京尼平交联的脱细胞牛心包生物支架材料的实验研究
新型生物交联剂京尼平论文：新型生物交联剂京尼平的性质与应用
新型生物交联剂京尼平论文：新型生物交联剂京尼平的性质与应用一、京尼平简介交联剂已经被广泛地应用于细胞膜结构、蛋白质结构、蛋白质间相互作用、生物导弹、载体蛋白与半抗原的连接、蛋白质或其他分子的固相化及抗体的标记等生物领域的研究。
常用的交联剂有戊二醛、双重氮联苯胺–2,2′–二磺酸、1,5–二氟–2,4–二硝基苯与己二酰亚胺酸二甲酯等。
但这些化学交联剂在使用中存在毒性高，污染严重等缺点。
因此，寻求一种低毒性、生物可降解的交联剂来代替戊二醛已非常必要。
京尼平（genipin）是栀子苷经β-葡萄糖苷酶水解后的产物，是一种优良的天然生物交联剂。
一般采用从栀子中提取京尼平苷，再用β-葡萄糖苷酶水解，然后用乙醚萃取、真空浓缩、重结晶而制得，也可以采用微生物转化法制备[1、2]。
栀子属于茜草科植物，是我国盛产的一种中药材，具有利胆、保肝等功效，在我国应用于临床治疗已有1600多年历史[3]。
栀子果实的化学成分很多，主要包括藏红花素类、栀子苷类和多元酚类，其中栀子苷的主要成分为京尼平苷[4]。
京尼平苷是一种环烯醚萜葡萄糖苷，无毒、易溶于水，京尼平苷在杜仲和栀子中含量均较高，达到3%~8%左右。
djerassi等[5]早在1960年就利用核磁共振光谱数据和化学降解实验发现了京尼平，其分子式为c11h14o5，属于环烯醚萜类物质，京尼平苷与京尼平的结构式可见图1.2。
京尼平本身是无色的，但是它与氨基酸发生反应后，会产生蓝色化合物，这种蓝色化合物是可以食用的，现在已被用在食品着色剂中[6]。
二、京尼平交联机理随着京尼平参与明胶、壳聚糖等交联反应的广泛化，其交联反应机理也先后被报道[1,7-9]。
图1.3为含氨基聚合物与京尼平交联反应的示意图[9]。
京尼平交联明胶、壳聚糖等含氨基基团的化合物的机理最为成熟的是ph依赖型机理[2]。
在不同的ph条件下，京尼平与壳聚糖等的交联机理不同。
1.在酸性和中性条件下，壳聚糖上的氨基基团亲和攻击京尼平c-3位的烯碳原子，二氢吡喃环打开，形成杂环胺，这样可以形成由短链京尼平为交联桥的网状结构聚合物。
组织工程肌腱种子细胞、支架材料和生长因子的研究进展
组织工程肌腱种子细胞、支架材料和生长因子的研究进展组织工程肌腱作为肌腱损伤修复的重要方法，已成为研究热点。
本文以“组织工程肌腱、种子细胞、支架材料、生长因子”为主题词，检索CNKI的相关文献。
纳入具有原创性、论点论据可靠的实验文章，排除重复性研究，选择符合标准的40篇文献进行分析。
对种子细胞的种类、支架材料的选择以及诱导肌腱形成因素进行阐述，促进每个关键点的优化，以利于组织工程肌腱的成熟构建。
肌腱位于肌肉與骨骼之间，起力的传导作用。
肌腱内细胞、血管较少，含大量纵行排列的胶原纤维。
肌腱损伤在临床属常见疾病，损伤后愈合较慢，很难恢复到正常肌腱一样的抗拉伸强度。
传统移植治疗因存在移植物来源有限，免疫排斥等问题，修复效果不理想。
组织工程肌腱为肌腱损伤修复提供了一种新方法，其是将种子细胞种植于支架材料上，体外培养后移植到缺损部位，随着支架材料的降解，细胞外基质的分泌，形成新的肌腱组织，达到生物意义上的完全修复。
1 种子细胞1.1 自体肌腱细胞肌腱细胞作为肌腱组织固有细胞，是人们首先想到的组织工程肌腱种子细胞。
1971年，Jimenez等[1]成功在体外培养鸡胚腱细胞，此后，对肌腱细胞的研究逐渐深入。
张兆锋等[2]体外培养成年家鸡肌腱细胞，种植于支架材料，回植于家鸡体内，培养出大体、组织学结构均与正常肌腱相似的组织。
但肌腱细胞增殖能力较差，尤其是在体外培养环境下，经数次传代，细胞逐渐老化。
杨志明等[3]发现类胰岛素生长因子（insulin-like growth factor-1，IGF-1）能加速肌腱细胞mRNA转录和蛋白质合成。
肌腱细胞如能获得稳定的增殖能力则可以成为组织工程肌腱种子细胞。
1.2 间充质干细胞间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells，MSCs）具有多向分化潜能，可以向骨、软骨、肌腱、脂肪等组织分化，其易扩增数量，可以多次传代并保持分化能力。
Dressler等[4]取同一兔不同年龄时期的MSCs种植于Ⅰ型胶原支架，并回植于兔体内，结果显示所形成的肌腱样组织在组织学及力学性能方面都无明显差异，证明MSCs的增殖分化能力不受供体年龄限制。
