冷冻切片protocol
冰冻切片详细说明解读
冰冻切片详细说明切片技术最早期是从冰冻切片开始，后来逐步有了发展和更新，冰冻切片弥补了石蜡切片和火棉胶切片之不足，石蜡切片和火棉胶切片需时太久，且在制片中要使用许多化学试剂，石蜡切片还需要加温过程，因而某些重要的不稳定的组织成分如脂类、酶以及抗体等，可能被溶解和破坏。
冰冻切片过程较简单，无须经过上述步骤，组织中的水分起着包埋剂的作用，组织经固定或不固定即可进行冰冻切片，切片厚度一般可在6-8微米，组织没有收缩，易保持生活时原有状态，是保存脂肪组织，许多神经组织特殊染色方法和组织化学方法，特别是酶的活性十分理想的切片方法，对于外科临床诊断和现代免疫荧光诊断，冰冻切片也很重要。
其缺点是组织过大不易冰冻，连续切片困难。
5微米以下切片不易成功。
但是随着现在冰冻包埋液的不断改进，已经能切出少于3微米的切片一、直接冰冻切片法冰冻切片多用于新鲜组织、甲醛固定组织和冰箱冷藏组织等。
组织块不经任何包埋剂而直接放在制冷台上冷却后再进行切片。
1．恒冷箱切片就是将组织在恒冷箱的切片机切片。
目前恒冷箱切片机的品种较多。
此种切片适用于科研和教学上的连续切片。
要求预先开动电源（预冷准备），配多种固定组织台，以便更换组织。
2．甲醇制冷器制冷箱为附有带导管的制冷台和制冷刀的甲醇循环装制，其冷却速度比较快，属于开放式，作一般常规冰冻切片用。
3．二氧化碳冰冻法将组织用蒸馏水洗后，放在冰冻切片机的冷冻台上，加蒸馏水少许。
打开冷冻台的二氧化碳开关，二氧化碳气体喷出，待组织出现冷霜时，将二氧化碳关闭，即可切片。
若组织冷冻过硬则切片易碎；组织冷冻硬度不足，则切片呈粥糜状，需用间歇方法继续冷却。
硬度一般在刚开始解冻时最合适，应迅速切片。
4．半导体致冷冰冻切片法将组织置半导体致冷台上，滴加少许蒸馏水，调好切片机的厚度。
先接通热器的循环流水，然后接通电源，电源的正负极切勿接反，用整流电源控制温度。
二、明胶冰冻切片法明胶包埋法一般多用于冰冻切片易破碎的组织，特别是某些有树枝状突起的组织，当其切片后投入水中时，常常引起分散，甚至发生丢失，某些间隙较多的组织，有时会因发生散乱而失去相互间的联系，可形成移位现象。
冷冻切片的报告
冷冻切片的报告引言冷冻切片技术是一种在生物学研究中常用的方法，可以使样本保持原貌并保存细胞和组织的结构。
本报告将介绍冷冻切片的步骤和原理，以及在科学研究中的应用。
步骤1. 选择适当的样本首先，需要选择适合冷冻切片的样本。
通常，新鲜的动、植物组织或细胞是理想的选择。
确保样本是新鲜的，以避免冷冻后的细胞或组织结构变化。
2. 固定样本在进行冷冻切片之前，需要对样本进行固定。
使用适当的固定剂（如甲醛或乙醇）将样本固定，以保持其细胞和组织结构的稳定。
3. 预处理样本在切片之前，需要对样本进行预处理。
这包括去除杂质、清洁和去除多余的水分。
确保样本表面干燥，以便在冷冻切片时获得更好的结果。
4. 冷冻样本将预处理后的样本放置在冷冻剂中，通常使用液氮或液氧进行冷冻。
冷冻样本可以防止细胞和组织的结构变形，并且可以保持其原貌。
5. 切片将冷冻的样本放置在切片机中，使用切片刀快速切割样本。
切片时，保持刀片和样本的温度低，以避免样本的解冻。
6. 收集切片使用显微镜玻片或其他收集介质收集切片，确保切片的完整性和准确性。
根据需要，可以用染色剂或其他标记物对切片进行染色。
7. 分析和观察最后，将切片放在显微镜下进行观察和分析。
通过观察切片的细胞和组织结构，可以获得关于样本的更多信息，并进行科学研究或诊断。
原理冷冻切片的原理是利用冷冻样本的低温和切片机的快速切割来保持样本的结构和形态。
低温冷冻可以防止细胞和组织的变形和损伤，而快速切割则可以确保样本的完整性和准确性。
应用冷冻切片技术在生物学研究和医学诊断中有广泛的应用。
以下是一些主要的应用领域：1. 组织学研究冷冻切片可以用于对组织中细胞和结构的研究。
通过观察和分析切片，可以了解组织的构成、功能和组织病理学等方面的信息。
2. 免疫组化冷冻切片可以用于免疫组化实验。
