2010年版中国药典微生物培训菌种的保藏和管理
药典2010 通则
生物制品分装和冻干规程
• 二、分装、冻干用容器及用具
•
2010年版：分装容器的灭菌处理工艺应经验证并确
保达到灭菌效果。
•
2005年版：玻璃容器至少经高压蒸汽121℃灭菌1 小时，或干热180℃灭菌2小时，或以能达到同样效果的 其他灭菌方式处理，不得有玻璃碎片脱落和碱性物质析出。
生物制品分批规程
• 变更内容
• 2. 生物制品批号的编号和亚批号程
• 4. 批、亚批及批号确定的原则
•
成品批号应在半成品配制后确定，配制日期即 定为生产日期。非同日或同次配制、混合、稀释、 过滤、灌装的半成品不得作为一批。
•
单一批号的亚批编制应仅限于以下允许制定亚 批的一种情况：
《中国药典》2010年版三部 通则
QA室 2010年02月10日
生物制品生产检定用菌毒种管理 规程
一、总则
• 第一条 菌毒的分类
2010年版要求“菌毒种按《人间传 染的病原微生物名录》为基础分类” 2005年版要求“菌毒种按《中国医 学微生物菌种保藏管理办法》第二条分类”
一、总则
• 第三条
新增内容 “应规定各级种子批允许传 代的代次，并经国务院药品监督管理部门 批准”。
定分装时间，最长不超过24小时。”
• 2005年版： 2. “同一容器的制品应当日分装完毕。”
生物制品包装规程
一、总则
3. 已分装或冻干后制品，经质量保证部门（05年版 为质量检定部门）检定合格和综合审评，对符合质量标准 者发出包装通知单后，方可进行包装。 四、包装 其中提到两处”由质量保证部门发放包装通知单”
• 五、待分装之半成品的规定
• 2010年版：1. 除另有规定外，半成品自配制完成至分装
检定菌保存、传代、使用、销毁标准操作规程
检定菌保存、传代、使用、销毁标准操作规程1．目的：规范药品微生物学检定用菌的管理，最大限度降低变异率，确保菌种的溯源性与稳定性，从而确保微生物学检验结果的准确可靠。
2．依据：ChP2010版（一部）、《中国药品检验标准操作规范》（2010年版）。
3．范围：本规程适用于检定用菌种的管理，包括菌种的申购、保存、传代、使用及销毁等。
4．责任:4.1.QC主管负责菌种的申购、接受、保存、分发.4。
2.微生物检验员负责菌种的确认、传代、使用及销毁。
5.相关文件及术语：5.1．术语标准菌种是指由中国药品生物制品检定所医学微生物菌种保藏管理中心提供的冷冻干燥菌。
传代用菌种是指用标准菌种制备的采用特定保存方法长期固定保存的菌种，用于传代及制备工作用菌种.工作用菌种是指用标准菌种或传代用菌种接种至普通琼脂斜面培养后,作为日常工作使用的菌种。
菌种的代是指将其接种至一新鲜培养基上或培养基内，每萌发一次即称为一代,从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌种为第0代。
6.标准：6.1．检定菌的申购QC主管每年根据检定菌种的使用情况(包括临时检验需要），提出购买计划，交由质量管理部部长审批后，向中检所菌种保藏中心或省（市）药检所购买冻干菌种(标准菌种);也可以直接向省（市）药检所购买传代用菌种，购买时，需询问与确定菌种的代数，以便传代时控制代数。
6.2．检定菌的接收菌种到达实验室后,由QC主管接收菌种，检查其名称和数量，以及每一支的完整性，同时将菌种的所有信息，填写在《检定菌接收记录》（附表1）上,内容包括：名称、数量、编号(无编号者按检定菌种的编号原则编号)、代数、来源、接收日期、接收人等，并将其暂贮存于4～8℃冰箱中,在一周内必须完成转种。
6。
3．检定菌的保存6.3。
1．工作用菌种的保存工作用菌种采用斜面低温保存法.将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上，待菌生长充分以后，转移至4~8℃冰箱中保存.此法仅用于工作用菌种的短期保存，并应随时检查其污染杂菌和变异等情况,发现异常情况，经应灭活处理后销毁。
检定菌保存、传代、使用、销毁标准操作规程
检定菌保存、传代、使用、销毁标准操作规程1．目的：规范药品微生物学检定用菌的管理，最大限度降低变异率，确保菌种的溯源性与稳定性，从而确保微生物学检验结果的准确可靠。
2．依据：ChP2010版（一部）、《中国药品检验标准操作规范》（2010年版）。