交联温度对京尼平交联胶原壳聚糖组织工程支架的影响
交联温度对京尼平交联胶原/壳聚糖组织工程支架的影响来源：中国论文下载中心 [ 10-05-04 09:57:00 ] 编辑：studa20作者：曹峥，胡蕴玉，潘纬敏，白雪东，毕龙，李丹，杨小彬，刘民【摘要】[目的]通过研究材料的孔径、交联度、溶胀率、降解率、细胞毒性及组织相容性的变化，探讨交联温度对京尼平交联胶原/壳聚糖支架的影响。
[方法] 采用冷冻干燥法制备胶原/壳聚糖复合多孔支架，分别于4℃、20℃、36℃条件下，在0.5%京尼平水溶液中交联24 h。
以未交联的胶原/壳聚糖复合多孔支架作为对照，评价所得支架的孔径、交联度、溶胀率、降解率、细胞毒性及组织相容性特点。
[结果]随交联温度升高，支架的交联度明显增大，溶胀率和降解率逐渐减小。
4℃组支架交联度47.88%±6.4%，溶胀率为721%±46%，4周后降解3.95%±6.4%;20℃组支架交联度67.69%±3.6%，溶胀率为662%±72%，4周降解0.91%±5.9%;36℃组支架交联度70.32%±5.7%，溶胀率为635%±27%，4周降解0.66%±7.3%，三组上述观察指标均优于未交联组(P/0.01)。
[结论]京尼平交联可以显著降低胶原/壳聚糖支架的降解率和溶胀率，且对支架结构和生物相容性无明显影响。
交联温度增加可以提高支架的交联度和抗降解能力，较快获得具有良好生物相容性和降解率的组织工程支架。
【关键词】交联温度; 壳聚糖; 胶原; 京尼平; 组织工程Abstract: [Objective]To investigate the changes of pore sizes,crosslinking index,swelling ration,degradation rate,cytotoxicity and biocompatibility of genipin crosslinked collagen/chitosan scaffolds affected by the different crosslinking temperature points.[Method]The freeze-dried collgaen/chitosan scaffolds crosslinked with 0.5% genipin within 24 h were divided into 3 groups by crosslinking temperature:4℃group,20℃group and 36℃group.The characteristics of pore sizes,crosslinking index,swelling ratio,degradation rate,cytotoxicity and biocompatibility were evaluated.Collagen/chitosan scaffolds without crosslinking were chosen as controlgroup.[Result]With the increase of temperature,crosslinking index was increased,but swelling ratio and degradation rate were decreased.In 4℃group,the crosslinking index was47.88%±6.4%,the swelling ratio was 721%±46%,and the degradation rate was decreased by3.95%±6.4% at 4 weeks.In 20℃group,the crosslinking index was 67.69%±3.6%,the swelling ration was 662%±72%,and the degradation rate was 0.91%±5.9% in 4 weeks.In 36℃group,the crosslinking index was 70.32%±5.7%,the swelling ration was 635%±27%,and the degradation rate was 0.66%±7.3% at 4 weeks.The above indexes of the three groups were much better than thoseof control group(P<0.01).