大肠杆菌电转和文库扩增
电转化大肠杆菌感受态细胞
电转化大肠杆菌感受态细胞
1．从-80︒C冰箱取出感受态细胞，置于冰上解冻。
2．将无菌的电击杯置于冰上预冷。
3．将解冻的感受态细胞按照100ul/管分装至预冷的1.5ml的离心管中，混匀，冰上放置。
4．向装有感受态细胞的离心管中加入1-2 µl质粒或连接产物，并混匀，冰浴10min。
5．打开电转仪，电压为2.0 kV，电击5ms [这些参数设置可以根据经验略作调整]。
6．将混合物转移至已预冷的电击杯中，轻轻敲击电击杯使混合物均匀进入电极杯的底部。
并用吸水纸吸干电击杯外壁的冰水。
7．将电击杯推入电转仪，按一下pulse键，听到蜂鸣声后，向电击杯中迅速加入2X 500μl 的SOC液体培养基，重悬细胞后，转移到1.5ml的离心管中。
8．37︒C，220rpm复苏1小时。
9．离心，涂板，置于37︒C，过夜培养，次日观察结果。
BAC文库的构建
BAC文库构建技巧基因组DNA文库构建实验技巧基因组DNA文库有十分广泛的用途，如用于分析、分离特定的基因片段，用以基因表达调控、人类及动植物基因组工程的研究。
通常情况下，基因组文库构建的基本流程可以归为4大步骤：分离基因组DNA、对基因组DNA作相关的处理、将基因组DNA片段连接入载体、将重组载体转入宿主细胞。
一、分离基因组DNA（gDNA）毫无疑问，优质的基因组DNA对于基因组文库构建是至关重要的。
研究者需要查阅文献，通过经验来选择合适的基因组DNA 分离方法，在分离过程中保证DNA不被过度剪切或降解，同时也要尽量保证DNA的纯度。
二、处理基因组DNA根据研究目的，研究者需要选择合适的载体。
不同的载体对基因组DNA的长度有不同的要求，研究者必须选择合适长度的基因组DNA来构建基因组文库。
比如，对于黏粒载体（比如Epicntre的pCC1FOSTM、pEpiFOSTM-5、pWEB-TNCTM、pWEBTM），合适的片段长度大约为40kb；对于BAC载体（比如Epicentre 的pIndigoBAC-5、pCC1BACTM），平均来说，合适的片段长度为120kb-300kb。
构建黏粒基因组DNA文库，研究者需要将基因组DNA用注射器抽打来随机剪切DNA；接着用末端修复酶修复DNA，可以提高DNA 连接入载体的效率；然后通过脉冲场电泳或者普通电泳来找到40kb 左右的DNA片段，随后使用Epicentre GELase 胶回收试剂盒回收DNA。
构建BAC基因组DNA文库，研究者需要将基因组DNA用限制性内切酶（常用EcoR I、BamH I或者Hind III）来消化基因组DNA，然后通过脉冲场电泳找到合适长度的DNA片段（比如100kb-150kb），随后透析回收DNA。
需要注意：（1）电泳时，要选用合适的DNA Ladder，以保证电泳后可以准确定位所需分子量的DNA。
用Epicentre试剂盒构建黏粒文库时，就可以直接采用文库试剂盒内的Control Insert DNA来做marker，既方便又准确。
大肠杆菌转录的基本过程
大肠杆菌转录的基本过程
大肠杆菌转录的基本过程
大肠杆菌转录是指RNA合成的过程，也就是核酸从DNA复制成RNA的过程。
这个过程反映了大肠杆菌基因的表达，通过转录的过程，大肠杆菌可以利用其基因组中存储的信息生产出合成蛋白的基本单元——核酸分子。
转录不仅可以产生遗传信息，而且还能产生功能性的重要核酸分子，如riboprotein、riboswitch等。
大肠杆菌转录的基本过程主要包括5个步骤：
1. 启动子扩增：启动子被激活分子RNA激酶调节，使得RNA合成发生，RNA激酶把启动子序列拉长，使其成为引物。
2. 引物捕获： RNA合成复制器把引物与丝氨酸聚合酶结合起来，捕获并识别启动子上的碱基链。