3．范围：本规程适用于检定用菌种的管理，包括菌种的申购、保存、传代、使用及销毁等。
4．责任：4.1.QC主管负责菌种的申购、接受、保存、分发。
4.2.微生物检验员负责菌种的确认、传代、使用及销毁。
5.相关文件及术语：5.1．术语标准菌种是指由中国药品生物制品检定所医学微生物菌种保藏管理中心提供的冷冻干燥菌。
传代用菌种是指用标准菌种制备的采用特定保存方法长期固定保存的菌种，用于传代及制备工作用菌种。
工作用菌种是指用标准菌种或传代用菌种接种至普通琼脂斜面培养后，作为日常工作使用的菌种。
菌种的代是指将其接种至一新鲜培养基上或培养基内，每萌发一次即称为一代，从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌种为第0代。
6.标准：6.1．检定菌的申购QC主管每年根据检定菌种的使用情况（包括临时检验需要），提出购买计划，交由质量管理部部长审批后，向中检所菌种保藏中心或省（市）药检所购买冻干菌种（标准菌种）；也可以直接向省（市）药检所购买传代用菌种，购买时，需询问与确定菌种的代数，以便传代时控制代数。
6.2．检定菌的接收菌种到达实验室后，由QC主管接收菌种，检查其名称和数量，以及每一支的完整性，同时将菌种的所有信息，填写在《检定菌接收记录》（附表1）上，内容包括：名称、数量、编号（无编号者按检定菌种的编号原则编号）、代数、来源、接收日期、接收人等，并将其暂贮存于4～8℃冰箱中，在一周内必须完成转种。
6.3．检定菌的保存6.3.1．工作用菌种的保存工作用菌种采用斜面低温保存法。
将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上，待菌生长充分以后，转移至4～8℃冰箱中保存。
此法仅用于工作用菌种的短期保存，并应随时检查其污染杂菌和变异等情况，发现异常情况，经应灭活处理后销毁。
2010版药典微生物限度检查法及指导原则培训
无
增加贴膏剂供试液制备 增加贴膏剂供试液制备 贴膏剂供试液 取规定量供试品，去掉贴剂的保护层， 取规定量供试品，去掉贴剂的保护层，放置 在无菌玻璃或塑料片上，粘贴面朝上。 在无菌玻璃或塑料片上，粘贴面朝上。用适 宜的无菌多孔材料（如无菌纱布） 宜的无菌多孔材料（如无菌纱布）覆盖贴剂 的粘贴面以避免贴剂粘贴在一起。 的粘贴面以避免贴剂粘贴在一起。然后将其 置于适宜体积并含有灭活剂（如山梨酯80 80或 置于适宜体积并含有灭活剂（如山梨酯80或 卵磷脂）的稀释剂中，用力振摇至少30 30分钟 卵磷脂）的稀释剂中，用力振摇至少30分钟 或以其它方法制备成供试液。 ，或以其它方法制备成供试液。
细菌、 4、细菌、霉菌及酵母菌计数
---计数培养基的适用性检查 ---计数培养基的适用性检查
CP2005 无 CP2010 结果判断 被检培养基上的菌落平均数与对照培养基上的菌落平均数的比值大 70%，且菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致， 于70%，且菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致，判该培养 基的适用性检查符合规定。 基的适用性检查符合规定。
CP2010
接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂 斜面培养基中，培养5 加入3 斜面培养基中，培养5～7天，加入3～ 0.05％（v/v）聚山梨酯80 ％（v/v 80的 5ml 含0.05％（v/v）聚山梨酯80的0.9% 无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后， 无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，用 适宜方法吸出孢子悬液至无菌试管内 至无菌试管内， 适宜方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用 0.05％（v/v）聚山梨酯80 0.9%无菌 ％（v/v 80的 含0.05％（v/v）聚山梨酯80的0.9%无菌 氯化钠溶液制成每1ml含孢子数50～ 制成每1ml含孢子数50 氯化钠溶液制成每1ml含孢子数50～100 cfu的孢子悬液。 cfu的孢子悬液。 的孢子悬液 菌悬液在室温下放置应在2小时内使用， 菌悬液在室温下放置应在2小时内使用， 若保存在2 8℃可以在24小时内使用 可以在24小时内使用。 若保存在2～8℃可以在24小时内使用。 黑曲霉孢子悬液可保存在2 8℃， 黑曲霉孢子悬液可保存在2～8℃，在验证 过的贮存期内使用。 过的贮存期内使用。
