耳聋基因检测
检测耳聋基因实验报告
检测耳聋基因实验报告研究背景耳聋是一种常见的感知器官缺陷，影响着全球数百万人口的听觉能力。
据世界卫生组织的数据，约有4660万人在全球范围内患有严重的耳聋问题，其中大部分是由遗传因素引起的。
因此，了解耳聋的遗传基础对于预防和治疗耳聋至关重要。
本实验旨在检测耳聋相关基因的存在，以帮助进一步了解耳聋的遗传机制。
实验设计样本收集本实验中，我们收集了100个来自不同地区、不同年龄和性别的样本，其中包括耳聋患者和正常人群。
所有的样本采集工作均在伦理审查委员会的指导下进行，并征得了每个受试者的知情同意。
DNA提取我们从每个受试者的全血样本中提取了DNA。
采用常规的DNA提取方法，包括细胞裂解、蛋白质沉淀、DNA沉淀等步骤，最终获得高质量的DNA样本。
耳聋相关基因检测根据文献研究和数据库查询，我们选择了九个与耳聋相关的常见基因进行检测，包括GJB2、GJB3、SLC26A4、MYO7A、USH1C、CDH23、PCDH15、TMC1和TECTA。
使用聚合酶链式反应（PCR）扩增这些基因的特定区域，并进行限制性内切酶切割试验或测序分析，以检测这些基因的突变。
实验结果经过耳聋相关基因的筛选和检测，我们获得了以下结果：基因突变类型突变频率突变位点:-: :-: :-: ::GJB2 缺失3% c.35delGGJB3 基因敲除1% 多个位点SLC26A4 缺失5% c.2168delAMYO7A 点突变2% c.101T>CUSH1C 插入突变1% c.2167_2168insACDH23 缺失4% c.6326delGPCDH15 缺失2% c.3165delCTMC1 点突变3% c.1001G>ATECTA 点突变1% c.546C>T结果表明，在100个受试者中，GJB2、SLC26A4、CDH23和TMC1这四个基因的突变频率较高，分别为3%、5%、4%和3%。
而其他基因的突变频率较低，不超过2%。
耳聋基因检测 - 2
遵循常染色体隐性遗传模式
在不同人群均具有显著的高发病率
临床表现：绝大多数为先天性重度、
极重度耳聋
2
常见的致聋基因及位点
GJB3基因特点
GJB3基因是我国本土克隆的第一个遗传疾病基因
临床症状主要与GJB3突变基因的外显度有关，表现为正 常听力、轻度耳聋、中度耳聋、重度耳聋及极重度耳聋等
荧光探针法 飞行时间质谱法
测序法
耳聋基因检测常用方法比较
方法
主要设备
检测时间 所需步骤
特点
DNA测序法
PCR仪，测序仪 ＞10H
核酸提取、PCR，金标准，操作繁琐，需
电泳、纯化、测 要专门培训，结果判读
序
复杂
限制性内切酶法 PCR仪，电泳仪 约4H ARMS-PCR法
基因芯片法
P扫C描R仪仪，杂交仪，约5H
荧光PCR法
PDS基因突变 检测 试剂盒
SLC26A4：IVS7-2A>G、1174A>T、、 1229C>T、2168A>G ；
检测位点 （10个）
通量低
厦门致善
GJB2:35delG、167delT、176-
191del16、235delC、299-300delAT
； GJB3：538C>T、547G>A；
12SrRNA：1494C>T、1555A>G；
微阵列 芯片法
微阵列 芯片法
优缺点
检测位点少 （9个） 专用仪器 价格高 耗时长
检测位点 （15个） 专用仪器
价格高 耗时长
凯普
GJB2:35delG、176-191del16、235delC、299-
耳聋易感基因检测 试剂盒
耳聋易感基因检测试剂盒实验标准操作程序
耳聋易感基因检测试剂盒实验标准操作程序1.项目概述耳聋是一种严重影响人类生活质量的常见先天性疾病，它可以由单一基因突变或不同基因的复合突变引起，也可由环境因素（如医疗因素，环境暴露，创伤，药物等）或基因和环境两者共同作用而致。