3. RNA合成：丝氨酸聚合酶识别转录模板上的碱基链，并根据转录模板，复制出一条线粒体RNA。
4. 终止：一旦RNA合成完成，转录过程就会停止，终止因子和复制器分离，RNA合成停止，释放出RNA分子。
5. 折叠：RNA分子根据其特定的化学性质注意力折叠，以完成其机械功能并成为一条3D的分子结构。
大肠杆菌转录的这5个基本步骤是RNA合成的核心过程，是细胞内大肠杆菌基因表达的基本法则。
- 1 -。
大肠杆菌的转化、扩增及一些基础的实验前准备
A．大肠杆菌的转化（热击法）1. 从-80℃超低温冰柜中取出一管感受态大肠菌（BL21），立即用手指加温融化后插入冰上，冰浴5~10 min。
从冰箱中拿出含目标基因片段的质粒一管，也插入冰中，冰浴5~10 min，待融化。
2. 往上述大肠菌中加入5 μl(一般大肠菌50ul,质粒5ul)连接好的质粒混合液（DNA含量不超过100 ng），轻轻震荡后放置冰上20 min。
同时，将恒温水浴的温度调到42℃。
顺便把质粒管放回原处。
(移液器枪头可能要用贴有白色标的那种).(有时大肠菌为10UL，质粒1~2UL。
比例在10:1左右)3. 轻轻摇匀后插入42℃水浴中1 min进行热休克，然后迅速放回冰中，静置5~10 min。
这样质粒就被导入了。
4. 在超净工作台中向上述引入质粒的大肠杆菌管中加入500 μl LB培养液（不含抗菌素）轻轻混匀，然后固定到摇床弹簧架上37℃震荡0.5h。
5. 同时将含合适抗菌素（AMP）的固体LB平板培养皿，放入烘箱37℃下烘0.5h。
这样可以防止大肠菌因为较大温差而死亡。
6. 在超净工作台中取上述转化混合液（即导入质粒的大肠菌）150 μl，滴到含合适抗菌素的固体LB平板培养皿中，用酒精灯烧过（防止杂菌）的玻璃涂布棒涂布均匀，注意涂布棒不可烧后直接涂，要降温。
将多余的转化混合液倒入废液缸，管子投入指定地点。
7. 倒置培养基，在培养皿上做上标记，放置在37℃恒温培养箱中培养箱过夜（约12-15小时）。
9. 在被细菌污染的桌面上喷洒70%乙醇，整理。
B．大肠杆菌扩增用的“营养肉汤培养液”的配制酵母提取物，蛋白胨，氯化钠，NaOH溶液等按照实验室写的来，加1L超净水。
配好的培养基灭菌时需要在摇瓶上加透气的塞子，然后120度20分钟灭菌。
写上标签。
有些需要灭菌的器材都可以在此时灭菌。
C1．大肠杆菌扩增（在2*TY培养基上）1.实验前先对双手消毒。
实验时也要注意对器材在火上烧一下如镊子，移液器，试管口，试管盖，使用前后的竹签。
大肠杆菌电转化-精品资料
大肠杆菌电转化感受态细胞制备实验步骤和转化方法实验步骤：1、将适合菌株（如XL1-Blue, DH5 a）置于LB或其他营养丰富的培养基上，在37'C下过夜培养。
2、高温灭菌大的离心瓶（250-500ml ）。
准备几瓶灭菌水（总量约1.5 升），保存于冷冻室中以备重悬浮细胞用。
3、转移0.2-1ml 过夜培养物至装有500ml LB （或其他营养丰富的培养基）的1-2 升挡板摇瓶中。
4、37C下剧烈振荡培养2-6小时。
5、定时监控O.D.600值（培养1小时后每半小时测定一次），当O.D.600值达到0.5-1.0时，从摇床中取出摇瓶，置于冰上冷却至少15 分钟（需要的话这种方式可以存放培养液数小时）。
6、细胞在4C 5000g下离心15分钟，弃上清液（如需要，沉淀可在4C的10%甘油中保存一两天）。
7、用灭菌的冰水重悬浮细胞。
先用涡旋仪或吸液管重悬浮细胞于少量体积中（几毫升），然后加水稀释至离心管的2/3 体积。
8、照上面步骤重复离心，小心弃去上清液。
9、照上面步骤用灭菌的冰水重悬浮细胞。
10、离心，弃上清液。