通过在切片上使用特定的抗体，可以检测和定位特定的蛋白质或细胞标志物，从而了解其在组织或细胞中的表达和分布。
3. 分子生物学研究冷冻切片可以用于分子生物学研究中的基因表达分析、蛋白质定位等实验。
冰冻切片步骤很全面
冰冻切片步骤很全面冰冻切片是一种常用的实验技术，在生物学、医学研究、组织学观察等领域有着广泛应用。
以下是一份详细的冰冻切片步骤，旨在提供全面的指导。
注意，不同的实验目的可能会有一些差异，因此请根据实际需求调整步骤。
1.準备1.1获取你所需的样本。
这个样本可以是活体动物的组织，也可以是固定处理后的组织。
1.2准备冷冻介质。
通常使用的冷冻介质包括液氮、干冰和冷冻套。
液氮是一种非常冷的液体，可以迅速冻结样本。
干冰是固态二氧化碳，可以提供较低的温度。
冷冻套是一种装置，可以通过循环冷却剂来维持全套工具的较低温度。
1.3准备工具和设备。
这些工具和设备通常包括切片机、切片模具、刀片、显微镜片和刷子。
1.4调整工作环境。
确保实验室温度适宜、空气流通，并消毒工作台和其他工具。
2.样本取样和固定2.1根据实验目的，选择合适的样本区域。
例如，在动物研究中，你可能需要选择大脑的特定区域。
2.2切下样本。
使用手术器械，例如手术剪刀和手术刀，在样本区域周围切下足够大小的组织块。
2.3快速固定样本。
使用适当的固定液将样本固定。
常用的固定液包括10%缓冲福尔马林和4%聚乙二醇。
将样本完全浸没在固定液中，确保完全固定，避免其损伤。
3.冷冻3.1冷冻样本。
将固定的样本迅速置于冷冻介质中。
如果使用液氮，直接将样本放入液氮中。
如果使用干冰，将样本放入常温下事先准备好的干冰盒中，并立即放入冷冻套中。
3.2冷冻条件。
根据样本的性质和实验要求，选择适当的冷冻条件。
通常情况下，液氮的温度低于-150°C，而干冰的温度大约为-78°C。
3.3冷冻时间。
样本的冷冻时间取决于其大小和固定液的穿透性。
通常情况下，较小的样本需要较短的冷冻时间，而较大的组织块需要较长的冷冻时间。
一般而言，冷冻时间为几个小时到几天。
4.切片4.1为切片做准备。
在切片之前，将切片模具放在切片机上，并冷却至所需的温度。
同时，将刀片插入切片机。
4.2取出样本。
免疫组化-小鼠脑切片protocol(改正)
免疫组化实验材料：需要进行观察的脑片存放位置：一抗、二抗、DAPI放在冰箱一层;山羊血清放于冰箱二层。
所用试剂：10%山羊血清；PBST（PBS+%Triton）；一抗（1:1000）；二抗（1:500）；PBS（配制方法：将一个1L的烧杯洗净晾干，称量8g NaCl， KCl, Na2HPO4, KH2PO4放至烧杯中，向烧杯中添加800ml ddwater，放在磁力搅拌器上搅拌，调PH至，后定容至1L）；DAPI（用PBS配制，1:10000）；抗荧光淬灭封片液仪器或器皿：24孔板（洗净晾干，为了便于后续操作，要将24孔板盖子和板子上画一条横线以防止盖子盖错，在盖子上划线对24孔板按照其作用（如：装有洗一抗用的PBST的孔，则标明PBST（洗一抗用））进行分区）；室温摇床实验步骤：1、封闭：将冷冻切片所得的脑片进行封闭，封闭用1ml山羊血清+9ml PBST，每孔加800微升，将脑片用玻璃钩取出放入24孔板中，放于4℃过夜。
2、封闭完成后，用玻璃钩将脑片取出放于添加了一抗（1:1000，一抗用封闭液配制）（rabbit or mouse or chicken）的24孔板中进行孵育，置于室温摇床，8h（记得计时），之后放于4℃过夜。
（一抗有两种，即单克隆抗体和多克隆抗体。
单克隆抗体特异性较强，但亲和性较弱；多克隆抗体特异性较弱，但亲和性较强）3、用一抗孵育后，将脑片用玻璃钩取出，放于添加了800微升PBST的24孔板中进行洗涤，洗3次，每次15分钟，每次洗涤后都要将脑片重新用玻璃钩取出放于添加了新的PBS的24孔板中，放于室温摇床。
4、之后，将脑片从含PBST的24孔板中取出，放入添加了二抗（1:500，一般用封闭液配）的24孔板中，放在室温摇床上孵育2h，每孔加800微升。