2010版中国药典培训回答（第4部分：菌种传代与特定菌检测）
2010版中国药典培训回答（第4部分：菌种传代与特定菌检测）2010版中国药典培训回答（第4部分：菌种传代与特定菌检测）广东省药检所对《中国药典》2010版微生物专题培训班的有关问题解答答案。
1.以第五代菌做阳性对照，实验过程中的接种按药典应该也算传代，那是否算是第六代菌呢？答：依然算第五代(接种的菌株算第5代，培养后算第6代)答：其实验结果是算哪一代菌的？答：见上题2.药典规定只能传代五次，此次实验结果是否有效？答：有效3.现在有无对照菌种可以购买？联络电话？答：省药检所业务科销售药典规定的标准菌株，为第二代甘油冻存管，电话：020-********4.菌种发放单应包括什么信息？答：根据自己工作的需要，大致包括：菌种名称，编号，来源，接收日期，接收人等。
5.如何检查黑曲霉孢子悬浮液孢子含量为50~100个／ml。
铜绿假单胞菌单菌如果用甘油冷冻管，也是低温，是否也会影响它的活性？应如何保存？答：可用玫瑰红钠琼脂培养基或改良马丁琼脂来确定黑曲霉孢子悬浮液。
铜绿假单胞菌应使用最终甘油浓度为20%的甘油冻存管保存，保存在-30℃或更低温度，则可保持其活性。
若是斜面或营养肉汤，建议室温保存。
6.工作菌株，25℃下可连续使用一周，这里的工作菌株是指原液还是制备好的菌悬液。
为何工作菌株不低温存放，而是25℃？答：首先要说明，所有的操作应按药典要求来操作，这里的工作菌株指原液，工作菌株建议在2-8℃保存，但要注意的是，铜绿假单胞菌的工作菌液不能低温保存，低温会损伤其活性。
由于笔误，写成了25℃，请更正为2-8℃。
7.简单方便的厌氧培养方案？答：硫乙醇酸盐培养基；固体培养基的话可考虑使用一次性厌氧袋。
8.甘油冻存管一定要－30℃吗？0℃以下不可以吗？答：详见《中国药品检验标准操作规范》2010版341页。
我们的甘油冻存管保存在-30℃。
8.三糖铁斜面穿刺会断层，这是为什么？答：产气菌产气使培养基断层，或培养基本身质量问题。
微生物菌(毒)种保藏及管理
微生物菌（毒）种保藏及管理文章编号：1004-9231(2007)02-0087-02在微生物检验及研究工作中经常使用菌（毒）种。
菌（毒）种是一种重要的生物资源。
菌（毒）种保藏不仅有利于重现已经做过的实验，证实发现新的菌（毒）种，而且也是研究、推广、开发和实际应用科研成果的基础。
保藏的菌（毒）种有的是开发利用的对象，有的是悉心研究的成果，有从自然界分离得到的，有经生物技术修饰改造获得的，都是有着极大的研究价值和开发利用的潜力［1］。
因此，菌（毒）种的保藏工作至关重要。
菌（毒）种保藏和管理是微生物工作者普遍关注的问题，它要求菌（毒）种在保藏和管理过程中不死亡，不被污染，并保持较高的存活率及遗传稳定性，以便长期使用。
1 菌（毒）种保藏［2］菌（毒）种保藏就是对活体微生物群体进行有效的保藏。
保藏方法有20多种，从总体上可分为4大类：传代法、干燥法、冷冻法和冷冻干燥法［1］。
无论哪种方法，其原理都是创造一个抑制细胞代谢的环境，如低温，干燥，缺氧，营养缺乏等。
简易的方法有定期移植法、液体石蜡法、无菌蒸馏水法、硅胶干燥法、玻璃或瓷珠干燥法、滤纸法、麸皮法、沙土管法等。
不同类型或不同种属的菌（毒）种可根据生理特性选用不同的保藏方法。
如产芽孢或孢子的菌种适用于干燥法，无抗逆性结构的细胞如酵母菌或某些种属的细菌可用定期移植法和液体保藏等方法。
目前公认的长期保存微生物菌（毒）种的较安全、可靠的方法是冷冻法和冷冻干燥法，而其中制备和保存生物材料的最佳方法是冷冻干燥法，此法适用于大多数微生物菌（毒）种的保藏，因为它适用于大多数细胞结构的特点、生存环境及其生理状态，能满足微生物细胞结构和功能的统一性。