用20ml 灭菌的、冰冷后的10%甘油重悬浮细胞14. 照上面步骤离心，小心弃去上清液（沉淀可能会很松散）。
11、用10%甘油重悬浮细胞至最终体积为2-3ml。
12、将细胞按150g l等份装入微量离心管，于-80 C保存。
转化方法:2、添加1-3g l DNA，冰上培育约5分钟1、在冰上解冻电感受态细胞添加1-10g l DNA，冰上培育约5分钟3、转移DNA/细胞混合物至冷却后的2mm电穿孔容器（无泡）中。
4、加载P1000,准备好300 g l LB 或2xYT。
3 以上）5、对电穿孔容器进行脉冲（200欧姆，25 g Fd, 2.5千伏）（检查时间常数，应该在6、立即添加300g l的LB或2xYT至电穿孔容器中。
7、37 C下培养细胞40分钟至1小时以复原。
8、转移细胞至适当的选择培养基上培养。
大肠杆菌电击转化流程
大肠杆菌感受态制备及电转化流程1.细菌电转化感受态细胞的制备准备:50mL离心管3个10%甘油≥200mL 灭菌蒸馏水≥100mL 冰盒(50mL离心管预冷)2个1)由-80℃冰箱保存的菌种划单菌落,过夜培养16-20h。
晚上将新鲜的菌落接种于装有20mLLB培养基的250mL三角瓶中,37℃振荡培养过夜(约12h),转速控制在200rpm;2)第二天,取过夜培养物以1%接种量(可适当加大)转接入2个含50mLLB培养基的250mL三角瓶中,37℃剧烈振荡(200rpm)培养至OD600约为0.5~0.6;3)将2瓶细菌培养物分别倒入两个预冷的50mL离心管,然后至于冰水混合物中骤冷,一定要骤冷,冰水混合物中冷却至少15min(需要的话这种方式可以存放培养液数小时)3)将离心管于4℃,4000rpm,离心10min,收集菌体,弃上清;4)用50ml灭菌蒸馏水(预冷至4℃)轻轻重悬菌体,先加入少量水重悬菌体,然后把水加满, 4℃,4000rpm离心10min,弃上清,再重复一次;5)再用10%甘油重复步骤4)两次,4000rpm离心10min,最后一次倒尽上清后,再用残存管底的甘油悬浮细胞,分装ep管,100μL/支(一般,25mL起始培养物最终用200-250μL l0%甘油悬浮);6)放入-80℃冰箱中速冻。
或者立即用于电转化。
注意:1)菌种最好是-80℃冻存的,活化后生长状态较好。
2)20ml培养过夜,振荡速度不要过高(一般应该是37℃,300rpm,6h,当天转接,这样一天内工作量太大,这里我们选择过夜培养,时间长,转速控制在200rpm,可以适当缩短时间,前一天晚接种,第二天早转接)3)培养完毕后一定要骤冷,是培养物在短时间内迅速冷却。
冰水混合物中摇动瓶子,大约15min。
4)使用的器皿一点要非常干净,没有化学物质残存,可以先用餐洗净洗,再加入NaOH固体和蒸馏水产热,最后用蒸馏水反复冲洗干净。
大肠杆菌电转糊板的原因
大肠杆菌电转糊板的原因
大肠杆菌电转糊板的原因可能有以下几个方面：
基因组差异：大肠杆菌的基因组在不同菌株之间存在一定的差异，这可能导致某些菌株在电转过程中更容易发生糊板现象。
细胞壁结构：大肠杆菌的细胞壁结构对电转糊板的发生也可能有影响。
一些细胞壁结构较为松散的菌株可能在电转过程中更容易发生糊板现象。
生长条件：大肠杆菌的生长条件如培养基成分、温度、pH等也可能影响电转糊板的发生。
例如，培养基中某些成分可能会影响细胞的通透性或细胞壁的稳定性，从而增加糊板的风险。
电转条件：电转条件如电场强度、电转时间、电极间距等也可能影响糊板的发生。
例如，过高的电场强度可能会导致细胞内物质泄漏，从而增加糊板的风险。
操作不当：在电转过程中，如果操作不当，如电极放置不当、电极间距过小等，也可能导致糊板现象的发生。
