电转化条件对大肠杆菌TG1转化效率的影响
高效TG1电转感受态 化转感受态的制备与主要影响因素
大肠杆菌感受态细胞的制备 与质粒DNA的转化
2020-04-12
• 相关概念 • 菌生长特点 • 实验原理 • 方法特点 • 实验步骤 • 影响因素 • 电转杯重复利用方法
一、相关概念
感受态细胞
受体细胞经过一些特殊方法(如电击法,CaCl2 ,RbCl(KCl)等化学试剂法) 的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进 入的一种细胞状态。
电脉冲强度对电转化效率的影响
• 电场强度的影响机制 较为复杂 ，目前还 不是 十分清楚。 Kimoto的研究表明：电脉冲前 ，DNA和细胞是随机分布 的 ；电脉冲早 期，DNA 和细胞向阳极运动 ；电脉冲的 后期 ，DNA插入细胞的外膜或者进一步进 入细胞质问 隙 ；随后在 37℃孵 育期 问 DNA渗透通过 内膜进入细胞浆 。高场强下 ，可瞬间击穿细胞壁和质膜 ，形成能通过外 源物质 的跨膜 孔道；而低场强的作用下 ，需累计电荷达 到一定的强度，才可作用于质膜 ，形成孔道 ，这样易使 已形成孔道的细胞因内含物外流而引起死亡 。所以选择 合适的脉冲强度对外源 DNA的导人非常关键 。
质粒DNA不同量时对E.coli转化效率影响
质粒 DNA的结构 、大小 、含量对电转化效率的 影响也很大。选用 pUC19作为质 粒材料，就其含量对电转化效率的影响进行了探讨 ：在 40ul菌液加 入 了 4种不 同含量 的质 粒 DNA，分 别 为 0.25 ng、0.5 ng、1.0 ng、1.5 ng，结 果 表 明 用 量 为1.0 ng质粒 DNA时，电转化效率最高 ，而且电转化 效 率与 外 源 DNA 的含 量 在 一 定 范 围 内成 正 比 ；但当加入 的外源DNA的量过多或体积过大时，则 会 使转化效率下降。即 DNA溶液 的体 积不应超过感受态细胞体积 的5 %，1 ng 的质粒 DNA 即可使 50ul的感受态细胞达到饱和 。
不同因素对大肠杆菌转化效率的影响
广东化工2019年第7期·52 · 第46卷总第393期不同因素对大肠杆菌转化效率的影响谢恩诚，曹璐，蒋慧慧(巢湖学院化学与材料工程学院，安徽巢湖238000)The Study on Transformation Efficiency of Escherichia coli Affected by DifferentFactorsXie Encheng, Cao Lu, Jiang Huihui(School of Chemistry and Material Engineering, Chaohu University, Chaohu 238000, China) Abstract: There were numerous factors which can affect transformation efficiency in plasmid transformation process. In this study, we took two the most common strains of E.coli in transformation operation-BL21 and DH5a as our study objects and obtained optimum transformation conditions through deep explorations of ice-incubation time, heat shock time, preservation temperature and time. The result showed that we can attain the maximum transformation efficiency when competent cells were ice-incubated 60 min and heat shocked 90 s towards E. coli BL21, and the efficiency of it will