（二抗一般根据一抗来选择，如一抗为鼠源的，二抗就选择抗鼠的；一抗为兔源的，二抗就选择抗兔的）5、二抗孵育后，将脑片用玻璃钩取出，放于装有PBST的24孔板中洗5次，每次洗涤都要将脑片取出放于呈有新的PBST的24孔板中，每次15分钟，放于室温摇床。
oct冷冻切片流程
oct冷冻切片流程英文回答：OCT Freezing Section Protocol.Materials:Fresh tissue specimen.OCT (optimal cutting temperature) compound. Disposable cryomolds.Liquid nitrogen.Cryostat.Cryosectioning blades.Slides.Hematoxylin and eosin (H&E) stain.Procedure:Tissue Preparation:1. Trim the tissue specimen to a size suitable for cryomolding (approximately 0.5 x 0.5 x 0.5 cm).2. Embed the tissue in OCT compound in a disposable cryomold.3. Orient the tissue within the OCT so that the desired plane of section is perpendicular to the base of the mold.4. Freeze the cryomold containing the tissue in liquid nitrogen until completely solid.Sectioning:1. Secure the frozen tissue block in the cryostatchamber.2. Select the appropriate cryosectioning blade and adjust the blade angle and thickness setting.3. Section the tissue at the desired thickness (typically 5-10 um).4. Mount the sections onto glass slides.Staining:1. Fix the sections in cold acetone for 10 minutes.2. Stain the sections with hematoxylin and eosin (H&E) according to standard protocols.3. Dehydrate the sections through a graded series of ethanol solutions.4. Clear the sections in xylene and mount with a coverslip.Interpretation:Examine the stained sections under a microscope to assess the morphology and architecture of the tissue.Identify and characterize any abnormalities or pathological changes.中文回答：OCT冷冻切片流程。
冰冻切片步骤
准备材料：酒精棉滤纸枪（1ml）24孔板刀片毛刷记号笔试剂配制：4%多聚甲醛：称取40g多聚甲醛,加入温热(约60度左右)的蒸馏水约400ml，搅拌,加入少量的1N NaOH溶液，搅拌至完全溶解；加入0.2M的PBS500ml，冷却后过滤，蒸馏水定容至1000ml。
20%蔗糖溶液：20g蔗糖加0.1MPBS（PH7.4)至100ml（温水促溶）OCT包埋剂（购买）染色剂：Tris．钙缓冲液：(O．1 mol加0．018mol氯化钙)：Tris(Hydroxymethyl)methylamine 3．025 g；氯化钙0．499 g；去离子水加至250 ml；室温保存。
