褪黑素减轻对乙酰氨基酚的急性肝脏毒性_梁英丽

△
肝脏系数（ % ） 0． 05 ± 0． 00 0． 05 ± 0． 00 0． 09 ± 0． 01 ＊＊ 0． 08 ± 0． 02 P ＜ 0. 05
ALT（ IU / L） 9． 8 ± 2． 86 19． 9 ± 7． 93 490． 5 ± 459． 60 * 23． 6 ± 4． 31 △
2． 3
MT 对 APAP 诱导的 3NT 表达的影响 免 APAP 组小鼠肝脏肝窦周围 疫组织化学结果显示，
5 μm， 常规脱蜡至水， 用 0. 3% H2 O2 进行细胞通透 和封闭内源性过氧化物酶； 放入 0. 01 mol / L 柠檬酸 钠缓冲液（ pH 6. 0 ） 中， 微波对抗原修复； 用 5% 的羊 37℃ 孵育 30 min； 3NT 血清来封闭非特异性蛋白， 37℃ 恒温箱中孵育 30 min， 一抗孵育， 再置 4℃ 冰箱 过夜， 第 2 天再放入 37℃ 恒温箱中孵育 30 min； 二 置 37 ℃ 恒温箱中 30 min； 再进行 SP 反应， 抗孵育， DAB 显色， 经复染、 脱水、 透明、 封片。 用光学显微 NT 表达水平。 镜（ × 200 ） 观察各个视野 31． 3． 5 Western blot 检测 pJNK 蛋白表达 取一定 量的肝脏组织制备成 20% 的匀浆液， 分离上清， 再
文献标志码 A 文章编号 1000 － 1492 （ 2013 ） 02 － 0138 － 04
有限公司； 其他试剂均购于美国 Sigma 公司。 1 ． 2 实验动物 雄性 ICR 小鼠（ 7 周龄， 26 ～ 27 g， 清洁级 ） 购 于 安 徽 医 科 大 学 实 验 动 物 中 心。 实 验 前， 自由饮食、 饮水， 维持 12 h 光照和 12 h 黑暗的昼 夜节律， 温度 20 ～ 25℃ ， 相对湿度（ 50 ± 5 ） % 的环境 各组小鼠均自由进食标准饲料。 下适应性喂养 1 周， 1 ． 3 方法 1． 3． 1 动物分组和处理 36 只雄性 ICR 小鼠随机 MT 组、 APAP 组和 APAP + MT 分为对照 （ CON ） 组、
一种神经激素， 其对机体的作用广泛， 分泌有明显的 ［5 ］ 。 ， MT 昼夜节律性 有研究 表明 在炎症免疫的调节
2012 － 09 － 27 接收 基金项目： 国家自然科学基金 （ 编号： 30371667、30572223、30973544、 81001480 ） 作者单位： 安徽医科大学公共卫生学院毒理学教研室 ， 合肥 230032 作者简介： 梁英丽， 女， 硕士研究生； Email： xudex@ 徐德祥， 男， 教授， 博士生导师， 责任作者， 126． com
· 138· ◇预防医学研究◇
安徽医科大学学报
Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2013 Feb； 48 （ 2 ）
褪黑素减轻对乙酰氨基酚的急性肝脏毒性
梁英丽， 章叶发， 张
摘要 目的 探讨褪黑素 （ MT ） 对对乙酰氨基酚 （ APAP ） 引 雄性 ICR 成年健康
1． 3． 3
r / min 离心 10 min 后取上清， 上清液与 20% 三氯乙 6 790 r / min 离心 10 min， 酸按2 ∶ 1 混匀， 取上清液， 用 Griess 法检测肝脏 GSH 含量。niversitatis Medicinalis Anhui 2013 Feb； 48 （ 2 ）
程， 徐德祥
起的急性肝脏毒性的保护作用 。 方法
和镇痛中发挥着重要作用， 且有明显的昼夜节律性。 MT 具有镇静、 调整时差、 抗氧化、 免疫增强、 抗肿瘤 等作用 。已有研究［7 － 8］ 显示， MT 可改善缺血再 灌注诱导的肝细胞凋亡和坏死。 该研究主要探讨
［6 ］
MT 组、 APAP 组和 APAP + MT 小鼠随机分为对照（ CON） 组、 组。APAP 组经腹腔注射 APAP （ 300 mg / kg ） ； APAP + MT 组 5、 20 mg / kg） ， 30 min 后 经腹腔注射给予不同剂量 MT（ 1. 25 、 再经腹腔注射 APAP。APAP 处理 4 h 后取血清测血液生化 指标丙氨酸转氨酶（ ALT） ， 用免疫组化法检测肝脏 3硝基酪 NT） 水平， 氨酸（ 3用蛋白印迹法测肝脏 JNK 磷酸化水平。 结果 APAP 组肝脏系数和 ALT 水平显著 与 CON 组比较，
图1
NT 的表达 肝脏组织中 3-
SP × 200
A： CON 组； B： MT 组； C： APAP 组； D： APAP + MT 组
2． 4