extremely enhance when competent cells were preserved in -20 ℃. What’s more, 30 min ice-incubation and 120 s heat shock were the conditions that bring the maximum transformation efficiency to DH5a, and the efficiency could be sustained during preservation at -20 ℃, but sharply decline a half at 4 ℃.Keywords: transformation efficiency；ice-incubation time；heat shock time；preservation temperature；preservation time分子克隆是现今生命科学研究中最基础，也是最重要的一环。
TG1感受态细胞说明书
TG1感受态细胞说明书一、简介大肠杆菌经Ca离子处理后可摄取外源DNA（Plasmid、Phage DNA），处于这种状态的细胞称作感受态细胞（Competent Cells）。
在进行基因重组实验时，使用感受态细胞的转化实验应用十分广泛。
制作基因文库、重组质粒体以及进行亚克隆实验时，特别是在目的基因含量十分低的情况时，使用高效的感受态细胞十分重要。
而TG1菌株常常用于噬菌体的制备。
本公司生产的感受态细胞是采用氯化钙处理得到的感受态细胞，使用pUC19质粒检测，转化效率可达107-108，在-70℃下保存几个月转化效率不发生改变。
二、使用方法（1）取出感受态细胞，置于冰上5min，解冻。
（2）然后将连接体系（5~10ul）加入感受态中（～100ul），轻弹感受态离心管底部，混匀，冰浴30分钟。
（3）将离心管放入42℃水浴90秒后，迅速放于冰上。
（4）每管中加500μl LB(SOC)培养基(不含抗生素)，37℃振荡培养1小时。
目的是使质粒上相关的抗性标记基因表达，使菌体复苏。
（5）室温4,500rpm离心5分钟，弃去900μl上清后，用剩余100μl 培养基重悬细胞并涂布到含Amp的LB琼脂平板或含X-gal、IPTG、Amp的LB琼脂平板表面。
（6）将平板置于室温直至液体被吸收。
（7）倒置平皿，于37℃培养，12~16小时后可出现菌落。
三、注意事项１. 用此感受态进行转化需要热激，不能电转化，请勿分装。
2 . 感受态细胞应保存在-70 ℃，不可多次冻融和放置时间过长，以避免降低感受态细胞的转化效率。
3 . 为防止转化实验不成功，可以保留部分连接反应液，以重新转化，将损失降到最低。
4 ．所有操作均需注意无菌操作。
影响电转化效率的几个因素探讨
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影响电转化效率的几个因素探讨
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简述大肠杆菌转化法的原理
简述大肠杆菌转化法的原理
大肠杆菌转化法是一种重要的基因工程技术，用于将外源DNA片段引导入大肠杆菌细胞中。
其原理如下：
1. 准备质粒DNA：外源DNA片段被克隆到一个环状DNA分子上，称为质粒。
质粒中通常包含一个选择性的抗生素抗性基因，用于筛选带有插入物的转化菌落。
2. 制备有效的感受态细胞：将大肠杆菌细胞在低温条件下处理，使其处于亚温感受夹状态。
这样可使细胞外膜孔增大，利于DNA片段进入细胞。
3. 转化：将质粒DNA与感受态细胞混合，并通过热激冷冻法或电穿孔法等方式，增加DNA片段进入细胞的效率。
这些DNA片段会进入大肠杆菌细胞的质粒或染色体。
4. 恢复和培养：将转化后的细菌在适宜条件下恢复生长，使其表达并复制质粒中的外源DNA片段。
5. 识别重组菌落：在含有相应抗生素的培养基上培养细菌，通过筛选获得带有外源DNA片段的重组菌落。
这些菌落会在培养基中形成可见的生长。
通过大肠杆菌转化法，科研人员可以将外源DNA片段导入到细胞中，从而实现基因的增加、改变或删除。