[Conclusion]It was indicated that the swelling ratio and degradation rate of the collagen/chitosan scaffolds are significantly decreased by genipin without any obvious change of pore sizes and toxicity.The biocompatibility and degradation rate of this tissur engineering scaffold can be well obtained with genipin by increasing crosslinking temperature within 24 h.Key words：crosslink temperature; chitosan; collagen; genipin; tissue engineering胶原因其良好的组织相容性和可降解性被广泛用于组织工程研发领域。
京尼平交联对去污剂联合酶法脱细胞兔组织工程气管基质生物力学性能的影响简
京尼平交联对去污剂联合酶法脱细胞兔组织工程气管基质生物力学性能的影响简徐艳飞;蒋媛;史宏灿;张思泉【期刊名称】《解放军医学院学报》【年(卷),期】2016(037)010【摘要】目的探讨京尼平交联对去污剂联合酶法(detergent enzymatic method,DEM)脱细胞兔气管基质生物力学性能的影响。
方法健康成年新西兰兔30只,用随机数字表法分为3组(A、B、C),每组10只,A为DEM脱细胞组,B为京尼平交联脱细胞组,C为原生对照组。
A、B组行DEM脱细胞处理,随后B组用1%京尼平交联,3组气管基质行力学测试评估脱细胞及京尼平交联对气管基质生物力学性能的影响。
结果拉伸强度A组(0.25±0.02)MPa,B组(0.42±0.09)MPa,C组(0.28±0.06)MPa;弹性模量A组(0.67±0.08)MPa,B组(1.18±0.31)MPa,C组(1.19±0.32)MPa。
A组与C组弹性模量差异有统计学意义(P<0.05),拉伸强度差异无统计学意义(P>0.05);A组与B组弹性模量和拉伸强度差异均有统计学意义(P≤0.05);B组与C组弹性模量和拉伸强度差异均无统计学意义(P>0.05)。
结论DEM脱细胞在一定程度上降低了气管基质生物力学性能,而京尼平交联可以显著提高脱细胞气管基质生物力学性能且获得的气管基质具有与原生气管相似的力学性能。
【总页数】4页(P1082-1085)【作者】徐艳飞;蒋媛;史宏灿;张思泉【作者单位】扬州大学医学院【正文语种】中文【中图分类】R318.08【相关文献】1.交联剂对脱细胞膀胱基质生物力学性能的影响 [J], 范雪梅;李胜平;徐惠成2.京尼平交联对去污剂联合酶法脱细胞兔组织工程气管基质生物力学性能的影响[J], 徐艳飞;蒋媛;史宏灿;张思泉3.京尼平交联对去污剂联合酶法脱细胞兔组织工程气管基质生物力学性能的影响[J], 徐艳飞;蒋媛;史宏灿;张思泉;4.京尼平交联脱细胞纤维环基质/壳聚糖水凝胶与兔纤维环源干细胞的生物相容性[J], 刘晨;赵泉来;王凌挺;王弘;刘平;李斌;徐宏光5.京尼平交联脱细胞纤维环基质/壳聚糖水凝胶与兔纤维环源干细胞的生物相容性[J], 刘晨;赵泉来;王凌挺;王弘;刘平;李斌;徐宏光;因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
脱细胞牛心包构建引导骨再生膜的初步研究
脱细胞牛心包构建引导骨再生膜的初步研究张文斌;吴汉江;姚本栈;胡广伟;周艺群【期刊名称】《中国修复重建外科杂志》【年(卷),期】2006(20)3【摘要】目的制备具有良好生物相容性和适宜降解吸收时间的引导骨组织再生(guidedboneregeneration,GBR)膜材料。
方法采用0.25%Trypsin+0.5%TritonX-100酶联脱细胞法对新鲜牛心包进行脱细胞处理,将脱细胞牛心包(A组)、甘油保存脱细胞牛心包(B组)、碳化二亚胺[1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidehy-drochloride,EDAC]交联脱细胞牛心包(C组)、甘油保存EDAC交联脱细胞牛心包(D组)4种膜材料分别植入38只SD大鼠背部皮下,不植入材料为E组。
