粪大肠菌群的测定教学要求(精)
粪大肠菌群的测定(精)
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3 4 5
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11 14 18
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18 24 30
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8
9 10
31
36 40
1） 取水样300ml分别加入12个发酵瓶：2个含有50ml三倍乳糖发酵 烧瓶各加100 ml水样；10个含有5 ml三倍乳糖发酵管各加10 ml水样， 混匀。2） 在37℃培养24h至48 h，查看发酵结果。
接种水样各100ml
接种水样各10ml 48h不产 酸产气 水样 三倍乳糖50ml/管 三倍乳糖5ml/管 24h产酸 产气
51
60 69
161
230 >230
注：水样总量300ml（2份100ml，10份10ml），此表用于测定生活饮用水。
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3. 2 地表水中大肠菌群的多管发酵法测定
向装有5mL乳糖培养液的5个发酵管分别加入10mL水样；向装 有10mL乳糖培养液的5个发酵管分别加入1mL水样；向装有 10mL乳糖培养液的5个发酵管分别加0.1mL水样，混匀。（共 计15管总水样55.5mL）
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放在液体培 养基上培养
放在NPS上 培养
放在琼脂培 养基上培养
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2. 检测方法
① M-FC 培养基的制备、消毒。
GBT 肥料中粪大肠菌群的测定
GB/ 肥料中粪大肠菌群的测定1 范围本标准规定了肥料中粪大肠菌群的测定方法。
2 定义粪大肠菌群 fecal coliforms系指一群在℃±℃条件能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。
粪大肠菌群数为每克（毫升）肥料样品中粪大肠菌群的最可能数（MPN）。
3 设备和材料（内容略）4 培养基和试剂培养基：遵照附录A的规定。
革兰氏染色液：遵照附录B的规定（略）。
5 检验步骤样品稀释在无菌操作下称取样品g或吸取样品10mL，加入到带玻璃珠的90 mL无菌水中，置于摇床上200 r/min 充分振荡30min，即成10-1稀释液。
用无菌移液管吸取 mL上述稀释液加入到45 mL无菌水中，混匀成10-2稀释液。
这样依次稀释，分别得到10-3，10-4等浓度稀释液（每个稀释度须更换无菌移液管）。
乳糖发酵试验选取三个连续适宜稀释液，分别吸取不同稀释液mL加入到乳糖胆盐发酵管内，每一稀释度接种3支发酵管，置℃±℃恒温水浴或隔水式培养箱内，培养24h±2h。
如果所有乳糖胆盐发酵管都不产酸不产气，则为粪大肠菌群阴性；如果有产酸产气或只产酸的发酵管，则按进行。
分离培养从产酸产气或只产酸的发酵管中分别挑取发酵液在伊红美蓝琼脂平板上划线，置36℃±1℃条件下培养18h～24h。
证实试验从分离平板上挑取可疑菌落，进行革兰氏染色。
染色反应阳性者为粪大肠菌群阴性；如果为革兰氏阴性无芽胞杆菌则挑取同样菌落接种在乳糖发酵管中，置℃±℃条件下培养24h ±2h。
观察产气情况，不产气为粪大肠菌群阴性；产气为粪大肠菌群阳性。
结果证实实验为粪大肠菌群阳性的，根据粪大肠菌群阳性发酵管数，查MPN检索表，得出每克（毫升）肥料样品中的粪大肠菌群数。
附录 A（规范性附录）培养基乳糖胆盐发酵培养基蛋白胨g猪胆盐g乳糖g%溴甲酚紫水溶液m L蒸馏水1000m LpH值～制法：将蛋白胨、猪胆盐及乳糖溶解于蒸馏水中，校正pH，加入溴甲酚紫水溶液，然后分装试管，每管9mL，并放入一支倒置的小套管，高压灭菌115℃15min。
粪大肠菌群的测定
15.7mg硫代硫酸钠可去除样品中1.5mg活性氯，硫代硫酸钠用量可 根据样品实际活性氯量调整。
4 .无菌水:取适量实验用水，经 高压蒸汽灭菌20min， 备用。 5. 硫代硫酸钠( Na2S2O3.5H2O)。 (去除游离氯) 6.乙二胺四乙酸二钠(C10H14N2O8Na2 .2H2O)。 7.乙二胺四乙酸二钠溶液: ρ (C10H14N2O8Na2 .2H2O) =0.15 g/ml 称取15g乙二胺四乙酸二钠,溶于适量水中，定容至100ml,此溶液可保存 30d。 8.硫代硫酸钠溶液: ρ ( Na2S2O3.5H2O) =0.10 g/ml 称取15.7g硫代硫酸钠， 溶于适量水中，定容至100ml，临用现配。
2. 浓缩乳糖蛋白胨培养液： (此溶液用于检验大肠菌群) 按上述乳糖蛋白胨培养液的制备方法配制。除蒸馏水外，各组分用量 增加至三倍。 (即按上述配方比例三倍 (除蒸馏水外) ，配成三倍浓 缩的乳糖蛋白胨培养液)
①在何种情况下用多少三倍浓度的培养基接种？ 答：接种体积为10ml时，试管内应装入有3倍浓度乳糖蛋 白胨培养液5ml。
• 三、肯定要加塞子的，我们用的塞子是软材料 (好像是软橡胶？ 白色的，塞子中间另有一 个可以活动的塞子，能保证加塞后的试管透气，其实用什么材料不重要的。
• 四、需要的仪器设备为：生化培养箱、无菌操作台 (空气精华级别100) 、高压灭菌锅、 冰箱、干燥箱。
五、干扰和消除
1.