这是基因工程研究和应用中常用的手段，对于生物医
学、农业和工业领域都具有重要意义。
大肠杆菌电转化感受态细胞制备及转化方法
大肠杆菌电转化感受态细胞制备及转化方法(Jin-Lab)随着基因工程和生物技术的发展，基因克隆和DNA转化技术已经成为生命科学研究的基本技术之一。
大肠杆菌是广泛应用的微生物基因克隆和表达系统，其中电转化是一种常用的DNA转化方法。
在电转化过程中，使用感受态细胞进行DNA 转化可以提高转化效率和获得更多的转化子。
因此，制备感受态细胞及其转化方法研究对开展基因克隆和表达等方面的研究具有非常重要的意义。
感受态细胞制备方法1.大肠杆菌菌株及培养基选择本实验使用大肠杆菌DH5α菌株，培养基为Luria-Bertani（LB）培养基。
2.细胞质壁分离方法将DH5α菌株经过预培养后，用LB培养基洗涤一次，收集菌落后进行以下步骤。
•在含有1mM EDTA的冷0.5M葡萄糖缓冲液中洗涤细胞三次；•加入60mg/mL的亚胺青钾（IPTG）处理4小时取得感受态细胞。
3.细胞计数及保存使用平板计数器计数，将细胞用LB培养基稀释至约1 x 10^9/mL，添加10% v/v的甘油保存在-80℃。
电转化方法1.大肠杆菌菌株及培养基选择本实验使用大肠杆菌DH5α菌株，培养基为SOC培养基（Super Optimal broth with Catabolite repression）。
2.DNA处理方法将所需构建质粒经过酶切和纯化等操作处理后，加入所需菌株中进行转化。
3.转化操作•取感受态细胞保存液用LB培养基洗涤3次；•加入所需DNA，静置30分钟使其与感受态细胞充分结合；•以1mm间隔安置两条电极在电转化仪中；•用微管脚吸取约50μL细胞转移到抗电极侧的铝箔上，用蒸馏水润湿铝箔；•将铝箔上细胞转移到电极之间的空间内，使用脉冲电压脉冲电压 1.8 kV, 25 uF, 200Ω电阻取得转化产物。
以上是大肠杆菌电转化感受态细胞制备及转化的实验步骤。
感受态细胞制备方法和电转化方法的优化将提高转化效率和转化获得率，从而为生命科学研究提供更好的服务。
制备高效大肠杆菌电转化感受态细胞和电转化条件的研究_朱森康
2011 年第 10 期
朱森康等： 制备高效大肠杆菌电转化感受态细胞和电转化条件的研究
207
pUC18 均为本实验室保存。 1. 1. 2 主要试验仪器及培养基 分光光度计 Ultrospec 3300 pro 购自 Amersham Biosciences（ Sweden） 。 0. 2 cm 电击杯和 gene Pulser II 电脉冲基因转移仪 均购自 Bio-Rad 公司。LB 培养基： 1% （ W / V） 蛋白 胨，0. 5% （ W / V ） 酵 母 粉，1% （ W / V ） 氯 化 钠。 SOC 培养基： 2% （ W / V） 蛋白胨，0. 5% （ W / V） 酵 母粉，0. 05% （ W / V） 氯化钠，0. 186 g / L 氯 化 钾， 0. 95 g / L 氯化镁，3. 6 g / L 葡萄糖。甘油为国产分 析 纯，氨 苄 青 霉 素 （ Amp ） 购 自 TaKaRa 宝 生 物 公司。 1. 2 方法 1. 2. 1 感受态细胞的制备 从新鲜活化 LB 平板 上挑取单菌落，接种于 50 mL LB 培养基中，37℃ ， 220 r / min 振 荡 培 养 过 夜 制 备 种 子 液。种 子 液 按 1% 转 接 到 一 定 装 液 量 的 LB 培 养 基 中，37℃ ， 220 r / min 振荡培养。培养一定时间，测定菌液浓度 OD600 达 到 一 定 值 后，取 出 培 养 三 角 瓶，冰 浴 冷 却 20 min，4℃ ，5 000 r / min 离心 15 min，倾去上清液； 将细胞重悬于预冷的去离子水中，4℃ ，5 000 r / min 离心 10 min，重复清洗 3 次。再将细胞重悬于预冷 的 10% （ V / V） 甘油溶液中，4℃ ，8 000 r / min 离心 10 min，重复清洗 3 次。最后细胞用 1 /1 000 初始菌 液体积的预冷 10% （ V / V） 甘油溶液重悬，100 μL 分 装至 1. 