其基本原理是运用干燥、低温和隔绝空气的手段，降低细菌（或病毒）新陈代谢的速度，使细菌（或病毒）的生命活动处于半永久性休眠状态，以达到长期保藏的目的［3］。
另外，保藏效果良好的还有液氮保藏法等。
2 保藏方法菌（毒）种的保藏是微生物检验、教学科研和有关生产单位的一项重要工作［4］。
中国药典2010年版二部及菌种使用说明书
依据: 中国药典2010年版二部及菌种使用说明书1.标准菌的来源标准菌株由中国药品生物制品检定所医学菌种保藏中心（China Medical culture collection , CMCC）提供的冷冻干燥菌种（0代）或由上级药检部门已接种好的菌种斜面（3代）。
黑曲霉的0代菌种为保存于含15%甘油的0.9%无菌氯化钠溶液中的孢子悬液冷存管。
中国药品生物制品检定所医学微生物菌种保藏管理中心提供的冷冻干燥菌种的标签CMCC（B）代表细菌（bacteria）,CMCC(F)代表真菌（fungi）每种菌具有固定的代号。
2.标准菌的验收从菌种保藏中心购买的原始菌种管是玻璃安瓿装的冻干菌，接收同时应检查是否有随菌种附有的相关资料。
接收菌种时应检查安瓿的数量和名称，和每一支安瓿的完整性。
在相应的菌种接收记录上记上所有的关于菌种的信息，如名称、数量和接收日期等。
在菌种安瓿及菌种管上粘贴标签，内容包括：菌种名称、菌种代号、代次、接收日期、接收人、贮存条件、有效期至。
新购入的0代原始菌种储存于－20℃，有效期为三年。
从上级药检部门购买的已接种好的菌种斜面（3代）应检查菌种管是否完好。
储存于2～8 ℃，有效期为3个月。
3. 标准菌的复苏、复壮及标准储备菌株的制备3.1物品及试剂：接种针、酒精灯、移液管、75%酒精及75%酒精棉球3.2培养基改良马丁琼脂培养基:用于黑曲霉复苏、复壮.液体硫乙醇酸盐培养基:用于生孢梭菌复苏、复壮.营养肉汤培养基:用于金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌、短小芽孢杆菌、铜绿假单胞菌复苏、复壮。
改良马丁培养基:用于白色念珠菌复苏、复壮.3.3操作步骤：a.打开洁净工作台。
b.在安瓿的外表面用75%的酒精擦拭并让其自然风干。
c.用一小砂轮在安瓿的上部划一条线，用手轻轻将安瓿掰开（开启安瓿时必须小心，因为安瓿遇热时可能会破裂）。
d.以无菌方法用一无菌吸管从已准备好的上述液体培养基中移取0.5～0.8 ml到安瓿中。
【精品】菌种的管理和保藏完整版
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菌种的传代和使用
• 冻干菌种（0代）
↓
• 增菌液培养（1代）
•
↓
• 增菌液培养（2代） → 分装冷冻保存
•
↓
• 增菌液培养
• 适宜的斜面培养基 → 使用
• 工作菌株（3传代（4代） → 冷冻保存
•
↓
• 工作菌株传代（5代） → 冷冻保存
• 如使用蛋白胨、甘油水，可取各代的斜面培养物，加入培养基中，在规 定条件培养后冷冻保存。
菌种保藏的重要性
菌种保藏是微生物学检验工作中的一项常规技 术，菌种的科学保藏和管理直接关系到检验结 果的正确性。
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菌种的来源
国内或国外认可的菌种收藏机构的 标准菌株，或使用与标准菌株所 有相关特性等效的商业派生菌株。
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菌种保藏的中心任务
- 广泛收集各种有用的微生物菌种。 -选择最适宜的保藏方法。
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菌种的保藏
工作菌株不可代替标准菌株，标准菌株的商业衍 生物仅可用作工作菌株。
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菌种的保藏
不同的微生物，应根据其生物特征来选择最适宜的 保藏方法，菌种的保藏方法一般分四个阶段：
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菌种的保藏