,能破坏微生物细胞内的酶活性，导
若接种量过高，培养液应加倍成分。这是由于样品的量大 的情况下，培养液稀释大,各种成分的相对浓度就会不足， 就不能满足细菌的生长要求，存在实验失败的概率。因此， 合理调整样品量和营养液浓度的比例需要反复实验和多组 对照。
粪大肠菌群的测定步骤
粪大肠菌群的测定1、半个月前配好初、复发酵所需培养液2、采样时用500ml 广口玻璃瓶分开采样，牛皮纸封口3、操作（1） 培养液初发酵 单倍乳糖蛋白胨培养液：蛋白胨 10 g牛肉浸膏 3 g乳糖 5 g氯化钠 5 g蒸馏水 1000ml调节PH 为7.2—7.4（NaOH ）6%溴甲基紫乙醇溶液 1 ml 充分混匀后 10ml （三倍是5ml ）分装于试管中，盖紧塞于蒸气锅中灭菌20min （0.1—0.5kpa ），冷却后于药品储存箱保存。
单月13个地表水（每个水样需10个单倍，5个三倍），2个创业（每个水样需15个单倍）。
共190个（1900ml ）单倍，65个三倍（325ml ）。
双月10个地表水，2个创业。
共130个（1600ml ）单倍，50个三倍（250ml ）。
创业的水一个月采两次水样复发酵 EC 培养液胰胨 20 g乳糖 5 g胆盐三号 1.5 g磷酸氢二钾 4 g磷酸二氢钾 1.5 g氯化钠 5 g蒸馏水 1000ml充分混匀后 10ml 分装于试管中，盖紧塞于蒸气锅中灭菌20min （0.1—0.5kpa ），冷却后于药品储存箱保存。
三倍乳糖蛋白胨培养液： 蛋白胨 30 g 牛肉浸膏 9 g 乳糖 15 g 氯化钠 15 g 蒸馏水 1000ml 溴甲基紫乙醇溶液 3 ml（2）做样初发酵：地表水15根管为一个水样。
5根为一组。
第一排为5ml三倍培养液，加10ml水样；第二排为10ml单倍培养液，加1ml水样；第三排为10ml单倍培养液，取1ml水样稀释至10ml后再从中取1ml至装有培养液的试管。
（10、1、0.1的取样量）创业，每个水样15根单倍。
同上逐级稀释，取样量为0.1、0.01、0.001ml。
将初发酵管放入培养箱中培养，温度为37℃±0.5℃，时间为24h±2h。
观察：产酸产气为阳性，即变色且有气泡产生，可轻击试管查气泡。
复发酵：呈阳性的试管进行接种后，做复发酵。
粪大肠菌群的测定步骤
粪大肠菌群的测定1、半个月前配好初、复发酵所需培养液2、采样时用500ml 广口玻璃瓶分开采样，牛皮纸封口3、操作（1） 培养液初发酵 单倍乳糖蛋白胨培养液：蛋白胨 10 g牛肉浸膏 3 g乳糖 5 g氯化钠 5 g蒸馏水 1000ml调节PH 为7.2—7.4（NaOH ）6%溴甲基紫乙醇溶液 1 ml 充分混匀后 10ml （三倍是5ml ）分装于试管中，盖紧塞于蒸气锅中灭菌20min （0.1—0.5kpa ），冷却后于药品储存箱保存。
单月13个地表水（每个水样需10个单倍，5个三倍），2个创业（每个水样需15个单倍）。
共190个（1900ml ）单倍，65个三倍（325ml ）。
双月10个地表水，2个创业。
共130个（1600ml ）单倍，50个三倍（250ml ）。
创业的水一个月采两次水样复发酵 EC 培养液胰胨 20 g乳糖 5 g胆盐三号 1.5 g磷酸氢二钾 4 g磷酸二氢钾 1.5 g氯化钠 5 g蒸馏水 1000ml充分混匀后 10ml 分装于试管中，盖紧塞于蒸气锅中灭菌20min （0.1—0.5kpa ），冷却后于药品储存箱保存。