综上所述，大肠杆菌电转糊板的原因是多方面的，包括基因组差异、细胞壁结构、生长条件、电转条件和操作不当等。
为了减少糊板现象的发生，可以尝试优化电转条件、选择合适的生长条件和操作方法等措施。
同时，对于出现糊板现象的菌株，可以采用适当的处理方法，如离心洗涤、重新悬浮等，以提高电转的效率和质量。
大肠杆菌菌株感受态制备_电击转化及转化效率检测
大肠杆菌DH10B（Streptomycin resistant）电转化感受态制备1．从保存的甘油管中取出200 μL菌液到100 mL的LB液体中，37o C，200 rpm培养约13~16小时后（对数期），按2%接种到SOB培养基中；2．37o C，约2~2.5小时后，OD600约0.5左右，取出，冰上缓慢摇育30 min。
3．预先4o C降温的冷冻离心机离心收集菌体，用预冷的离心管，并时刻保持在冰上，5000 rpm离心5 min；4．用50~60 mL的冰预冷灭菌超纯水洗菌体两次，用枪吸打时一定要轻柔，并时刻保持在冰上，第二次洗时可以将2管的菌体并到一管，水洗过程离心的转速要高一些，约6000 rpm离心5 min，因为离心得不是很实，离心完后要立即倒掉上清，以免菌体重新悬浮造成损失；5．用50 mL的冰预冷灭菌10%甘油洗菌体两次，用枪吸打时一定要轻柔，并时刻保持在冰上，离心后立即倒掉上清；6．最后一次甘油洗涤后立即倒掉上清，视菌体量加入0~x μL的10%冰预冷甘油重新悬浮细胞，75~200 μL/管,分装到预冷的离心管中，电转化或立即放入-80o C冰箱保存，该感受态可以在-80o C保存半年。
SOB培养基（1L）：20 g Tryptone；5 g Yeast Extract；0.6 g NaCl；0.19 g KCl，8磅灭菌20 min。
注意事项：种子一定要新鲜，最好是从甘油管中直接液体活化的。
OD600控制在0.5左右，建库用的话千万不要过！过了0.6感受态效率不会太高，做一般克隆和质粒转化的要求可以适当放低。
菌体时刻保持冰上（4 o C以下）！尽量减少离开冰的时间。
最后分装的菌体浓度要浓。
对待菌体要尽量轻柔。
收集菌体用的管和枪头要灭菌，并在超净台操作。
电击转化1.75 μL的感受态细胞加入TE溶解的质粒和连接产物最好不要超过0.6 μL，不然容易击穿，如果质粒是用纯水溶解的可以适当提高，冰上放置10~30 min；2.洗干净并烘干的电转杯冰上预冷，快速将上述感受态细胞转到电转杯里，感受态细胞要位于杯子底部；3.此步骤动作要快：将杯子外壁擦干，2 mm的杯子用电转化程序Ec2，1 mm杯子用电转化程序Ec1，电击后立即加入900~1000 μL37o C预热的SOC（见分子克隆），轻柔吸打，转到2 mL的离心管中，37o C摇床，150 rpm，45~60 min后取适量涂平板。
大肠杆菌基因工程 (2)
大肠杆菌基因工程引言大肠杆菌(Escherichia coli)是一种广泛存在于自然界中的革兰氏阴性菌，它可以在动植物肠道中找到。
由于其生长快速、易于培养和转化，大肠杆菌成为了基因工程研究中最重要的模式生物之一。
大肠杆菌基因工程是通过改变大肠杆菌的遗传特征，实现对其功能的改造和优化，从而达到生产特定产物或解决特定问题的目的。
大肠杆菌基因工程的原理基因传递与插入大肠杆菌基因工程的核心在于将目标基因导入到大肠杆菌中。
目前常用的方法有以下几种：1.转化(transformation)：通过将外源DNA直接导入大肠杆菌细胞内，使其在细胞内复制和表达。
2.电转化(electroporation)：利用强电场将质粒DNA引入细胞内，使其与大肠杆菌细胞内的DNA重组。
3.病毒介导的转染(viral-mediated transduction)：使用病毒载体将目标基因导入大肠杆菌细胞内。