5 mL 离心管中，保存于 － 85℃ 备用。 1. 2. 2 电转化及转化效率的计算 取 100 μL 感受 态细胞，冰上融化后，迅速加入 1 ng pUC18 质粒，转 入预冷的电击杯（ 间隙 0. 2 cm） 中，一定电场强度电 击 后 迅 速 加 入 900 μL 37℃ SOC 培 养 基，37℃ ， 220 r / min 培养一定时间。以一定倍 数 稀 释 后，取 100 μL 菌液涂布于 Amp 抗性平板上，37℃ 恒温培 养过夜，菌落计数后按下式计算转化效率。转化效 率（ CFU / μg DNA） = （ 每皿转化子平均数 × 10 × 菌 悬液稀 释 倍 数） / 质 粒 微 克 数，每 一 样 本 同 时 转 化 3 份。
高压电场及微波对大肠杆菌的影响及时效性的研究
不同物理因子对大肠杆菌存活率的影响及时效性研究陈熙姜美玲徐蒙王建鹏摘要：该文旨在采用不同物理因子即高压静电场、恒定磁场、微波装置，研究磁场非热杀菌技术。
以大肠杆菌为对象菌，探求不同强度、不同作用时间等因素对对象菌的致死率影响规律。
并进一步研究电场、磁场作用对大肠杆菌影响的存留时间。
关键词：电场磁场微波大肠杆菌存活率时效性近年来，国内外不断探索电场、电磁、微波等物理因子对微生物存活率的影响，在对微生物生长繁殖的影响及作用机理等方面做了许多研究工作并取得了很大进展。
至于电场、磁场作用时效性方面的研究至今很少。
本文采用高压电场、恒定磁场及微波处理大肠杆菌水溶液的试验考虑了处理时间,处理强度及电场、磁场作用时效性的影响,对大肠杆菌存活率进行了探讨。
1 材料与方法1.1 试验菌种大肠杆菌：内蒙古大学离子束生物实验室提供。
1.2 培养基LB培养基：酵母浸粉5g，蛋白胨10g，NaCl 10 g，琼脂24g，加蒸馏水1000ml,调节pH至7.0。
121℃灭菌20min。
1.3 主要仪器ISO 9001电子分析天平台式超净工作台ZHWY ——Z102恒温培养震荡器电冰柜生化培养箱不锈钢手提灭菌锅HZQ-B 型立式恒温摇床ZHWY-2102 型立式恒温摇床直流高压发生器恒定磁场处理器1.4 试验方法1.4.1 电场处理将大肠杆菌菌液稀释成610-放入高压静电场中处理，另一个作为对照不加电场处理，分别取100ul菌液涂平皿置于37℃恒温培养箱中培养后进行活菌平板计数；将经处理和未处理的菌液放冰箱储存1天后，分别提取100ul菌液培养并计数，继续将处理和未处理的菌液放冰箱储存至2天后，再分别提取100ul菌液培养计数，通过对比存活率来评价试验结果。
以上操作都在无菌工作室的超净工作台中完成，从而避免杂菌的影响。
1.4.2 磁场处理将菌液放入恒定强磁场中处理，步骤同电场处理。
1.4.3 微波处理在无菌条件，将配置好的菌悬液混匀先稀释成106-的菌悬液在火力P5下分别处理不同时间，从处理过的菌液里取100ul涂到培养基平板上,对照为未经处理的106-菌悬液,最后置于37℃恒温培养箱中培养,测量菌的存活率。
影响大肠杆菌电转化效率因素的探讨
影响大肠杆菌电转化效率因素的探讨大肠杆菌电转化是一种高效的基因转移方法，被广泛应用于基因克隆、基因表达和基因组学研究等领域。
然而，大肠杆菌电转化效率受到多种因素的影响，包括细胞状态、基因型、电场强度、电极材料、培养条件、目的基因特性、转录和翻译机制以及转导效果评估等。
本文将对这些因素进行探讨，以期提高大肠杆菌电转化效率。
1. 细胞状态细胞状态对大肠杆菌电转化效率具有重要影响。
一般来说，活细胞比死细胞更易接受外源DNA的导入。
细胞处于对数生长期时，其转化效率最高。
因为此时细胞分裂旺盛，细胞膜通透性较高，有利于外源DNA的导入。
此外，细胞密度也会影响转化效率。
当细胞密度较高时，细胞间的电阻增加，导致电场强度减弱，从而降低转化效率。
2. 基因型不同基因型的大肠杆菌具有不同的电转化特性。
一些菌株由于其基因组结构的不同，对外源DNA的接受能力也会有所不同。
因此，在电转化实验中，应选择适合该实验条件的基因型。
3. 电场强度电场强度是影响大肠杆菌电转化效率的关键因素之一。