酸性前孵育液：(pH4．35)乙酸钠0．2 mol 9 ml，乙酸0．2 mol 21 ml，调pH至4．35；碱性前孵育液：Tris．钙缓冲液30 mL以0．1 NHCI仔细调pH至10．4；ATP酶孵育液：A TP(disodium salt)45 mg（购买）；Tris．钙缓冲液30 ml，0．1 NHCl 调pH至9．5。
注意：1.ATP酶组织化学主要使用钙激活法。
该方法沿用已久，所用的试剂配制比较繁复，尤其对pH值有严格的要求，必须精确调试试剂的pH值，并每次都要新鲜配制，以保证染色的成功。
2.前孵育液和底物孵育液应精确调节pH值，配制完成后立即用EP管分装，置一20℃保存。
3.ATP酶染色法。
可见正常骨骼肌纤维大小均匀，形状规则，排列成马赛克状。
依前孵育液pH的不同，分为不同的纤维类型。
采用碱性前孵育液(pH 10．4)时，I型肌纤维不显色。
Ⅱ型肌纤维呈深染。
采用酸性前孵育液(pH 4．5)时，深染的为I型，浅染为IIa型，介于中间染色为IIb型肌纤维。
具体操作流程：４％多聚甲醛固定过夜２０％的蔗糖过夜冰冻切片，6-8u m烘烤２小时（３７度烘箱）染色（或者－80度保存，染色前需要37度烘烤2小时）免疫组化笔在组织片周围划圈酸性孵育液200u L滴人组织片中，室温下孵育15min（或者碱性孵育液200u L滴人组织片中，碱性孵育20 min）双蒸水冲洗数次滴入ATP酶孵育液200u L，37度孵育，酸性45min，碱性30 min1％氯化钙作用3 min2％硝酸钴3min自来水快洗自来水充分冲洗，过去离子水；脱水封片。
冰冻切片法ppt课件
方法：
• 切片固定30秒－1分钟。 • 水洗。 • 染苏木素3－5分钟。 • 分化。 • 于碱水中返蓝20秒。 • 伊红染色10－20秒。 • 脱水，透明，中性树胶封固。
操作过程中常见问题与处理
标本固定应充分
• 标本经固定或不固定均可，但经过固定的组织切片冰晶少 ，细胞挤压变形小，切片完整，染色清晰，而未固定的组 织冰晶多，细胞挤压变形大，甚至会影响观察结果。因此 ，除特别需要外，一般较多采用组织固定后再行切片。固 定方法有浸入法和灌注法，浸入法主要用于活检和手术标 本，以及其它不能进行灌注的组织固定。灌注法适用于动 物实验研究。用于组织固定的固定剂种类很多，包括醛类 、非醛类、丙酮及醇类等，其中以中性缓冲液配制多种聚 甲醛较为常用2’，- 3组织固定时，一方面固定液要有足 够的量，另一方面还要保持一定时间，一般在快速灌注固 定取材后，多用相同的固定剂再固定! % " ，以使组织充分 固定，这对保持切片的完整性尤为重要。
不甚清晰, 背景模糊。 通过使用两种不同固定方法结果的比较, 我们认为 双重固定液法在冰冻切片中应用良好, 明显优于Clarke 氏单液固定法, 值得推 广应用。
合成胶水的影响
• 临床病理工作中经常遇到一些微小组织做冰冻切片,我们 体会到,异体脏器组织包埋法中的异体脏器组织存留在载 玻片上,不易擦除干净,留有背景对切片外观有影响,时有微 小组织与异体脏器组织间包埋时易产生间隙,给切片带来 不便。石蜡包埋托法往往因包埋托有一定厚度影响冷冻时 间,而且仍然需要OCT 包埋剂。合成胶水水溶性好,与组织 结合紧密,二者形成完整整体,而且冷冻后硬度相当,利于切 片,切片上的胶膜水洗后完全溶解,不会造成污染和遗留背 景色。合成胶水用量少,冷冻时间短,组织不会形成冰晶 , 因此镜检时细胞形态完整,染色清晰。合成胶水来源简便 、经济、冷冻快速。实为一种实用的替代方法。
冷冻切片protocol
冷冻切片实验材料：固定好的鼠脑试剂：30%蔗糖；包埋剂；1*PBS用品与仪器：冷冻切片机；刀片；24孔板实验步骤：（切片的地点在1楼和6楼，1楼的切片机在使用前需要预约）1、将前一天放于4%PFA中固定的鼠脑样品取出放入30%蔗糖中进行固定。