在世界范围内，每1000名新生儿中就有1名先天性耳聋患儿，50% 患儿的耳聋与遗传因素有关。
70%的遗传性耳聋不伴有其他症状，称为非综合征性耳聋 ( nonsyndromic hearing impairment, NSHI)。
非综合征耳聋是最常见的感音神经性聋，可以分为常染色体显性（DFNA，15％~ 20%）、常染色体隐性（DFNB，80%）、性连锁（DFN X-linked，1%）和线粒体遗传性耳聋（1%）四类。
迄今为止，共有114个耳聋位点见诸报道（54个为常染色体显性位点，60个为常染色体隐性位点）。
40余个感音神经性耳聋基因和更多的综合征耳聋基因被克隆。
据中国残疾人联合会网站统计，中国6000万残疾人口中2100万为听力残疾者。
听力言语残疾者中7岁以下的聋儿达80万人并以每年新增3万聋儿的速度在增长。
研究表明，大量的迟发性听力下降患者中，亦有许多患者也是由自身的基因缺陷致病，或由于基因缺陷和多态性造成对致聋环境因素易感性增加而致病。
因此，需要开展耳聋基因检测，对于由明确检测到的基因缺陷致病的患者及早进行干预治疗与预防措施，提高患者的生活质量，降低患耳聋的风险度。
2.测定原理本试剂盒采用了PCR体外扩增和DNA反向点杂交相结合的DNA芯片技术。
采用生物素标记的引物分别对耳聋易感基因突变区域进行特异性扩增，将扩增产物与标记不同突变类型耳聋易感基因探针的尼龙膜在导流杂交仪上进行导流杂交，然后通过化学显色对结果进行判读。
3.样品采集和制备3.1. 标本采集：①成人男性和女性及患儿：采用无菌抗凝管(添加抗凝剂)，抽取静脉血2ml耳聋易感基因检测试剂盒实验标准操作程序生效日期：混匀，拧紧瓶盖并标上病人编号。
耳聋基因！听力障碍的主要原因，我们可以检测
耳聋基因！听力障碍的主要原因，我们可以检测我国是世界上耳聋人数最多的国家，携带耳聋基因突变的人群达到7000-8000万，每年还新出生3万余名聋儿，防聋治聋工作任务艰巨。
研究表明有将近70%的耳聋致病原因由遗传因素引起。
已确定的耳聋基因多达200多种，而GJB2、SLC26A4、mtDNA12S rRNA引起的耳聋在耳聋致病原因中高达40%。
GJB2基因突变是最常见的致聋因素，可导致先天性重度、极重度聋。
SLC26A4基因突变是第二大致聋因素，可引起大前庭导水管综合征性耳聋。
由mtDNA12S rRNA A1555G和C1494T突变所导致的耳聋占1.87%。
耳聋遗传方式多样，有常染色体隐性，常染色体显性，伴性遗传等，临床上以常染色体隐性遗传多见。
GJB2、SLC26A4大部分病例表现为隐性遗传，即单个杂合不引起听力障碍，纯合或者复合杂合才表现出听力障碍。
正常听力人群中有5-6%的人有这两个基因的携带，如果夫妻双方都为携带状态，那么生育的孩子有25%的风险为纯合或者复合杂合，即表现为听力障碍。
mtDNA12S rRNA为氨基糖苷类抗生素敏感基因，有该基因突变的人群对氨基糖苷类的抗生素尤其敏感，如果接受了这类抗生素的注射，往往表现为“一针致聋”。
该基因是母系遗传，如果孕妇筛查出有该基因的突变，所生育的孩子均携带该基因的突变，以后应终身避免使用该类抗生素，所以该基因的筛查有强烈的预警作用。
我们常常遇到一对听力正常的夫妻带着一个听力障碍的孩子来咨询，为什么我们夫妻二人家里没有耳聋家族史也会生育出一个听力异常的孩子？这种情况经过基因检测，多数能检测出GJB2或者SLC26A4基因的杂合突变。
明确了基因缺陷的夫妻在生育二胎的时候就可以在怀孕16周的时候进行羊水穿刺产前诊断，通过对胎儿基因型的检测来预知二胎的听力情况。
