生物工艺学第三章 基因克隆载体

与pBR322区别：乳糖操纵子的一个DNA片段（lac Z`基因）替 换Tcr基因；组装了一个多克隆位点（MCS）连杆 命名p UC——University of California的科学家首先构建。 图3-3。

pUC包括四个组成部分：
（1）pBR322的复制起点(ori) （2）Apr基因，但DNA序列发生变化，不再含原来限制性核酸内 切识别位点 （3）lacZ`基因 （4）在lacZ`基因 内部靠近5`端有一段MCS连杆
（3）MCS区方便转移外源DNA在不同载体系列中
Байду номын сангаас
“穿梭”，使具有两种不同粘末端的外源
DNA 能直接克隆入p UC载体
（二）蓝藻质粒克隆载体pPKE2的构建 大肠杆菌质粒不能转化蓝藻 构建穿梭质粒 蓝藻内的质粒属隐蔽质粒
即：大肠杆菌源质粒复制起始点 + 蓝藻源质粒复制起始点。
pPbs（1511bp） ClaⅠ 重组 pPbs pPRS-1 多次亚克隆 pPKE-2 ↑ pBR322 组装CaMV35s启动子、MCS、rbcS终止子、Kmr基因 （图3-5）

λ噬菌体基因组的结构

在λ噬菌体线性双链 DNA分子的两端，各有一条由12个核苷酸 组成的彼此完全互补的5′单链突出序列，即通常所说的粘性末 端。 注入到感染寄主细胞内的λ噬菌体的线性DNA分子，会迅速地 通过粘性末端之间的互补作用，形成环形双链DNA分子。 随后在DNA连接酶的作用下，将相邻的5′-P和3′-OH基团封闭 起来，并进一步超盘旋化。这种由粘性末端结合形成的双链区 段称为cos位点（略语cos，系英语cohesive-end site的缩写，即 粘性末端位点之意）
3、 限制性核酸内切酶位点: 56种
4、 λ噬菌体的生长途径
溶菌生长途径
溶原生长途径→某种胁迫条件下→合成six 基因产物→λ DNA脱离细菌染色体→溶菌
（二）构建依据
1、λ噬菌体是一种温和噬菌体 2、能承载较大的外源DNA片段 λDNA头部可包装约36.4～51kb(自身的75%～105%)， 且约有20kb λDNA可缺失（生长非必需） 3、在λDNA上有多种限制性内切酶位点
意义：基因工程随载体系统的建立而兴起，构建新载体一直是基
础研究的优先领域。
分
类
按克隆载体的来源分： 质粒～ 病毒或噬菌体～ 质粒与病毒或噬菌体DNA组成的～ 质粒与染色体DNA片段组成的～
按应用范围分： 表达型～ 启动子探针型～ cDNA ～ 按应用对象分： 原核生物～ 植物～ 动物～
３ .１
定义：

2、λ噬菌 体基因组 有基因50 个以上
λ噬菌体DNA的复制

在λ噬菌体感染的早期，环形的λ DNA分子按θ 形式从双向进行复制。 到了感染的晚期，控制滚环复制机理的开关被 启动了，合成出了由一系列线性排列的长多连 体分子。

λ噬菌体DNA的转录与转译




在溶菌周期，λ噬菌体DN A的转录是在三个时 期，即早期、中期和晚期发生的。 大体的情况是，早期基因转录确立起溶菌周期； 中期基因转录的结果导致 DNA进行复制和重组； 晚期基因的转录最终使DNA被包装为成熟的噬 菌体颗粒。
4、pBR322衍生的质粒
缺失bom位点→ pBR325、 pBR327，不具被动迁移作用 再移去HaeⅡ片段→pAT153 均更安全

Lac Z`筛选机制：
含乳糖操纵子的启动子、调节因子和 β-半乳糖苷酶的N端146残基(α-肽) 合成有活性的
基因（lac Z`）的质粒载体引入可编
码C端部分残基的宿主(与Lac Z`互补 的大肠杆菌)
复制 (Replication)
质粒的复制起始和拷贝数是由质粒DNA序列控制 的。质粒分子中为质粒复制所必需的最小区段称为 基本复制子，它由两部分组成，一是复制原点 (ori) ， 二是调节复制起始的基因（编码蛋白质或RNA)。
复制强度：拷贝数（细胞内质粒与染色体数量之比值） （１）每种质粒在其宿主细胞内的拷贝数相对稳定 严紧控制型：1~数个拷贝；大质粒 松驰控制型：10个以上拷贝；小质粒。 经氯霉素处 理，宿主中质粒大量扩增（如ColE1拷贝数达3000个）。
４、分子尽可能小（转化率高），＞15kb，转化率↓↓
５、组装各种“元件”，如启动子、终止子等
三、质粒载体构建

过程：严密的实验设计→构建（切割、修饰和连接重组）

构建原则
1、选用合适的出发质粒：含必备的元件，如ori、选择标记、克隆位点、启 动子和终止子
2、正确获得构建质粒克隆载体的元件
3、组装合适的选择标记基因 4、选用合适的启动子
（三）构建的基本策略与技术路线（P54）