在一定范围内，提高电场强度可以增强细胞的通透性，从而提高外源DNA的导入效率。
但是，过高的电场强度会对细胞造成伤害，导致细胞死亡或基因组不稳定。
因此，需要根据细胞的特性和目的基因的特性选择合适的电场强度。
4. 电极材料电极材料对大肠杆菌电转化效率也有重要影响。
一般来说，导电性能好的材料可以提供更稳定的电场，从而提高转化效率。
常见的电极材料包括金属、碳纤维和玻璃纤维等。
在实际应用中，应根据实验条件和设备状况选择合适的电极材料。
5. 培养条件培养条件对大肠杆菌电转化效率具有重要影响。
在培养过程中，需要控制好温度、pH值、氧气浓度等条件。
适宜的培养条件可以促进细胞的生长和分裂，提高细胞的通透性，从而提高转化效率。
6. 目的基因特性目的基因的长度、结构和性质等特性也会影响大肠杆菌电转化效率。
较短的基因片段通常更容易导入细胞，而较长的基因片段则导入难度较大。
大肠杆菌转化失败原因
大肠杆菌转化失败原因
大肠杆菌转化失败可能有多种原因。
首先，转化体系中的DNA
浓度可能不足以支持有效的转化。
此外，大肠杆菌菌株的生理状态
和生长条件也可能影响转化效率。
另外，DNA和大肠杆菌细胞之间
的结合可能受到抑制，例如，DNA可能被降解或者存在DNA酶的存在。
此外，转化条件的温度、pH值、离子浓度等因素也可能影响转
化效率。
另外，使用的化学方法或电穿孔法等转化方法的操作技术
不当也可能导致转化失败。
最后，大肠杆菌可能具有抗药性质，使
得它们对外源DNA的摄取和表达产生抵抗。
因此，要解决大肠杆菌
转化失败的问题，需要综合考虑DNA浓度、菌株状态、转化条件、
转化方法和大肠杆菌的抗性等多个因素，并进行适当的优化和调整。
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第２７卷第３期吉林农业科技学院学报Ｖｏｌ.２７Ｎｏ.３２０１８年９月ＪｏｕｒｎａｌｏｆＪｉｌｉｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＳｅｐ.２０１８电转化条件对大肠杆菌ＴＧ１转化效率的影响刘㊀麒ꎬ王阔鹏ꎬ于凌娇ꎬ刘倩宏∗摘㊀要:研究探索不同条件对ＴＧ１大肠杆菌转化率的影响ꎬ以探索最适合电转化条件ꎮ研究通过对细菌生长曲线绘制ꎬ改变不同生长阶段㊁感受态细胞浓度㊁转化后复苏液以及复苏时间㊁电转化参数㊁质粒浓度㊁抗生素浓度等影响电转化率的条件ꎬ探索最适合的电转化条件ꎮ结果表明ꎬＴＧ１大肠杆菌３７ħ㊁１７０ｒｐｍ/ｍｉｎ震荡活化培养时间３ｈ后ꎬ以电压１８００Ｖ㊁电容２５μＦ㊁电阻２００Ω进行电击转化ꎬ以ＬＢ液体对电击细胞复苏４５ｍｉｎꎬ为最佳转化条件ꎮ该结果具有可重复性ꎬ为后续建立基因文库奠定良好基础ꎮ关键词:大肠杆菌ꎻＴＧ１ꎻ电转化基金项目:吉林农业科技学院大学生科技创新项目(吉农院合字[２００９]第１１４３９０２４号)收稿日期:２０１８￣０３￣２６文章编号:１６７４￣７８５２(２０１８)０３￣０００６￣０４作者简介:刘麒ꎬ吉林农业科技学院动物科技学院学生ꎬ本科在读ꎻ刘倩宏ꎬ通讯作者ꎬ吉林农业科技学院动物科技学院副教授ꎬ博士ꎬ研究方向:布鲁菌病ꎮ(吉林㊀１３２１０１)转化是基因重组中的一项重要技术ꎬ是决定平末端连接效率及建立高质量基因文库的关键ꎮ将携带目的基因的质粒成功导入受体细胞的方法有两种:一种是氯化钙法ꎬ另一种是电转化法ꎮ电转化法是利用瞬间高压迫使细胞膜产生孔隙使质粒导入细胞ꎬ其转化率较高[１]ꎮ基因的平末端连接对转化率要求较严格ꎬ需要较高的转化率作为支撑ꎮ目前ꎬ在不同实验室环境的影响下ꎬ感受态细胞的制备以及转化条件都有所不同ꎮ为提高平末端连接㊁转化效率ꎬ进而建立较高质量的文库ꎬ因此本研究通过比较不同电转化条件下大肠杆菌ＴＧ１的转化效率ꎬ为后续噬菌体展示基因文库的建立奠定基础ꎮ１㊀试验材料与方法１.１㊀试验材料与主要仪器大肠杆菌菌株ＴＧ１本室－８０ħ保存ꎻｐＤＪ０１质粒为梅西大学ＪａｓｎａＲａｋｏｎｊａｃ教授惠赠ꎬ－８０ħ保存ꎻ大肠杆菌ＴＧ１株购自广州碧云天生物有限公司ꎻ质粒提取试剂盒购自康为世纪生物有限公司ꎮＬＢ液体培养液:量取胰蛋白胨２ｇꎬ酵母提取物２.０ｇꎬＮａＣｌ１.０ｇꎬ用去离子水定容补足体积至５００ｍＬꎮＳＯＣ培养液:在９５０ｍＬ去离子水中加入胰化蛋白胨２０.