于2、4、8和16周分别处死大鼠7、12、12和7只,观察周围组织反应及材料的降解吸收情况。
结果4种材料植入动物体内均有不同程度的炎性反应和纤维囊膜形成。
术后4周,A组和C组的炎性反应轻微,纤维包膜变薄。
A组膜材料吸收替代时间为8周左右,C组吸收替代时间为16周左右;16周时B组和D组材料仍有纤维包膜。
结论EDAC交联脱细胞牛心包具有良好的生物相容性和理想的降解性能,在动物体内能顺利被自体组织替代。
【总页数】5页(P287-291)【关键词】生物相容性;降解;吸收;脱细胞牛心包【作者】张文斌;吴汉江;姚本栈;胡广伟;周艺群【作者单位】中南大学湘雅二医院口腔科【正文语种】中文【中图分类】R318;R318.08【相关文献】1.以带蒂筋膜瓣为膜引导骨再生屏障膜包裹接种自体骨髓间充质干细胞的非细胞型组织工程促进骨缺损修复的研究 [J], 胡振顺;杨新明;王耀一;孟宪勇;张瑛;阴彦林2.以脱细胞牛心包膜为支架材料构建组织工程化表皮的初步研究 [J], 姚本栈;吴汉江;胡广伟3.脱细胞牛心包膜材料与胶原膜引导骨再生的对照研究 [J], 吴汉江;胡广伟4.牛心包衍生材料引导骨再生的实验研究 [J], 胡广伟;吴汉江;姚本栈5.天然衍生脱细胞牛心包复合BMP-2转染的BMSCs引导骨组织再生的体外实验研究 [J], 白明海;张婷婷;吴汉江;赵志河;何正权;刘兴玉因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
牛肌腱冻干脱细胞支架的生物力学特性
牛肌腱冻干脱细胞支架的生物力学特性钱闯;陈雄生;周盛源;朱巍【期刊名称】《中国组织工程研究》【年(卷),期】2015(019)030【摘要】背景:目前的脱细胞方法在去除细胞的同时对细胞外基质存在一定的损伤,降低了脱细胞支架的生物力学性能.目的:分析冻干牛肌腱脱细胞支架的生物力学特性.方法:取新鲜小牛趾伸屈肌腱,去除小牛肌腱表面的滑膜、腱膜及软组织,双蒸水冲洗干净后低压冻干,通过物理方法制备肌腱纤维束60个,随机均分为两组,实验组于无菌操作下置入丝氨酸蛋白酶抑制剂,室温下持续24 h,无菌PBS冲洗后,再移入低浓度胰酶+乙醇混合溶液中,在不破坏细胞外基质的情况下去除细胞壁,室温下持续5 h,再将纤维束移入脱氧核糖核酸酶溶液中持续5 h,最后将已完成脱细胞步骤的支架使用PBS冲洗48 h,无菌室内室温下干燥;对照组不做处置.检测两组材料的弹性模量、耐久性及最大应力.结果与结论:两组耐久性相似,但实验组在相同位移处的应力小于对照组;两组弹性模量比较差异无显著性意义,但实验组最大应力低于对照组(P < 0.01).说明冻干脱细胞支架能够在一定程度上模仿牛肌腱的生物力学功能.%BACKGROUND:Current decelularized methods have the certain damage to the extracelular matrix and reduce the biomechanical properties of acelular scaffolds. OBJECTIVE:To explore the biomechanical properties of decelularized scaffold of lyophilized bovine tendon. METHODS:Sixty lyophilized fiber bundles from fresh flexion tendon of calf toes were randomly divided into two groups: control group and experimental group. In the experimental group, serine protease inhibitorswere placed asepticaly for 24 hours at room temperature, then the samples were rinsed with PBS and transferred to the low concentration of trypsin+ethanol mixed solution to remove the cel wal