⑴ 挑选特征典型的纯菌菌落。 ⑵确定保藏的合适菌体形态，孢子和芽 孢死亡代谢作用弱，同时对恶劣环境 有很强的抵抗力。 ⑶选择最适宜的方法。 ⑷定期对保藏的菌种进行鉴定，确定保 藏方法的有效性。
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常用菌种保藏方法
菌种保藏的原则 根据微生物菌种的生理、生化特性 降低微生物细胞的代谢强度。
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工作菌株不可代替标准菌株，标准菌株的 商业衍生物仅可用作工作菌株。
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不同的微生物，应根据其生物特征来选择最 适宜 的保藏方法，菌种的保藏方法一般分 四个阶段：
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⑴ 挑选特征典型的纯菌菌落 ⑵确定保藏的合适菌体形态 ⑶选择最适宜的方法保藏 ⑷定期对保藏的菌种进行检查
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细菌的接种、分离和培养
接种、分离、培养是微生物学实验 的基本
作技术，要求严格的无菌操作和在 无菌环境下进行。
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常用培养基种类 斜面接种
半固体培养基 液体培养基 平板培养基
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接种方法 涂布法 划线法 穿刺法 直接加入法等
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分离：
分段划线法、连续划线法、涂布分 离法、倾注分离法等。
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菌悬液的制备与保存
菌悬液的制备与保存 采用经验证的方法制备菌悬液，除另有规定外，微生物限 度试验用菌悬液应按《中国药典2019年版》规定制备
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养物的制备应按供 应商提供的说明或按验证的方法进行。 标准储备菌株-从国内、外菌种收藏机构 获得的标准菌株经复活并在适宜的培养基 中生长后,既为标准储备菌株。
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低温、干燥、缺氧、缺乏营养等环境条件 都可以抑制微生物的代谢和生长繁殖，因 此低温、干燥和真空是菌种保藏的重要手 段。
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培养 ：接种后的培养基，根据不同微生物
生长条件的要求，置培养基于适宜微生物生 长的环境中，使其生长繁殖的过程。 需气培养法 厌氧培养法
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培养后微生物的生长判断 固体培养基 液体培养基
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菌种的传代和使用 菌液的制备和使用
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菌种保藏机构
中国菌种保藏管理委员会（CCCCM） 成立于1979年。下设7个菌种保藏管理中
心及有关专 业实验室，共12个单位实行统一领导，按
专业分工管理。 国外的菌种保藏机构
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常用菌种保藏方法
菌种保藏的原则 根据微生物菌种的生理、生化特性， 在人工创造的条件下尽量降低微生物 细胞的代谢强度，使细胞基本上处于 休眠状态，生长繁殖受到抑制但由不 至于死亡，以减低菌种的变异率。