０ｇꎬ酵母提取物５.０ｇꎬＮａＣｌ０.５ｇꎬ加入１０ｍＬ２５０ｍｍｏｌ/ＬＫＣｌ溶液ꎬ用５ｍｏｌ/ＬＮａＯＨ调ｐＨ至７.０ꎮ用去离子水定容１Ｌꎬ高压蒸汽灭菌２０ｍｉｎꎬ备用ꎮ使用前加入５ｍＬ灭菌的２ｍｏｌ/ＬＭｇＣｌ２ꎬ高压灭菌后冷却至６０ħ或６０ħ以下ꎬ加２０ｍＬ除菌的１ｍｏｌ/Ｌ葡萄糖溶液[２]ꎮＬＢ固体培养基(含２０μｇ/ｍＬ氯霉素):称取胰蛋白胨２ｇꎬ酵母提取物２ｇꎬＮａＣｌ１ｇꎬ琼脂糖４ｇꎬ用去离子水定容补足体积至５００ｍＬꎮ待蒸汽灭菌后ꎬ将培养基放置水浴锅中ꎬ待温度降至４０ħ左右添加氯霉素以２０μｇ/ｍＬ的终浓度添加于培养基中ꎮＴＧＬ２０Ｍ离心机㊁超净工作台㊁电转仪(Ｂｉｏ￣ｒａｄ)㊁无菌恒温培养箱(Ｔｈｅｒｍｏｌ)ꎮ１.２㊀试验方法１.２.１㊀ｐＤＪ０１质粒提取㊀用接种环蘸取一定的菌液在新鲜的ＬＢ(含２０μｇ/ｍＬ氯霉素)固体培养基上交错划线ꎬ３７ħ倒置过夜培养ꎮ挑取单菌落接种于５ｍＬＬＢ(含２０μｇ/ｍＬ氯霉素)液体培养基中３７ħ㊁２００ｒｐｍ/ｍｉｎ过夜震荡培养ꎬ将菌液离心ꎬ利用康为世纪质粒提取盒提取质粒ꎮ１％琼脂糖凝胶电泳检测提取质粒浓度ꎮ１.２.２㊀ＴＧ１大肠杆菌生长曲线的绘制㊀取出－８０ħ保种的ＴＧ１大肠杆菌ꎬ用接种环蘸取一定的菌液在新鲜的ＬＢ固体培养基上交错划线ꎬ３７ħ过夜㊁静置培养ꎮ挑取单菌落接种于５ｍＬＬＢ液体培养液中ꎬ３７ħꎬ１７０ｒｐｍ/ｍｉｎ振荡过夜培养ꎬ此即为母液ꎮ按母液与ＬＢ液体培养液１ʒ１００比例ꎬ转接新鲜ＬＢ液体培养液中ꎬ３７ħꎬ１７０ｒｐｍ/ｍｉｎ振荡培养ꎬ每隔０.５ｈ取菌液０.５ｍＬꎬ直至培养９.５ｈꎬ取不同时间点菌液进行菌落计数ꎬ具体操作参照文献进行ꎬ绘制ＴＧ１株大肠杆菌生长曲线图[３￣４]ꎮ对经过培养的菌液用ＬＢ液体培养液进行１０倍稀释ꎬ稀释成１０－１~１０－１３ꎬ取不同稀释度菌液１００μＬ涂板计数ꎮ试验重复三次ꎮ１.２.３㊀ＴＧ１感受态细胞的制备㊀取２ｍＬ母液转接到２００ｍＬ新鲜的ＬＢ液体培养液中ꎬ３７ħ㊁１７０ｒｐｍ/ｍｉｎ振荡培养(振荡培养时间及条件根据１.２.２结果确定)ꎬ冰浴３０ｍｉｎꎮ将冰浴后的菌液分装至预冷的无菌离心管中ꎬ４ħ㊁５０００ｒｐｍ/ｍｉｎ离心２０ｍｉｎꎬ操作始终保持在冰浴环境下进行ꎮ将上清液吸出后ꎬ再用１０％无菌甘油水轻轻吹打重悬细胞ꎬ重复洗涤２次后分别用１０％无菌甘油水重悬细胞沉淀ꎮ每管１００μＬ分装至ＥＰ管中ꎬ－８０ħ保存备用ꎮ１.２.４㊀电转化㊀将２μＬｐＤＪ０１质粒加入１００μＬ感受态细胞中充分混合ꎬ电转化条件为电压１８００Ｖꎬ电容２５μＦꎬ电阻２００Ωꎬ０.１ｃｍ电击杯ꎬ进行电击ꎮ立刻加入５００μＬＬＢ保护受损细胞并转移到离心管中ꎬ再加入４００μＬＬＢ充分吹尽菌体加入到离心管中ꎬ３７ħ㊁１７０ｒｐｍ/ｍｉｎ振荡培养４５ｍｉｎꎬ用移液枪吸取１００μＬ涂于ＬＢ固体培养基(２０μｇ/ｍＬ氯霉素)ꎬ３７ħ恒温箱过夜培养ꎬ通过生长的菌落数评价转化效率ꎮ１.２.５㊀ＴＧ１菌株在不同生长阶段对电转化效率的影响㊀通过１.２.２确定的对数生长期ꎬ选取活化后１.５ｈ㊁２.０ｈ㊁２.５ｈ㊁３.０ｈ㊁３.５ｈ的ＴＧ１菌液ꎬ制备感受态细胞ꎬ进行电转化ꎬ条件同１.２.４ꎬ进行菌落计数检测电转化效率ꎮ１.２.６㊀感受态细胞浓度对转化率的影响㊀理论上感受态细胞的浓度越高其转化率越高ꎬ但过高的浓度会使菌体过于粘稠ꎬ不利于质粒与菌体混合ꎬ反而会降低其对质粒的转化率ꎮ按１.２.５优化的最佳条件制备感受态细胞后ꎬ将其分装在４管５０ｍＬ预冷的无菌离心管中ꎬ每管约１００μＬ菌体ꎬ分别加入１０％无菌甘油水进行１ʒ１㊁１ʒ３㊁１ʒ５㊁１ʒ７倍稀释ꎬ以确定感受态细胞制备最佳稀释浓度ꎮ将２μＬｐＤＪ０１质粒分别与不同稀释倍数的感受态细胞混合ꎬ电转化ꎬ其余操作同１.２.４ꎮ１.２.７㊀转化后复苏时间及复苏液对转化率的影响㊀对电击后细胞的复苏液的选取及复苏时间进行优化ꎮ将２μＬｐＤＪ０１质粒与１００μＬ感受态细胞混合ꎬ进行电转化操作同１.２.４ꎬ电击后立即加入９００μＬＬＢ液体培养液和ＳＯＣ培养液ꎬ３７ħ㊁１７０ｒｐｍ/ｍｉｎ振荡培养ꎬ分别在０.７５ｈ㊁１.５ｈ㊁２.０ｈ㊁２.