without destruction of the extracelular matrix at room temperature for 5 hours; after that, the fiber bundles were cultured in DNA enzyme solution for 5 hours, finaly the acelular scaffold was completed and rinsed with PBS for 48 hours and dried at room temperature in sterile room. No treatment was done in the control group. Modulus of elasticity, durability and maximum stress were determined in the two groups. RESULTS AND CONCLUSION:Similar elastic modulus and durability were found in the two groups, but the maximum stress in the experimental group was significantly lower than that in the control group (P < 0.01). These findings indicate that the lyophilized acelular tendon fibers can mimic the biological function of bovine tendon fibers to a certain extent.【总页数】5页(P4865-4869)【作者】钱闯;陈雄生;周盛源;朱巍【作者单位】解放军第二军医大学,上海市 200003;解放军第二军医大学附属长征医院脊柱三科,上海市 200003;解放军第二军医大学附属长征医院脊柱三科,上海市200003;解放军第二军医大学附属长征医院脊柱三科,上海市 200003【正文语种】中文【中图分类】R318【相关文献】1.冻干同种骨含水量的基本知识及冻干对其生物力学特性的影响 [J], 贾潇凌;康悦;石凤荣2.牛肌腱冻干脱细胞支架的生物力学特性 [J], 钱闯;陈雄生;周盛源;朱巍;3.冻干韧带脱细胞支架材料的生物相容性及优势 [J], 王辉;陈雄生;周盛源;黄俊俊;蔡弢艺4.牛脱细胞骨基质的生物力学特性及其黏附性 [J], 孙晓雷;马信龙;马剑雄;张弢;王志刚;王涛;张华锋5.脱细胞随机肌腱支架促进骨髓间充质干细胞骨向分化 [J], 张珂珂; 李红梅; 刘畅因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
一种脱细胞生物羊膜及种以及京尼平交联脱细胞生物羊膜的制备方法
(10)申请公布号(43)申请公布日 (21)申请号 201510727418.7(22)申请日 2015.10.30A61L 27/36(2006.01)A61L 27/50(2006.01)A61L 27/60(2006.01)A61L 31/00(2006.01)A61L 31/14(2006.01)(71)申请人成都青山利康药业有限公司地址610000 四川省成都市高新区高朋大道14号(72)发明人徐世兰 刘凯 侯鹏(74)专利代理机构成都高远知识产权代理事务所(普通合伙) 51222代理人李高峡 张娟(54)发明名称一种脱细胞生物羊膜及种以及京尼平交联脱细胞生物羊膜的制备方法(57)摘要本发明公开一种京尼平交联脱细胞生物羊膜的制备方法：a、制备脱细胞生物羊膜；b、取步骤a 制备的脱细胞生物羊膜，浸泡于浓度为0.2％-1％的京尼平溶液中，35-40℃恒温下作用0.5-72h，纯化水或去离子水清洗；c、病毒灭活，纯化水或去离子水清洗，真空冷冻干燥，即可。
本发明还提供了前述方法制备的京尼平交联脱细胞生物羊膜。
本发明方法可以制备得到抗酶解性能优良、力学性能优良的京尼平交联脱细胞生物羊膜，克服了天然羊膜存在细胞残留、机械性能不足以及降解周期较短的缺陷，临床应用前景良好。