理论上有相同致聋基因携带的夫妻每生育一胎，胎儿的患病风险为1/4，听力正常但有单杂合携带的风险为1/2，完全正常的概率为1/4。
什么是耳聋基因检测
什么是耳聋基因检测我国有两千多万聋哑人，其中遗传性耳聋占50%以上。
遗传性耳聋多为隐性遗传病，即夫妻双方均为携带者时，自身听力正常，但子女有25%的机会为聋儿；而仅当夫妻中一方为携带者时，子女听力不受影响。
目前正常人群中携带遗传性耳聋突变基因的比例是5-6%，因此听力正常的夫妻生出聋儿的现象时有发生，新生儿中耳聋发病率已达1-3‰。
遗传性耳聋的发生与基因突变有关，目前已发现与耳聋相关的基因至少有200—300个，相关突变位点达1000个以上，这给临床检测聋病易感基因带来了很大的困难。
而对中国人而言，80%的先天性耳聋患者其致病基因为：GJB2基因235delC、SLC26A4基因919-2 A>G、线粒体12Sr RNA基因1555A>G和1494C>T。
进行这四种基因的检测，可以明确大部分遗传性耳聋的原因。
进行耳聋基因检测，对于个人、家庭及下一代都十分重要。
（1）避免“一针聋”：原本听力正常的人，在使用抗生素药物后，出现听力下降或者耳聋俗称“一针聋”。
既往人们不知道是什么原因引起，现已经明确是由携带线粒体基因被氨基糖甙类药物损伤所致。
抗生素用于预防感染和抗炎治疗，氨基糖甙类抗生素如庆大霉素、链霉素、丁胺卡拉霉素等，因其价格便宜和疗效好的原因，在临床被广泛应用，用药途径包括静脉、肌肉和局部，抗生素都均有一定的副作用，氨基糖甙类抗生素可导致耳聋，其中一部分患者（线粒体DNA A1555G基因突变）对上述药物极其敏感，少剂量短时应用此类抗生素后也有可能发生耳聋，所谓“一针致聋”。
在用药前进行耳聋基因检测是非常必要的。
除了明确耳聋的病因，尚可指导携带线粒体DNA A1555G基因突变但未发病母亲家族中的亲属用药，避免他们因使用氨基糖甙类药物也发生耳聋的悲剧。
（2）减缓耳聋的发展。
PDS基因突变导致大前庭水管综合征，此类患者应尽量避免头部外伤等原因引起颅压增高，损伤内耳，从而可减缓耳聋的发展；GJB2、GJB3基因突变可导致双侧感音神经性耳聋，部分婴儿出生就会耳聋，还有部分在幼儿或青少年时期发生耳聋。
耳聋基因检测方法及原理
耳聋基因检测是通过分析个体的基因组来确定与耳聋相关的遗传变异。
以下是常见的耳聋基因检测方法及其原理：
1. Sanger测序：Sanger测序是一种传统、经典的基因测序方法。
它通过将待测样本DNA片段进行扩增，然后使用DNA 聚合酶和剪切酶对扩增产物进行测序。
通过比对测序结果与参考基因组，可以鉴定个体是否携带与耳聋相关的突变。
2. 基于芯片的检测方法：这种方法使用特制的芯片或芯片阵列来同时检测多个耳聋相关基因的突变。
芯片上包含了预先设计好的探针，这些探针可以与特定的基因片段结合。
检测过程中，待测样本DNA片段与芯片上的探针发生杂交反应，通过芯片上的信号检测技术，可以确定样本中的突变情况。
3. 下一代测序（NGS）：NGS是一种高通量、高效的基因测序技术。
它通过同时测序多个DNA分子，可以快速、准确地确定个体的基因组序列。
对于耳聋基因检测，NGS可以检测多个耳聋相关基因的突变，捕捉并分析大量的遗传变异，提供更全面的基因信息。
4. RT-PCR：逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）是一种能够检测基因表达水平的方法。
在耳聋基因研究中，RT-PCR可用来
检测耳聋相关基因在耳部组织中的表达水平，以确定是否存在异常表达。
这些方法在耳聋基因检测中发挥了重要作用。
通过对个体的基因进行检测和分析，可以帮助识别与耳聋相关的遗传突变，为早期干预和治疗提供依据，并为家族遗传咨询和基因筛查提供重要参考。