５ｈ四个时间点取样ꎮ取不同复苏液及不同复苏时间的菌液样本５０μＬ进行涂板ꎬ恒温箱３７ħ倒置过夜培养ꎬ进行菌落计数ꎮ其余操作同１.２.４ꎮ图１图１.ｐＤＪ０１质粒提取结果１.提取质粒ｐＤＪ０１结果ꎻ２.１００００ｍａｒｋ(条带大小从下到上分别为１００ｂｐ.２５０ｂｐ.５００ｂｐ.７５０ｂｐ.１０００ｂｐ.１５００ｂｐ.２０００ｂｐ.３０００ｂｐ.５０００ｂｐ.１００００ｂｐ)１.２.８㊀电转化条件对转化率的影响㊀选用以下三组不同条件进行电转化:电压１８００Ｖ㊁电容２５μＦ㊁电阻２００Ω㊁０.１ｃｍ电击杯ꎻ电压２５００Ｖ㊁电容２５μＦ㊁电阻２００Ω㊁０.１ｃｍ电击杯ꎻ电压３０００Ｖ㊁电容２５μＦ㊁电阻２００Ω㊁０.２ｃｍ电击杯ꎮ电转化后操作与１.２.４相同ꎬ培养后进行观察ꎮ１.２.９㊀质粒浓度改变对转化率的影响㊀分别取１００ｎｇ/ｍＬ㊁５０ｎｇ/ｍＬ㊁２５ｎｇ/ｍＬ不同浓度的ｐＤＪ０１质粒２μＬ与１００μＬ感受态细胞充分混合ꎬ冰浴静置５ｍｉｎ进行电转化ꎬ操作与１.２.４相同ꎬ根据结果评价质粒浓度改变对转化率的影响ꎮ１.２.１０㊀抗生素浓度对转化率的影响㊀向ＬＢ固体培养基中添加氯霉素使其浓度为１０μｇ/ｍＬ㊁２０μｇ/ｍＬ㊁４０μｇ/ｍＬꎮ利用１.２.８优化的电转化参数对其进行电转化操作后ꎬ分别将其涂布于氯霉素浓度分别为１０μｇ/ｍＬ㊁２０μｇ/ｍＬ㊁４０μｇ/ｍＬ的ＬＢ固体培养基上ꎮ其余操作同１.２.４ꎬ根据结果评价抗生素对转化效率的影响ꎮ２㊀结果２.１㊀ｐＤＪ０１质粒提取结果ｐＤＪ０１质粒提取结果见图１ꎮｐＤＪ０１质粒大小约为１５００ｂｐꎬ在预期位置发现目的条带ꎬ并估算其浓度约为１００ｎｇ/μＬꎮ２.２㊀大肠杆菌ＴＧ１生长曲线的绘制分别取活化后不同时间点ＴＧ１菌液ꎬ绘制细菌生长曲线ꎬ结果见图２ꎮ从图中可看出ꎬ１.５ｈ至５ｈＴＧ１处于对数生长期ꎮ细菌处于对数生长期时的形态㊁染色特性㊁致病性㊁抗药性等生物特征最为典型ꎬＴＧ１生长曲线的绘制对于后续系列转化条件的优化至关重要ꎮ７第３期刘㊀麒ꎬ等:电转化条件对大肠杆菌ＴＧ１转化效率的影响图２大肠杆菌ＴＧ１生长曲线图３ＴＧ１菌株在不同生长阶段对转化率的影响图４细胞浓度对转化率的影响图５ＴＧ１转化时间及复苏液对转化率影响结果图６电转化条件对转化率的影响２.３㊀ＴＧ１菌株在不同生长阶段对电转化率的影响分别取活化后１.５ｈ㊁２.０ｈ㊁２.５ｈ㊁３.０ｈ㊁３.５ｈ的大肠杆菌ＴＧ１菌液制备感受态细胞ꎬ电转化ꎬ进行菌落计数ꎬ结果见图３ꎬ经统计学分析ꎬ各组间差异极显著(ｐ<０.０１)ꎬ因此在活化后３.０ｈ时ꎬ其电转化效率最高ꎮ２.４㊀感受态细胞浓度对转化率的影响取活化后３.０ｈ菌液制备感受态细胞ꎬ以１０％无菌甘油水稀释制备好的感受态细胞ꎬ电转化后确定不同感受态细胞浓度对转化效率的影响ꎬ结果见图４ꎮ经统计学分析ꎬ１组(１ʒ１倍稀释)㊁２组(１ʒ３倍稀释)㊁３组(１ʒ５倍稀释)之间结果无显著差异(ｐ>０.０５)ꎬ１组㊁２组㊁３组与４组(１ʒ７倍稀释)之间结果差异极显著(ｐ<０.０１)ꎬ试验以１ʒ１倍稀释浓度为最佳操作条件ꎮ２.５㊀电转化后复苏培养液及复苏时间对转化率的影响选用ＬＢ和ＳＯＣ不同复苏液对电击后感受态细胞进行复苏ꎬ结果见图５ꎮ用ＬＢ复苏液复苏电击后细胞效果明显优于ＳＯＣ复苏液ꎬ经统计学分析ꎬ差异极显著(ｐ<０.０１)ꎮ选取ＬＢ复苏液后分别摇动０.７５ｈ㊁１.５ｈ㊁２.０ｈ㊁２.５ｈ后ꎬ从图５看出并经统计学分析ꎬ不同复苏时间对转化效率没有影响ꎮ经统计学分析ꎬ差异不显著(ｐ>０.０５)ꎬ因此试验选用电击后复苏０.７５ｈꎮ选取ＳＯＣ复苏液后分别摇动０.７５ｈ㊁１.５ｈ㊁２.０ｈ㊁２.５ｈ后ꎬ从图５看出并经统计学分析ꎬ差异不显著(ｐ>０.０５)ꎬ不同复苏时间对转化效率没有影响ꎮ因此试验选用电击后复苏０.７５ｈꎮ２.６㊀电转化条件对转化率的影响分别设定三组不同电击参数及不同厚度电击杯ꎬ确定其对转化效率影响ꎬ结果见图６ꎮ从图中可以看出第１组即电压１８００Ｖꎬ电容２５μＦꎬ电阻２００Ωꎬ电转化效率最高ꎬ并经统计学分析ꎬ１组与２组㊁３组间差异极显著(ｐ<０.０１)ꎬ为最佳电转化参数ꎮ２.７㊀质粒浓度的改变对转化率的影响选取１００ｎｇ/ｍＬ㊁５０ｎｇ/ｍＬ㊁２５ｎｇ/ｍＬ不同浓度的ｐＤＪ０１质粒２μＬ与１００μＬ感受态细胞充分混合后ꎬ从图７看出１００ｎｇ/ｍＬｐＤＪ０１质粒转化效率最佳ꎬ经统计学分析ꎬ１组与２组㊁３组间差异极显著(ｐ<０.