(51)Int.Cl.(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书1页 说明书7页 附图2页CN 105194735 A 2015.12.30C N 105194735A1.一种京尼平交联脱细胞生物羊膜的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：a、制备脱细胞生物羊膜：(1)取羊膜，用甲醇-氯仿混合溶液浸泡22-24h，所述混合溶液中甲醇与氯仿的体积比为1:1～1:3，纯化水或去离子水清洗；(2)用0.5～1％(w/v)十二烷基硫酸钠溶液浸泡22～24h，纯化水或去离子水清洗；(3)用0.25～0.5％(w/v)胰蛋白酶溶液消化22～24h，纯化水或去离子水清洗；b、取步骤a制备的脱细胞生物羊膜，浸泡于浓度为0.2％～1％的京尼平溶液中，35～40℃恒温下作用0.5～72h，纯化水或去离子水清洗；c、病毒灭活，纯化水或去离子水清洗，真空冷冻干燥，即可。
组织工程心脏瓣膜构建研究:去细胞牛心包支架的制备
组织工程心脏瓣膜构建研究：去细胞牛心包支架的制备杨岷; 朱亚彬; 陆世春; 贺建胜; 束余声; 石维平; 史宏灿; 陈长志【期刊名称】《《实用临床医药杂志》》【年(卷),期】2008(000)011【摘要】目的对比去污剂-酶消化法、胰蛋白酶消化法和去氧胆酸钠法去除新鲜牛心包组织上细胞的效果和保护基质的能力,为组织工程心脏瓣膜的构建提供较满意的支架材料。
方法应用3种方法处理新鲜牛心包组织,用光学显微镜、扫描电镜观察脱细胞效果和胶原纤维、弹力纤维改变;热皱缩实验、拉力测试观察基质的物理性能变化;DNA抽提比较脱细胞前后细胞数量差异。
结果3种方法均能完全去除细胞,但是与去污剂-酶消化法比较,其它两种方法对基质破坏明显。
结论去污剂-酶消化法脱细胞效果好,且有良好的保护基质的能力。
【总页数】5页(P)【作者】杨岷; 朱亚彬; 陆世春; 贺建胜; 束余声; 石维平; 史宏灿; 陈长志【作者单位】江苏省苏北人民医院心胸外科; 上海交通大学医学院附属仁济医院心胸外科【正文语种】中文【中图分类】R318.0【相关文献】1.去细胞支架材料构建组织工程心脏瓣膜研究进展 [J], 顾春虎;刘维永2.牛心包组织工程心脏瓣膜支架脱细胞的研究 [J], 杨岷;成少飞;王学宁;叶清;王维俊;王小妹;陈长志3.人细胞外基质包被猪去细胞瓣膜支架构建的组织工程心脏瓣膜 [J], 李秋泽;徐志云;黄盛东;张宝仁;杨立信;刘晓红;袁扬;龚德军4.组织工程心脏瓣膜构建研究：去细胞牛心包支架的制备 [J], 杨岷; 朱亚彬; 陆世春; 贺建胜; 束余声; 石维平; 史宏灿; 陈长志5.去细胞猪主动脉瓣支架及兔骨髓干细胞构建组织工程心脏瓣膜的初步研究 [J], 康凯;谭震;蒋树林;谢宝栋;韩振;田伟忱因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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京尼平交联的脱细胞牛心包生物支架材料的实验研究时间：2010年03月15日16:20 来源：中国医药导报陈平，李新华，邢万红*（山西医科大学第二临床医院心胸外科，山西太原 030001）[摘要] 目的：初步探讨新型生物交联剂京尼平对脱细胞牛心包基质作为支架材料的影响及意义，为心肌组织工程心脏补片的构建提供较理想的生物支架材料。
方法：实验分为三组，A组（25块）为新鲜未脱牛心包组织，B组（25块）为脱细胞牛心包组织，C组（25块）为京尼平交联的脱细胞牛心包组织。
采用光学显微镜、扫描电镜观察脱细胞效果和胶原纤维、弹力纤维改变；以组织厚度、热皱缩温度和抗拉力测试观察基质的物理性能变化。
结果：光学显微镜、扫描电镜观察显示去污剂-酶消化法去细胞百分率达98.63%，能够有效脱除细胞，完整保留牛心包组织的胶原纤维和弹力纤维；组织厚度测试结果为，A组（3.8±1.0） mm，B组（3.8±1.2） mm，C组（4.0±1.0）mm；组织热皱缩温度测定结果为，A组（78.50±0.50）℃，B组（67.90±0.60）℃，C组（85.90±0.40）℃；组织抗拉力测试结果显示，经交联剂京尼平处理后C组最大载荷、最大应力、弹性模量、最大应变均高于A组，差异有统计学意义（P＜0.05）。
结论：经过新型生物交联剂京尼平交联的脱细胞牛心包最大载荷增加显著，可以弥补脱细胞牛心包力学性能的减少，作为较理想的心肌组织工程支架材料。