4.转座子介导的DNA转移(transposon-mediated DNAtransfer)：利用转座子将目标基因插入到大肠杆菌染色体的特定位点上。
基因表达与调控在大肠杆菌基因工程中，外源基因导入之后需要进行表达和调控，以产生所需的受体蛋白或产物。
常用的表达系统包括启动子-启动子区域-编码序列-终止子的结构。
其中，启动子可以选择适当的促进剂或抑制剂进行调节，以控制基因的表达水平和时机。
应用案例生物医药领域在生物医药领域，大肠杆菌基因工程被广泛应用于生产重组蛋白药物。
通过引入外源基因，大肠杆菌可以高效地合成重组蛋白，并通过分离和纯化得到高纯度的药物。
例如，利用大肠杆菌表达系统，可以生产出重组人胰岛素、生长激素等重要药物。
环境治理领域大肠杆菌基因工程还可以应用于环境治理领域。
例如，通过改造大肠杆菌的基因组，使其具有降解有机污染物的能力，可以用于处理工业废水和土壤污染。
此外，大肠杆菌的工程还可以用于制造生物能源，例如利用大肠杆菌产生生物柴油或生物氢。
将重组质粒导入大肠杆菌的方法
将重组质粒导入大肠杆菌的方法
将重组质粒导入大肠杆菌有多种方法，其中包括化学转化、电转化和共转化等。
1. 化学转化：通过将重组质粒与大肠杆菌细胞一起暴露在一种化学溶液中，使细胞发生渗透增强，从而使质粒能够进入细胞。
常用的化学转化方法有钙离子诱导法、聚乙二醇法等。
2. 电转化：通过利用强电场作用，使质粒能够通过细胞膜进入细胞。
将含有重组质粒的细胞与电极片一起置于电场中，施加脉冲电压，使细胞膜发生破裂，从而实现质粒的导入。
3. 共转化：将含有重组质粒的细胞与另一种质粒（例如载带质粒）一起转化，使质粒通过共转化机制进入细胞。
在共转化过程中，载带质粒的存在可以提高重组质粒的转化效率。
以上是常用的将重组质粒导入大肠杆菌的几种方法，具体使用哪种方法取决于实验需求和条件。
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大肠杆菌基因电转化(1)
(制剂范围可以放大或缩小）
感应态菌制备
培养液和制剂：
-无任何抗生素及含有氨苄青霉素/ carbnicillin或其他适当抗生素的LB平板
-2×LB或YT培养基500毫升
-SOC培养基
-冰冷的高压灭菌去离子水：1000毫升
-冰冷的高压灭菌10 ％甘油（500毫升）
-预冷却的50ml离心管，离心管和电转移杯。
方法：
1．从一个新鲜的琼脂平板上接种单个大肠杆菌单菌落到含有5ml的2 ×YT培养基的烧瓶中。
孵育培养5小时或过夜，于37℃和250rpm旋转振荡器培养。
2 。
用5ml过夜的细菌培养物接种到在2升烧瓶中500毫升预热的2 ×YT培养基中。
于37℃搅拌下（250转的旋转振荡器）。
一个小时以后，每20分钟测定OD600值。
3 。
当培养物的OD 600达到0.2.5-0.3 ，迅速将烧瓶转移到冰水浴中15-30分钟。
偶尔转动培养瓶以确保冷均匀。
4 。
转移培养物至50ml冰冷的离心瓶。
在4500rpm和在2 ℃下离心10分钟，收获细胞倒出上清液和重悬细胞沉淀在50毫升冰冷的纯水并在2 ℃下孵育3分钟。
5 。
通过在2 ℃下离心10分钟收获细胞（4500rpm）, 倒出上清液和重悬细胞沉淀在50毫升冰冷的纯水中并孵育3分钟。
6 。
通过在2 ℃下离心15分钟收获细胞（4500rpm），倒出上清液和重悬细胞沉淀在25毫升冰冷的10％甘油中。
7 。
通过在2 ℃下离心15分钟收获细胞（4500rpm），倒出上清液和重悬沉淀在10毫升冰冷的10 ％甘油。
8 。
通过在2 ℃下离心15分钟收获细胞（4500rpm），小心地倒出上清液，并使用巴斯德吸管残余水滴。