（鼠脑刚放入时会浮在液面上，放置过夜，待沉淀后可进行切片操作）2、进行切片操作之前要进行一些准备工作，首先，在24孔板（每个鼠脑大概需要2个24孔板）每个孔中加入1ml PBS，用来舒展脑片。
其次，具有自带荧光的鼠脑的切片需要使用包有锡纸的24孔板，防止其荧光淬灭3、开切片机，将CT和OT温度都调节为-20℃，切片厚度设定为40μm。
4、用包埋剂包埋底座，凝固后将底座置于切片机相应位置上，调整好底座的位置，使之与刀片平行，转动切片转轮，将底座切平，注意不要让底座的厚度太大，根据切口的情况调整切片机使之运作良好。
（注意切片的转轮要在每一次切片完成后锁定，防止切伤手指）5、沿与冠状切平行的方向将鼠脑的小脑部分切除，将剩余的脑放置在底座上（注意鼠脑的中缝线要对准底座上的豁口），底座平行放置于-20℃环境下，可看到鼠脑由底座部分向上逐渐变白。
6、待鼠脑完全变白后，向鼠脑上添加包埋剂，等待鼠脑包埋好。
（如发现部分鼠脑未包埋住或包埋不充分，需要向该部位再次添加包埋剂）7、鼠脑包埋好后，将底座上流出的多余包埋剂切除，然后将样品连同底座放至切片机上进行切片。
8、放好样品后，先按后退键，将盛放样品的基座向后放，目测使刀片不能切到样品的位置。
9、转动切片机，使样品慢慢接近刀片，继续转动切片机进行切片，直至看到嗅球部位的脑组织，清理掉嗅球之前切下的切片。
10、自嗅球开始，每10片样品切片用玻璃钩粘起，放至第一个24孔内（脑切片如果粘在孔壁上不能直接用玻璃钩刮下来，而要用孔内的PBS冲刷下来），以此类推，直至得到自己需要的样品切片为至。
11、切片过程中注意观察切片形状，可发现得到切片的先后顺序依次为：嗅球、前额叶、含有胼胝体的脑片、SVZ、SCN等。
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冷冻切片
实验材料：固定好的鼠脑
试剂：30%蔗糖；包埋剂；1*PBS
用品与仪器：冷冻切片机；刀片；24孔板
实验步骤：（切片的地点在1楼和6楼，1楼的切片机在使用前需要预约）
1、将前一天放于4%PFA中固定的鼠脑样品取出放入30%蔗糖中进行固定。
（鼠脑刚放入时会浮在液面上，放置过夜，待沉淀后可进行切片操作）
2、进行切片操作之前要进行一些准备工作，首先，在24孔板（每个鼠脑大概需要2个24孔板）每个孔中加入1ml PBS，用来舒展脑片。
其次，具有自带荧光的鼠脑的切片需要使用包有锡纸的24孔板，防止其荧光淬灭
3、开切片机，将CT和OT温度都调节为-20℃，切片厚度设定为40μm。
4、用包埋剂包埋底座，凝固后将底座置于切片机相应位置上，调整好底座的位置，使之与刀片平行，转动切片转轮，将底座切平，注意不要让底座的厚度太大，根据切口的情况调整切片机使之运作良好。
（注意切片的转轮要在每一次切片完成后锁定，防止切伤手指）
5、沿与冠状切平行的方向将鼠脑的小脑部分切除，将剩余的脑放置在底座上（注意鼠脑的中缝线要对准底座上的豁口），底座平行放置于-20℃环境下，可看到鼠脑由底座部分向上逐渐变白。
6、待鼠脑完全变白后，向鼠脑上添加包埋剂，等待鼠脑包埋好。
（如发现部分鼠脑未包埋住或包埋不充分，需要向该部位再次添加包埋剂）
7、鼠脑包埋好后，将底座上流出的多余包埋剂切除，然后将样品连同底座放至切片机上进行切片。
8、放好样品后，先按后退键，将盛放样品的基座向后放，目测使刀片不能切到样品的位置。
9、转动切片机，使样品慢慢接近刀片，继续转动切片机进行切片，直至看到嗅球部位的脑组织，清理掉嗅球之前切下的切片。
10、自嗅球开始，每10片样品切片用玻璃钩粘起，放至第一个24孔内（脑切片如果粘在孔壁上不能直接用玻璃钩刮下来，而要用孔内的PBS冲刷下来），以此类推，直至得到自己需要的样品切片为至。
11、切片过程中注意观察切片形状，可发现得到切片的先后顺序依次为：嗅球、前额叶、含有胼胝体的脑片、SVZ、SCN等。
12、切片过程中要注意速度要均匀，不能太快也不能太慢，否则有可能使脑切片损伤。
13、切片结束后，将24孔板盖好（包好锡纸），清理干净切片机内部，将CT打开，OT关闭，锁定切片机，在切片机使用记录本上登记使用记录。