[关键词] 心肌组织工程；生物交联剂；脱细胞牛心包[中图分类号] R-33 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2010）02（c）-028-03Experimental study of genipin crosslinked acellular bovine pericardium for biological scaffold materialsCHEN Ping, LI Xinhua, XING Wanhong*(Department of Cardiothoracic Surgery, the Second Clinical Hospital of Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China)[Abstract] Objective: To investigate the impact of biological crosslinking agent genipin on the changes of acellular bovine pericardium as a scaffold matrix, for the construction of the heart patch to provide a more ideal scaffold material in myocardial tissue engineering. Methods: Three groups were divided in the experiment, fresh bovine pericardium as group A (25), acellular bovine pericardium as group B (25), genipin crosslinked acellular bovine pericardium as group C (25). The change of tissue collagen fiber and the acellular effect were observed by optical microscope and scanning electron microscopy. Tissue mechanical properties and shrinkage temperature were studied to observe changes in physical properties of the matrix. Results: Optical microscope and scanning electron microscopy showed that the acellular effect reached 98.63%, and the collagen fiber was very good preserved. Tissue thickness test results showed that group A was (3.8±1.0) mm, groupB was (3.8±1.2) mm, groupC was (4.0±1.0) mm; ti ssue shrinkage temperature test results showed that group A was(78.50±0.50)℃, group B was (67.90±0.60)℃, group C was (85.90±0.40)℃. Anti-pull test results indicated that max-load, max-stress, elastic modulus and max-straining of group C were higher than those of group A, they showed significant difference (P<0.05). Conclusion: The max-load of genipin-fixed acellular bovine pericardium increases significantly, so it can make up for the mechanical properties of acellular bovine pericardium reduction. Therefore, it should be a promising biomaterial for fabricating the scaffold of tissue-engineered heart patch.[Key words] Myocardial tissue engineering; Biological crosslinking agent; Acellular bovine pericardium心肌组织工程补片是利用组织工程学技术，将受体心肌细胞种植在生物可降解支架材料上，孵育出有活性的心脏补片，无需抗凝，无免疫原性，有自主修复能力，耐久性强。