策略: 切去部分非必需区，删掉多余的限制性内切酶 位点，插入选择性标记基因，建立体外包装系统。
λ噬菌体载体的构建及其主要类型

插入型载体（insertion vectors），只具有一个 可供外源DNA插入的克隆位点。 替换型载体（rePlacement vectors），具有成对 的克隆位点，在这两个位点之间的 DNA区段可 以被外源插入的 DNA片段所取代。
2、构建途径
（1）取代型载体。
用大肠杆菌质粒克隆载体 取代Ti质粒的全部或部分
T-DNA序列而构建。外源基
因以同源交换而重组。 Onc- Ti：T-DNA上的
onc基因被取代而构建。
Onc+ Ti：pBR322取代 T-DNA的部分序列但保留 onc基因而构建。进入植物 细胞诱发冠瘿瘤。
（2）中间质粒克隆载体 T-DNA的部分序列插入大肠杆菌质粒载体而构建。 共整合克隆载体系统（T-DNA同源序列、bom 位点） 双元克隆载体系统——微型Ti质粒


分离重组体噬菌体的基本过程

首先是使用无菌消毒的金属接种针，粘着少量 的噬菌体颗粒，转移到新鲜的细菌培养基中， 使其在感染的细胞内大量地增殖。
采用密度梯度离心法，便可非常容易地纯化出 噬菌体的颗粒。

一、 λ噬菌体克隆载体

λ噬菌体，一种大肠杆菌双链RNA噬菌体。
λ噬菌体的分子量为 31 ×106dal，是一种中等大 小的温和噬菌体。
Ｒ质粒：含有氨苄青霉素Ap、氯霉素Cm、
卡那霉素Km、四环素Tc、链霉素Sm等药物的抗 性基因，可作为选择标记。
Col质粒 Ｆ质粒 降解质粒 Ｔi质粒

隐蔽质粒 蓝藻内源质粒
二、 理想质粒载体的必备条件
１、能进行有效复制——复制起始位点（最好是多拷贝） ２、克隆位点——组装MCS连杆 ３、选择标记基因——抗性基因，Lac Z’基因
β-半乳糖苷酶
在含IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）和 X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖） 的诱导培养基上培养 在N端α-肽的编码区插入MCS
蓝色菌落
不影响lac Z`基因功能
插入外源DNA
灭活lac Z`基因
白色菌落

pUC质粒载体的优点
（1）分子量更小、拷贝数更高
（2）免疫组化法一步实现筛选鉴定重组体，省时
Ti质粒：根癌农杆菌中引发植物产生肿瘤（冠瘿瘤）的质粒，
（2）Vir区 位于T-DNA区上游，其表达产物可激活T-DNA的转移， 显示致瘤性。
（3）Con区 含有农杆菌之间接合转移有关的基因（tra)，可受宿 主产生的冠瘿碱活化，使Ti质粒在细菌间转移，也即 接合转移基因编码区。
（4）Ori区 复制起始区，调控Ti质粒自我复制。 Ti质粒克隆载体真正用于植物而非农杆菌，农杆菌只 起中介作用。
5、构建过程力求简单

代表性实例。
（一）pBR322及其衍生质粒克隆载体的构建
Ⅰ、pBR322构建

质粒载体命名法则 “pBR322” p：质粒（plasmid ) BR：两位主要构建者 322：实验编号
pSC101（最早用于DNA克隆的载体），严紧型 ColE1 松驰型 ，筛选系统复杂

构建过程(出发质粒：pMB1)
质粒克隆载体
以质粒DNA为基础构建而成的载体于载体构建
的性质
１、组成与构型 是染色体外裸露的双链DNA分 子（细菌、真菌、蓝藻、绿 藻）
l-DNA
构型： oc-DNA
２、分子大小：
100～102 kb
３、复制 特点：在宿主细胞内； 单向； 质粒和宿主细胞双重遗传系统控制
（三）农杆菌Ti质粒克隆载体的构建
故称Tumor inducing plasmid（Ti质粒）。双链环状DNA分子， 200～250kb。 1、4个功能区：T-DNA区、Vir区、Con区、Ori区 （1）T-DNA区 Ti质粒进入植物细胞的约25kb部分，即T-DNA （transfer DNA)。左右边界各有一个25bp正向重复序列（LTS和RTS）称为 边界序列，为T-DNA的转移和整合所必需。只要保留T-DNA的 边界序列，中间序列被外源DNA片段替换，仍可转移整合到植 物基因组中。 这是Ti质粒用于遗传转化的理论依据。 用野生型Ti质粒获得的转基因植物细胞只能分裂，不能分 化为植株，故不能直接选育转基因植物。
3． 2
病毒基本结构：
病毒（噬菌体）克隆载体
DNA（或RNA）+ 外壳蛋白 感染细菌的病毒，称为噬菌体。
分类（根据病毒与宿主的关系）： 温和性病毒：
溶原性增殖→构建病毒载体
烈性病毒：
溶菌性增殖→改造后

噬菌体是一类细菌病毒的总称，英文名叫做 Bacteriophage（简称 phage）。它的DNA分子除了复制 起点之外，还有编码外壳蛋白质的基因。 如同质粒分子一样，噬菌体也可以用于克隆和扩增特 定的DNA。 噬菌斑，即感染的细菌细胞被噬菌体裂解之后留下的 空斑。