由 2 ， CON ， APAP JNK 图 可知 与 组比较 组 磷酸化水 平明显升高（ P ＜ 0. 01 ） ； 低剂量 MT（ 1. 25 mg / kg ） 对 APAP 诱导的 JNK 磷酸化无明显影响， 高剂量 MT （ 5、 20 mg / kg ） 明显抑制 APAP 诱导的 JNK 磷酸化 （ P ＜ 0. 01 ） 。
APAP） 又名扑热 对乙酰氨基酚（ acetaminophen， 是最常用的解热镇痛药。 在治疗剂量时疗效 息痛， 显著， 用药安全。但在过量或特殊情况下 （ 如饮酒、 饥饿、 合用某种药物等 ） 会对机体的肝脏造成严重 。 APAP 之所以造成肝损伤 主要由于其在体内被细胞色素 P450 （ CYP450 ） 系统 （ 主要是 CYP2E1 ） 代谢生成有毒性的乙酰苯醌亚胺 （ Nacetylpbenzoquinone imine，NAPQI ） 。 过 量 服 用 APAP 会产生大量 NAPQI， 导致肝脏还原性谷胱 甘肽 （ glutathion，GSH ） 储备耗竭， 肝脏清除 NAPQI
［3 － 4 ］ 。 的能力下降， 进一步导致肝细胞受到损害 褪黑素（ melatonin，MT ） 是由人松果腺分泌的
的损伤， 甚至死亡
［1 － 2 ］
组。所 有 动 物 禁 食 12 h。 APAP 组 经 腹 腔 注 射 APAP（ 300 mg / kg） ； APAP + MT 组经腹腔注射给予 5、 20 mg / kg ） ， 30 min 后再经腹 不同剂量 MT （ 1. 25 、 腔注射 APAP。APAP 处理 4 h 后剖杀， 取眼血用来 测血液生化指标， 剪取部分肝脏组织用来做病理切 片， 其余肝脏组织放入 － 80 ℃ 冰箱中保存。 1． 3． 2 血清生化指标检测 眼球取小鼠血液， 血液 3 500 r / min 离心 15 min， 样品静置室温 2 h 后， 取上 清液用 ALT 试剂盒测定血清 ALT 活性。 肝脏组织 GSH 含量检测 取小鼠肝脏组织 4 730 制成 20% 的匀浆液， 用 0. 85% 生理盐水匀浆，
MT 对 APAP 引起的 JNK 磷酸化的影响
3
讨论
P＜ 肝脏系数和 ALT 水平 均 明 显 升 高 （ P ＜ 0. 01 ， 0. 01 ， P ＜ 0. 05 ） 。 MT 预处理降低 APAP 引起的肝 重和肝脏系数增加， 但差异无统计学意义。 进一步 MT 预处理明显对抗 APAP 引起的 ALT 观察发现， 水平升高（ P ＜ 0. 05 ） 。 2． 2 MT 对肝脏 GSH 含量的影响 由表 1 可知，
APAP 和 MT 均购于美国 Sigma 公 司； 丙氨酸转氨酶 （ ALT ） 试剂盒购于南京建成生物 NT） 和磷酸 工程研究所； 抗小鼠的 3硝基酪氨酸 （ 3化氨基 末 端 激 酶 （ pJNK ） 多 克 隆 抗 体 均 购 于 美 国 Santa Cruz 公司； SP 免疫组化试剂盒和 DAB 显色试 剂盒购于北京中山金桥生物公司； ECL 发光液购于 美国 Thermo Scientific 公司； 无水乙醇（ 分析醇， 纯度 ＞ 99. 7% ， 批号： 20100118 ） 购于上海振企化学试剂
· 139·
表1 组别 CON MT APAP APAP + MT 体重（ g） 23． 30 ± 0． 34 23． 25 ± 0． 06 23． 45 ± 0． 63 23． 40 ± 0． 42
珋 x ± s） 肝脏系数和肝功能的生化指标检测（ n = 6 ， 肝重（ g） 1． 13 ± 0． 10 1． 17 ± 0． 04 2． 20 ± 0． 18 ＊＊ 1． 77 ± 0． 35
GSH（ nmol / mg） 18． 3 ± 3． 37 22． 1 ± 5． 74 3． 3 ± 0． 70 ＊＊ 6． 4 ± 0． 833
＊＊ P ＜ 0. 01 ； 与 APAP 组比较： 与 CON 组比较： * P ＜ 0. 05 ，
1． 3． 4
NT 的表达 肝脏组 免疫组织化学法检测 3织用 4% 的多聚甲醛浸泡， 再进行石蜡切片， 切片厚
APAP 引起小鼠急性肝损伤， 本研究显示， 表现 、 为肝脏明显充血和水肿 肝脏重量和肝脏系数增加 和血清 ALT 水平的显著升高。MT 预处理可显著减 轻 APAP 引起的急性肝损伤。这些研究结果与相关 ［9 － 10 ］ 。 在 正 常 情 况 下， 文献 报 道 一 致 绝大部分 APAP 和葡萄糖醛酸及硫酸结合而解毒， 只有小部 治疗剂量 分的 APAP 经代谢生成有毒性的 NAPQI， 下GSH 与 NAPQI 结 合 而 达 到 解 毒 的 作 用， 但过量 的 APAP 会生成大量的自 由 基 NAPQI， 最终导致肝
化的抑制效应。 参考文献
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