目前用于心肌组织工程的支架材料大体分为生物支架材料和人工高分子合成支架材料两类，生物支架材料多使用脱细胞牛心包基质，其在细胞黏附及促细胞生长等方面优于人工合成的高分子材料[1]。
本研究旨在探讨去污剂-酶消化法去除新鲜牛心包组织细胞的效果和保护基质的能力，以及新型生物交联剂京尼平对脱细胞牛心包基质作为支架材料的影响及意义，为心肌组织工程心脏补片的构建提供较理想的生物支架材料。
1 材料与方法1.1实验材料新鲜成年牛心包（阳曲县养牛场提供），乙二胺四乙酸（EDTA）、曲拉通-100、抑肽酶、DNAaseⅠ、RNAase A、京尼平等试剂均为Sigma公司生产。
磷酸盐缓冲液、Tris-HCl液、D-Hanks液等自制，青霉素和链霉素购于山西医科大学。
1.2 新鲜牛心包的处理从养牛场采集新鲜成年牛心包，冰盐水保存运输，3～6 h后剔除心包表面残留的脂肪及其他结缔组织，然后4℃ D-Hanks液漂洗，随机分成三组：A组（25块）为新鲜未脱牛心包组织，B组（25块）为脱细胞牛心包组织，C组（25块）为京尼平交联的脱细胞牛心包组织；然后对B组（25块）和C组（25块）采用去污剂-酶消化法处理获得脱细胞牛心包组织。
1.3 脱细胞支架材料的实验方法①将B组（25块）和C组（25块）牛心包浸入4℃、pH 8.0且含0.05 mol/L NaCl、0.02% EDTA和100 kIU/ml抑肽酶的0.05 mol/L Tris-HCl中24 h。
②浸入4℃、pH 8.0且含1.5 mol/L NaCl、0.02% EDTA和100 kIU/ml抑肽酶的0.05 mol/L Tris-HCl中24 h。
③4℃，pH 7.4，D-Hanks液清洗。
④用4℃、pH 7.4且含1% Triton X-100、0.02% EDTA和100 kIU/ml抑肽酶的Tris-HCl浸泡24 h。
⑤4℃、pH 7.4、不含Mg2+、Ca2+的D-Hanks液清洗。
⑥37℃、pH 7.6、含DNAaseⅠ（10 mg/L）、RNAaseA（1 mg/L）、Mg2+（3 mmol/L）、Ca2+（1 mmol/L）的10 mmol/L Tris-HCl消化1～2 h。
⑦4℃、pH 7.4、含1% Triton X-100的Tris-HCl浸泡24 h。
⑧4℃、pH 7.4 D-Hanks 液浸泡48 h。
1.4 京尼平交联脱细胞牛心包组织C组（25块）采用含碘溶液[2]于37℃孵箱内作用48 h予以消毒，然后在37℃用0.625％京尼平溶液交联脱细胞的新鲜牛心包组织72 h[3]，磷酸盐缓冲液（PBS）漂洗备用。
1.5 检测项目1.5.1组织学观察将A组、B组牛心包组织各5条置入10%甲醛溶液中固定，常规石蜡包埋、切片、HE染色后在显微镜下进行组织学观察和扫描电镜观察。
去细胞百分率=（新鲜牛心包组细胞总数－去细胞组残留细胞数）/新鲜牛心包组细胞总数。
1.5.2 厚度、组织热皱缩温度测定 A组、B组和C组牛心包组织各取10片，裁成40 mm×5 mm试条，以蒸馏水为介质，从室温开始，每分钟升高2℃，应用热收缩温度测定仪和HD-10型厚度仪（精度0.01 mm）完成测试。
1.5.3机械力学测试将A、B、C组牛心包组织剪成5.0 cm×1.0 cm矩形条块各10条，两边夹于材料性能试验机（INSRON 5544材料性能试验机，太原理工大学生物力学实验室），夹持间距为15 mm。
以10 mm/min将管道壁组织向两边拉伸，记录最大载荷、最大应力、最大应变和弹性模量。
1.6 统计学分析采用SPSS 13.0统计软件进行数据处理，数据用均数±标准差（x±s）表示，组间两两比较采用t检验分析，三组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05表示差异有统计学意义。