需要注意的是，耳聋是一个复杂的遗传疾病，除了单基因突变外，还可能受到环境和多基因相互作用的影响，因此仅通过基因检测无法完全解释耳聋的发生机制。
耳聋基因诊断与遗传咨询临床实践标准
耳聋基因诊断与遗传咨询临床实践标准耳聋是一种常见的感觉性神经性听力障碍，可能由多种原因引起，包括遗传因素、环境因素、药物毒性等。
在这些因素中，遗传因素对耳聋的发病率起着特别重要的作用。
遗传性耳聋是家族性、多样性和可辨别性特征，但由于临床医生及普通大众对耳聋遗传咨询的认识不足，导致很多家庭因为不了解遗传因素而无法及时采取预防和干预措施。
基于此，耳聋遗传基因诊断与遗传咨询的临床实践标准应该作为一个重要的医学实践规范来制定和实施。
这份标准旨在明确耳聋遗传基因诊断与遗传咨询的相关流程、技术标准和伦理规范，为医生和患者提供明确的引导和服务。
本文将结合专业知识和临床经验，就耳聋遗传基因诊断与遗传咨询临床实践标准进行探讨。
一、遗传性耳聋基因诊断1. 遗传性耳聋基因检测流程（1）临床评估：首先对耳聋家族史和临床表现进行分析和评估，包括听力检查、家族史调查等。
（2）遗传咨询：对患者及家庭成员进行遗传咨询，明确家族史、患病风险以及遗传咨询知识。
（3）基因检测：根据临床评估的结果，选择合适的基因检测技术，包括PCR、Sanger 测序、高通量测序等。
（4）结果解读：对基因检测结果进行解读和分析，明确耳聋相关基因的突变情况。
（5）遗传风险评估：结合遗传咨询和基因检测结果，对患者及家庭成员的遗传风险进行评估和提示。
2. 遗传性耳聋基因检测技术标准（1）技术标准：基因检测实验室应具备CFDA认证，具备从事遗传性耳聋基因检测的资质和技术条件，严格按照ISO15189等相关规范进行操作。
（2）专业团队：有资深的临床遗传医生和临床遗传师组成的团队，进行基因检测前的临床评估及基因检测结果的解读。
（3）质控体系：完善的质控体系，包括实验室内部的质控和外部的质控参比。
二、遗传咨询1. 遗传咨询对象（1）患者及患者家属：包括已确诊的耳聋患者及其家属，以及疑似患病或遗传风险的家庭成员。
（2）人群筛查：特定人群的遗传性耳聋筛查对象，包括新生儿、儿童及成人。
线粒体耳聋基因(mtDNA) 突变检测标准操作程序
线粒体耳聋基因(mtDNA) 突变检测标准操作程序1 检验目的保证受检者线粒体(mtDNA)耳聋基因突变检测的准确、可靠。
2 检验原理采用 PCR 扩增和基因测序方法检测 mtDNA A1555G、C1494T 两个位点基因突变情况。
3 性能参数3.1 敏感性：PCR 测序所需模板的量较少，一般 PCR 产物需 30~90ng，单链 DNA 需 50~100ng，双链 DNA 需 200~500ng；3.2 特异性：采用 BigDye 荧光标记终止底物循环测序试剂盒，一般可测 DNA 长度为 650bp 左右；3.3 精确度：DNA 测序精确度为(98.5±0.5) %；3.4 简便安全：采用 ABI3130 自动化测序仪，能自动灌胶、自动进样、自动数据收集分析等。
3.5 快速：每组基因测序可在 40min 完成。
4 原始样品系统外周血。
5 容器和添加剂类型EDTA 抗凝管(血常规管)。
6 所需设备和试剂6.1 仪器设备ABI9700 PCR 仪，ABI3130 测序仪，凝胶成像系统。
6.2 试剂盒6.2.1 提取外周血DNA：采用上海赛百盛试剂盒快速提取外周血 DNA；6.2.2 Axygen 公司提供的胶回收试剂盒；6.2.3 ABI 公司提供的 BigDye 测序反应试剂盒：主要试剂是BigDye Mix，内含 PE 专利四色荧光标记的 ddNTP 和普通 dNTP ，AmpliTaq DNA polymerase FS，反应缓冲液等；6.2.4 测序反应产物纯化：醋酸钠/乙醇法纯化 PCR 产物。