０１)ꎬ为最佳质粒浓度ꎮ２.８㊀抗生素浓度对转化率的影响向ＬＢ固体培养基中分别添加１０μｇ/ｍＬ㊁２０μｇ/ｍＬ㊁４０μｇ/ｍＬ浓度的氯霉素ꎬ从而确定不同浓度抗生素对转化效率的影响ꎮ结果见图８ꎬ抗生素浓度为２０μｇ/ｍＬ时转化率最高ꎬ恰好适宜转化后的细胞增殖并抑制杂菌生长ꎬ经统计学分析ꎬ１组与２组㊁３组间差异极显著(ｐ<０.０１)ꎬ在氯霉素含量为２０μｇ/ｍＬ的条件下ꎬ转化效率最高ꎮ８吉林农业科技学院学报㊀㊀㊀第２７卷图７质粒浓度的改变对转化率的影响图８抗生素浓度对转化率的影响３㊀讨㊀论感受态细胞的制备和转化已经成为分子生物学实验中的一项常规操作ꎬ常见转化方法包括电转化法㊁ＭｇＣｌ２￣ＤＭＳＯ法㊁ＬｉＡｃ和ＣａＣｌ２法等ꎬ而电转化法相对成本较低㊁操作简单㊁转化效率较为理想ꎬ转化条件因实验室不同ꎬ结果也不尽一致ꎬ而且不同的菌株对电转化的反映程度不同ꎬ所用的转化效率和转化条件一定不同[５￣８]ꎮ研究对大肠杆菌ＴＧ１转化条件进行了探索ꎬ为后续平端连接以及建库打下良好的基础ꎮ电压是决定电转化效率的重要参数ꎬ通过运用高电压将细胞的细胞壁电击出可以使大分子物质通过的小孔ꎮ由于利用强电压对细胞进行电击将会对细胞造成极大的损伤ꎬ在此过程中会使较多的细胞受损死亡以及生存受限而难以得到高转化率ꎬ并且死亡的菌体会严重影响细菌的生存空间从而限制其生长ꎮ因此ꎬ严格选择适宜的电压是进行电转化试验时ꎬ达到预期效果和必需条件的重点ꎮ经过试验摸索最适电压为１８００Ｖꎬ此电压电击转化率最好ꎮ研究对ＳＯＣ㊁ＬＢ两种复苏液的效果也进行了比较ꎮＳＯＣ复苏液营养物质含量较ＬＢ更加丰富ꎬ但其对电击后细菌的生长并没有明显促进作用ꎬ即使在复苏过程中ꎬ菌体沉淀量远多于ＬＢ复苏液ꎬ事实上并没有在转化率上体现出来ꎬ分析其原因可能是因为ＳＯＣ复苏液丰富的营养ꎬ相对而言只加速了未受损细胞的生长速度ꎬ而对转化率则没有明显促进作用[９]ꎮ这与黄学娟ꎬ张金迪ꎬ张壮等人的研究不符ꎬ其原因可能是由于试验条件与环境不同而造成的差异ꎮ４㊀结㊀论在本实验室条件下大肠杆菌ＴＧ１株感受态细胞最优制备条件为:ＴＧ１大肠杆菌母液按照１ʒ１００导入新鲜ＬＢ液体培养液后ꎬ３７ħ㊁１７０ｒｐｍ/ｍｉｎ活化培养３ｈꎬ感受态终浓度１.４ˑ１０７ꎬ复苏液选用ＬＢ液体培养液ꎬ复苏时间为３.０ｈꎻ最佳电转化条件:为电压１８００Ｖꎬ电容２５μＦꎬ电阻２００ΩꎬｐＤＪ０１质粒浓度为１００ｎｇ/μＬꎬ氯霉素浓度２０μｇ/ｍＬꎮ参考文献:[１]唐颜苹ꎬ王小媚ꎬ何薇ꎬ等.大肠杆菌感受态细胞保存条件的研究[Ｊ].华中农业大学学报ꎬ２００８(６):７４５￣７４８.[２]萨姆布鲁克Ｊ.分子克隆实验指南[Ｍ].３版.北京:科学出版社ꎬ２００２.[３]代军.大肠杆菌感受态细胞制备及转化条件优化[Ｊ].江苏农业科学ꎬ２０１５(４):５３￣５４.[４]宋晓蕾ꎬ周芬芬ꎬ吴湜ꎬ等.ｓｐｏ０Ａ基因在艰难梭菌生长及芽孢形成中的作用[Ｊ].中国感染与化疗杂志ꎬ２０１７(１):３３￣３６.[５]ＪａｎｋｏｖｉｃＤｒａｇａｎａꎬＣｏｌｌｅｔｔＭｉｃｈａｅｌＡꎬＬｕｂｂｅｒｓＭａｒｋＷꎬｅｔａｌ.ＤｉｒｅｃｔｓｅｌｅｃｔｉｏｎａｎｄｐｈａｇｅｄｉｓｐｌａｙｏｆａＧｒａｍ￣ｐｏｓｉｔｉｖｅｓｅｃｒｅｔｏｍｅ.[Ｊ].Ｇｅｎｏｍｅｂｉｏｌｏｇｙꎬ２００７ꎬ８(１２):１８６￣１９１.[６]张岚岚ꎬ徐春燕ꎬ徐昌杰.大肠杆菌感受态细胞转化能力的影响因素[Ｊ].细胞生物学杂志ꎬ２００４(０４):４２９￣４３２.[７]朱森康ꎬ黄磊ꎬ李燕飞ꎬ等.制备高效大肠杆菌电转化感受态细胞和电转化条件的研究[Ｊ].生物技术通报ꎬ２０１１(１０):２０６￣２０９.[８]罗锋ꎬ余腾ꎬ范丽梅.感受态细胞制备和质粒转化冰浴时间对大肠埃希菌转化效率的影响[Ｊ].江汉大学学报(自然科学版)ꎬ２０１１ꎬ３９(０３):８２￣８５.[９]黄学娟ꎬ张金迪ꎬ张壮ꎬ等.一种优化的大肠杆菌感受态细胞制备及转化方法[Ｊ].基因组学与应用生物学ꎬ２０１７ꎬ３６(１２):５１９９￣５２０４.ʌ责任编辑:吴艳玲ɔ９第３期刘㊀麒ꎬ等:电转化条件对大肠杆菌ＴＧ１转化效率的影响。