酶及ThermoScript逆转录酶，RNaseH- 的AMV，比MMLV和AMV得到更多量和更多全长的cDNA（图3）。
RT-PCR灵敏度会受cDNA合成量的影响。
ThermoScript比AMV的灵敏性强得多（图4）。
RT-PCR产物的大小受限于逆转录酶合成cDNA的能力，尤其是克隆较大的cDNA时。
同MMLV相比，SuperScripⅡ显著提高了长RT-PCR产物的产量（图5）。
RNaseH- 的逆转录酶同时增加了热稳定性，所以反应可以在高于正常的37-42℃的温度下进行。
图3 逆转录酶对cDNA第一链产量的影响在建议的合成条件下，使用oligo(dT)引物和10μCi的[α-P]dCTP。
第一链的总产量使用TCA沉淀法计算。
全长cDNA使用在碱性琼脂糖胶上将大小分类的条带切除并计数的方法分析。
图4 逆转录酶对RT-PCR灵敏度的影响图5 逆转录酶对长模板RT-PCR灵敏度的影响以oligo(dT)为引物，使用ThermoScriptⅡ或AMV，在50℃下由Hela细胞总RNA合成cDNA。
使用Platinum® Taq DNA聚合酶和人DNA聚合酶ε引物进行35个循环。
人tuberous scherosis ⅡmRNA（5.3kb）和人DNA聚合酶εmRNA的全长cDNA的合成由SuperScriptⅡ和MMLV催化。
利用oligo(dT)为引物，由5μg Hela细胞总RNA合成cDNA。
样品使用RNaseH处理，然后使用ELONGASE? Enzyme Mix将1/10的cDNA合成反应产物扩增35个循环。
RNaseH产生的障碍RNaseH对第一链cDNA的影响。
RNaseH在cDNA合成期间降解RNA:DNA复合体中的RNA。
红色箭头代表潜在的酶切位点。
提高逆转录保温温度较高的保温温度有助于RNA二级结构的打开，增加了反应的产量。
对于多数RNA 模板，在没有缓冲液或盐的条件下，将RNA和引物在65℃保温，然后迅速置于冰上冷却，可以消除大多数二级结构，从而使引物可以结合。
然而某些模板仍然会存在二级结构，即使热变性后也是如此。
对这些困难模板的扩增可以使用ThermoScript逆转录酶，并将逆转录反应置于较高温度下进行以改善扩增（图6）。
较高的保温温度也可以增加特异性，尤其是当使用基因特异性引物（GSP）进行cDNA合成时（见第三章）。
如果使用GSP，确保引物的Tm值与预计的保温温度相同。
不要在高于60℃时使用oligo(dT)和随机引物。
随机引物需要在增加到60℃前在25℃保温10分钟。
除了使用较高的逆转录温度外，还可以通过直接将RNA/引物混合物从65℃变性温度转到逆转录保温温度，并加入预热的2×的反应混合物提高特异性（cDNA热启动合成）。
这种方法有助于防止较低温度时所发生的分子间碱基配对。
使用PCR仪可以简化RT-PCR所需的多种温度切换。
图6 温度对不同模板的影响使用ThermoScript或AMV，以18S rRNA基因特异性引物，由10ng大豆总RNA在所示温度合成cDNA。
将1/10的cDNA反应产物使用高保真Platinum TaqDNA聚合酶进行40个PCR反应循环。
表2. 逆转录保温温度Reverse Transcriptase Incubation TemperatureAMV 37°C-45°CM-MLV 37°CSuperScript™II RT 37°C-50°CThermoScript™ RT 42°C-65°CRNA在高于65℃时开始水解，对于≤1kb的RNA第一链合成温度可以为70℃，对于＞1kb的RNA则需要＜65℃。
Tth热稳定聚合酶在Mg存在条件下作为DNA聚合酶，在Mn存在条件下作为RNA聚合酶。
它可以在最高65℃条件下保温。
然而，PCR过程中Mn的存在会降低忠实性，这使得Tth聚合酶不太适合用于高精确度的扩增，如cDNA的克隆。
另外，Tth的逆转录效率较低，这会降低灵敏度，而且，既然单个酶就可以进行逆转录和PCR，那么没有逆转录的对照反应就不能用来将cDNA的扩增产物同污染的基因组DNA的扩增产物区分开来。
促进逆转录的添加剂包括甘油和DMSO在内的添加剂加到第一链合成反应中，可以减低核酸双链的稳定并解开RNA二级结构，最多可以加入20％的甘油或10％的DMSO而不影响SuperScriptⅡ或MMLV的活性。