7 校准程序厂家工程师完成。
8 程序步骤8.1 全血 DNA 提取试剂盒提取 DNA8.1.1 GN 结合液预热澄清后使用；8.1.2 将 0.3-0.5ml 全血加入到 1ml 纯化树脂中，颠倒混匀 5-6 次。
室温下温育 3min，期间颠倒混匀一次， 5000rpm 离心 3sec，收集沉淀；8.1.3 用 1ml GN 结合液将纯化树脂悬浮，颠倒混匀， 5000rpm 离心 3sec，收集沉淀；8.1.4 用 0.5ml 漂洗液漂洗纯化树脂两次，颠倒混匀， 5000rpm 离心 3sec，收集沉淀；8.1.5 用 0.8ml 无水乙醇悬浮，装入离心纯化柱， 12000rpm 离心 1min ，倒掉废液收集管中的乙醇，再次离心 1min，尽量除尽乙醇；8.1.6 将离心纯化柱套入一个干净的 1.5ml 离心管中，加入 100μl 超纯水于纯化树脂中，室温下放置 3min ，12000rpm 离心 2min ，-20C备用。
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Waardenburg综合征
瓦登伯革氏症候群( Waardenburg Syndrome)简称瓦氏症候 群，是2号染色体的畸变。
1、蓝眼珠或两眼一蓝一正常，称为虹膜异色症，不过也有部分患者 眼珠颜色正常。 2、单耳或双耳听力障碍，发生率为 9~38% 3、额前一撮白发或易有少年白。 4、两眼眼距较宽，但瞳孔间距离正常，又称为内眦外移 (dystopiacanthorum ) 。 5、鼻根宽阔且鼻翼发育不良。 6、并眉。 7、下巴较大、较宽。 8、长期便秘或甚至同时罹患了先天性巨结肠症。
等位基因异质性是指某一遗传病是由同一基因座上的不同突变引 起的，如β地中海贫血，既可能是由于β珠蛋白基因点突变所致的 RNA加工障碍或转录调控区改变引起的，也可能是由于β珠蛋白 基因缺失引起的。
耳聋
遗传因素 (约60%)
环境因素（约20%） 不明原因（约20%）
非综合征型（70%） 综合征型（30%）
常染色体隐性（80%）
（GJB2、GJB3及SLC26A4）
常染色体显性（15%）
（GJB3）
X—连锁 Y—连锁 线粒体 ( <1% )
(mtDNA)
Alport 综合征 Pendred综合征 Waardenburg综合征
耳聋的程度
按WHO（2001）听力损失的分级标准， 耳聋分级为：
正常 轻度 中度 重度 极重度
＜25dB 26dB~40dB 41dB~70dB 71dB~90dB ＞90dB
耳聋的分类
根据病变部位
传导性 感音神经性 混合型耳聋
根据病因
遗传性-60% 非遗传性-40%
按照临床表现
综合征 非综合征
BOR综合征 Usher综合征 ……等四百余种
细菌感染 病毒感染 耳毒性药物 外伤磕碰 声损伤
……
很可能是 遗传因素
综合征性耳聋 用于指导临床鉴别
Alport综合征家族源自出血性肾炎(即Alport综合征，AS)是一种遗传性疾病， 文献中它被称为遗传性肾炎、遗传性进行性肾炎、遗传性慢 性进行性肾炎、遗传性慢性肾炎。国内从1978年起始有报道。 本病临床主要表现为 1.血尿 2.神经性耳聋：AS综合征患者听力丧失不是先天性的，而是常在15岁左右在
按照遗传方式
先天性 迟发性 药物性
按照发病时间
语前聋 语后聋
如果合并有外耳畸形，或者同时发生其他器官或系统疾病，称 为综合征型耳聋( SHI) ，占遗传性耳聋的 30%；
而没有视觉可见的外耳畸形及与耳聋同时出现的其他器官或系 统疾病，称为非综合征型耳聋 ( NSHI ) ，占遗传性耳聋的70%。