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2、实验室必须建立菌种保存和使用文 件化的程序管理制度. 3、菌种应冷藏或冷冻保存，保存菌种的 冰箱不得放置食品和易挥发性药品，放 置菌种的专门冰箱，应上锁管理。
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4、应由专人按操作规程和有关要求定期进 行传代，并定期对保存的菌种进行检查， 一般每年1～2次，（或定期更换栋干菌 种）。
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二、菌种的传代和使用
工作菌种的传代次数应严格控制，不得超过5 代，（从菌种保藏中心获得的标准菌株为第0 代）防止过度的传代造成菌种变异。1代是指 将活的培养物接种到新鲜培养基中，任何亚 培养的形式均被认为是转种或传代一次。必 要时，实验室应对工作菌株的特性和纯度进 行确认。
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三、菌种的检查与复壮
菌种的衰退 菌种经过长期人工传代培养或保藏，由自发突 变的作用而引起某些优良特性变弱或消失的 现象。
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控制菌种的衰退方法 ⑴控制传代次数 ⑵创造适宜的培养条件 ⑶用不同类型的细胞进行传代 ⑷采用有效的保藏方法
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定期检查
菌种在保藏期间必须定期检查，发现变 异或衰退，应及时给予恢复。
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菌种保藏是微生物学检验工作中的一项 常规技术，菌种的科学保藏和管理直接 关系到检验结果的正确性
试验菌种应是从国家菌种中心获得的标 准菌种，经过实验室复活并在适宜的培 养基中生长后保存.
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4
菌种保藏的中心任务是广泛收集各种
有用的微生物菌种，选择最适宜的保藏 方法，避免在保藏和传代过程中死亡、 变异、衰退及活力减弱，以保持菌种原 有的各种生物学特性，从而达到保证研 究、检验、交换和使用要求的目的。
菌种的保藏和管理
2019年06月
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菌种保藏
微生物实验过程中，实验菌株可能是最敏感 的，因为它们的生物活性和特性依赖于合适 的试验操作和贮藏条件。
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实验室菌种的处理和保藏的程序应
标准化，使尽可能减少菌种污染和 生长特性的改变。按统一操作程序 制备菌株是微生物试验结果一致性 的重要保证。
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详细记录 菌种的来源、接收、传代、分离、复壮、使用和鉴 定等均应做好详细记录。包括菌种传代或使用时间、 名称、菌号、代数、传代或保存形式、分离复壮方 式、使用内容、鉴定情况等都应进行详细的记录。
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菌种不得随意带出实验室，外单位索取、购 买应由登记，并包装严密。 菌种处理应严格按操作规程进行，灭菌处理 应有详细记录。
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菌种的复壮 使衰退的菌种重新恢复原来的优良特性的 过程。实验室主要采用分离纯化的方法。
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四、菌种的管理
1、使用菌种的单位，应具备从事微生
物工作的条件和设备。 菌种应由专人负责管理，管理人员应 具有微生物专业知识和技术水平，并应 具有较强的责任心。
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