合并和重悬沉淀于1毫升冰冷的10 ％甘油。
9 。
测量1:100稀释的细胞悬浮液的OD600值：用冰冷的10％甘油稀释细胞悬液，然后测定。
浓度应是2× 1011到3× 1010个细胞/ ml 〜OD = 800 -120 （1.0 OD 600 =约2.5× 108细胞/ ml）。
10 。
转移40微升的悬浮于冰冷的电穿孔杯中（0.1厘米间隙）并放电施加是否发生电弧（请参阅下文第12到18步）。
如果是这样，用冰冷的10％甘油洗涤的细胞悬浮液的剩余部分再次，以确保细菌悬浮液的导电率足够低（<5毫当量）。
11 。
如无电弧发生，就进行存储，分配所述40微升细胞悬浮液等份放入无菌的，冰冷的0.5 - ml离心管，并立即转移到-80 ℃的冰箱中。
12 。
加入10毫微克，容积不超1-3微升DNA 到每个离心管，并在冰上孵育管60秒或以上。
包括所有适当的阳性和阴性对照。
质粒量为细胞体积不能达到十分之一。
13 。
设置电转仪提供的电容25μF ，2.5千伏和200欧姆电阻的电脉冲。
14 。
转移DNA /细胞混合物倒入冷电比色皿，并确保细菌和DNA的悬浮坐在试管的底部。
干燥凝结和湿气的反应杯的外侧。
将试管中的电穿孔设备。
15 。
在上面设置中，释放一个4-5毫秒脉冲电力。
12.5千伏/厘米的探测或磁场强度的时间常数应该在屏幕上显示。
16 。
尽可能快的脉冲后，取出电穿孔杯，在室温下, 加入0.5 ml SOC培养基。
17 。
将细胞转移到一个含有0.5毫升SOC的17 ×150毫米的聚丙烯管中，于37℃下慢转动（250转）培养1小时. 18．涂0.5hml 培养液`于抗菌素LB板上,370C下隔夜培养, 检测转化效率.
cDNA质粒文库扩增
培养液和制剂：
-质粒文库培养基：
混合200毫升2xLB （pH值7.0 ）+ 0.4 ％超低胶凝温度的琼脂糖（SeaPrep品牌或其他）并分发50毫升于各200毫升烧杯中。
高压灭菌后，允许LB +琼脂糖冷却至50℃，并添加氨苄青霉素（或其他抗菌素），50微克/毫升，放置在37℃，并直至加入细胞。
-质粒文库培养板(选择性)：4 x150mm 含有抗菌素的LB’平板
方法：
1. 加3微升的DNA 到冰冷40微升电感受态管中（菌落应10倍高浓度高于所需DNA）的管中。
2. 转移混合物到已在冰中0.1厘米电反应杯（已冷却了5分钟）. 混合后，并在使用前并且擦干反应杯面上的冰和水。
3。
调节电转仪到25 μF ，200欧姆，2.5千伏.
4. 在上面设置中，释放一个4-5毫秒脉冲电力。
12.5千伏/厘米的磁场强度（应该在屏幕上显示）；电穿孔后，然后立即加1毫升SOC培养基，并转移到含有1毫升的15毫升培养管和在37℃培养1小时。
(5. （选择性），混合10μL培养液和90微升SOC，并涂板（LB + AMP），在37℃孵化过夜。
第二天，计数菌落每个平板，并确定其中的DNA稀释给出菌落的期望数目。
)
6. 总库扩增：加入约480-500微升细胞到各个含有LB-抗菌素- 琼脂糖的50毫升培养基，( 或加入约480-500微升细胞到各个含有抗菌素的150 mm LB’平板)
7. 将每个已经加了培养液的烧杯放在在冰水桶中一小时左右，让琼脂糖凝固。
8. 仔细转移到37℃培养箱，没有任何晃动。
9. 培养两个晚上（44-48小时），应该看到的小菌落悬浮在LB +琼脂糖。
确定菌落会下沉到试管底部(均相性)。
10.使用中量质粒试剂盒纯化质粒
a）倒入50毫升培养物的内容放到离心管..
b）6000rpm的转速在4℃旋转20分钟。
c）仔细取去上层琼脂糖层。
d）加相同体积蒸馏水。
e）旋转15分钟8000转。
f）移除上清液，重悬每管并进入下一个步骤。
质粒保存-80，。