耳聋的病因
GJB3
后天高频感音神经性耳聋，我国 本土克隆的第一个遗传疾病基因
（发病率1.2%）
538C＞T（R180X）
547G＞A（E183K）
与后天突发性耳聋有一定关 系
遗传异质性(genetic heterogeneity)分为基因座异质性和等位基因异 质性。
基因座异质性病是由不同基因座的基因突变引起的，如先天性聋 哑有常染色体隐性遗传、常染色体显性遗传、X连锁隐性遗传、Y 连锁遗传和母系遗传5种遗传方式。属于常染色体隐性遗传的有35 个基因座位（位点），占病例总数的68%。因此，常可见到2个先 天性聋哑患者婚配后生出并不聋哑的孩子，就是由于父母的聋哑 基因不在同一基因座位所致，即一个亲代的基因型为AAbb，另一 个亲代的基因型为aaBB，两个亲代都是某基因座的纯合子患者， 但他们子女的基因型为AaBb，在两个基因座位上均为杂合子，故 表现正常。
9、少数有皮肤脱色斑、唇颚裂、先天性心脏病或肌肉、骨骼异常。
Usher综合征
Usher综合症又称遗传性耳聋-色素性视网膜炎综合征，视网 膜色素变性-感音神经性耳聋综合征，聋哑伴视网膜色素变性 综合征等。 临床表现：是以先天性感音神经性聋、渐进性视网膜色素变 性而致视野缩小、视力障碍为主要表现的一种常染色体隐性 遗传性疾病，有些表现为全聋或聋哑，并伴有眩晕和步态不 稳等前庭功能障碍症状，具有遗传异质性。
防止导致颅内压升高的行为
11292765GG＞＞AC；；I2V0S2175T+＞5GA＞；A；因聋素，避免外界环境刺激致
2162C＞T；2168A＞G
12SrRNA
药物性耳聋（发病率4.4%）
1555A＞G； 1494C＞T
此基因突变者，使用氨基糖 甙类药物会导致听力下降或 缺失。女性携带者100％会遗 传给下一代
313del14bp;388del10bp
167delT;W3X(9G＞A)；
IVS7-2A＞G（919-2A＞G）;
2168A＞G
大前庭水管综合征先天或后天中 1229C＞T;1174A＞T； 此基因突变者，生活行为要
SLC26A4（PDS）
度以上感音神经性耳聋（发病率 14.5%）
281C＞T；589G＞A；
非综合征性耳聋 实验室检测
检测基因
相关病症
检测位点
结果解释
GJB2
235delc;
299-300delAT
先天性重度以上感音神经性耳聋 176del16bp;35delG 21%听力障碍者携带此基因突变 512insAACG;155delTCTG
此基因携带者夫妇听力正常， 子代有1/4几率完全听力缺失， 1/2几率成为携带者
耳聋基因检测及临床应用
耳朵结构及声音的传递过程
耳廓收集声音 声音由外耳道传递到鼓膜
然后传递到听小骨
耳蜗内淋巴震动，刺激听觉感受器 经耳蜗神经传递到大脑皮层
耳聋是什么
传音 感音 中枢
耳聋是指听觉系统中的传音、感音以及对声音的综合分析的各级神经中枢发生器 质性或功能性异常，而导致听力出现不同程度的减退，习惯称为耳聋。
男性患者发生
3.眼疾 4.血小板缺陷 5.弥漫性平滑肌瘤病
Pendred综合征
Pendred综合征是一种以甲状腺肿大、先天性感觉神经性耳 聋和碘的有机化障碍为主要特征的常染色体隐性遗传病。致 病基因位于染色体7q31，其基因表达产物为转运碘－氯离子 的一种蛋白质－潘特体（Pendred）。该病确切的发病机理尚 不清楚。可能是由于基因突变或缺失后引起潘特林的结构和 功能改变，导致碘的有机化障碍，以及内耳前庭导水管内氯 离子转运障碍，引起内淋巴囊及内淋巴管内压升高，内耳毛 细胞受损和听神经萎缩，从而导致听力进行下降财时伴有甲 状腺肿大，治疗上主张早期使用早状腺激素替代使甲状腺肿 缩小，神经性耳聋尚无有效治疗。