三倍乳糖蛋白胨培养液： 蛋白胨 30 g 牛肉浸膏 9 g 乳糖 15 g 氯化钠 15 g 蒸馏水 1000ml 溴甲基紫乙醇溶液 3 ml（2）做样初发酵：地表水15根管为一个水样。
5根为一组。
第一排为5ml三倍培养液，加10ml水样；第二排为10ml单倍培养液，加1ml水样；第三排为10ml单倍培养液，取1ml水样稀释至10ml后再从中取1ml至装有培养液的试管。
（10、1、0.1的取样量）创业，每个水样15根单倍。
同上逐级稀释，取样量为0.1、0.01、0.001ml。
将初发酵管放入培养箱中培养，温度为37℃±0.5℃，时间为24h±2h。
观察：产酸产气为阳性，即变色且有气泡产生，可轻击试管查气泡。
复发酵：呈阳性的试管进行接种后，做复发酵。
水中粪大肠菌群的测定
三、实验用品与仪器
1、仪器 无菌工作台、高压蒸汽灭菌锅、生化培养箱、 电炉、天平、分装装置、采水瓶。
2、玻璃器皿： 发酵管及小倒管、培养皿；移液管（1ml和 10ml）；量筒、玻璃珠若干、大烧杯或有刻度 的钢锅1个，锥形瓶4个。
（2）初发酵试验
①将水样分别接种到盛有乳糖蛋白胨培养 液的发酵管中。
② 在 37℃±0.5℃ 下 培 养 24h±2h. 产 酸 和 产气的发酵管表明试验阳性。 在倒管内 产气不明显，可轻拍试管，有小气泡升 起的为阳性。
（3）复发酵试验
①轻微振荡初发试验阳性结果的发酵管，用3mm 接种环或灭菌棒将培养物转接到EC培养液中。
②相对未受污染的水样接种量为 10ml、1ml、 0.1ml。受污染水样接种量根据污染程度接种 1ml 、 0.1ml 、 0.01ml 、 或 0.1ml 、 0.01ml 、 0.001ml等。
③如接种体积为10 ml，则试管内应装有三倍浓 度乳糖蛋白胨培养液5ml；如接种量为1ml或少 于1ml,则可接种于普通浓度的乳糖蛋白胨培养 液10ml中。
②在44.5℃±0.5℃温度下培养24h±2h（水浴箱 的水面应高于试管中培养基液面）。
③接种后所有发酵管必须在30min内放进水浴中。 培养后立即观察，发酵管产气则证实为粪大肠 菌群阳性。
六、实验报告结果的计算
• 根据不同接种量的发酵管所出现阳性结果 的数目，从MPN表中查得相应的MPN指数， 按总大肠菌群的计算方法计算每升水中粪 大肠菌群细菌的MPN值。
粪大肠、总大肠、细菌总数的测定
一、微生物分析的总体要求（一）、采样瓶及玻璃器皿的清洗1、新购置的玻璃器皿，因含游离碱，2%的盐酸浸泡数小时，自来水冲洗，蒸馏水冲洗干净，沥干。
2、培养细菌后的玻璃器皿，应先经高压蒸汽灭菌，趁热倒出培养基，用洗涤剂刷洗干净，自来水冲洗，蒸馏水冲洗干净，沥干。
3、洗涤吸管时可高压蒸汽灭菌30min，用洗涤剂刷洗干净，自来水冲洗，蒸馏水冲洗干净，沥干。
用牛皮纸包好，可干热灭菌（于烘箱中160℃烘150min）和高压蒸汽灭菌（121℃灭菌20min）。
备用。
所有的吸管上端要用少量普通棉花填塞，注意松紧度，取液时使其准确快速的流出）4、洗涤采样瓶时，用刷子刷洗干净，自来水冲洗，蒸馏水冲洗干净，再烘箱烘干，用牛皮纸包好（鸡肠带捆好），可干热灭菌（于烘箱中160℃烘150min）和高压蒸汽灭菌（121℃灭菌20min）5、培养皿：洗净后，用烘箱烘干，用牛皮纸包好进行灭菌，待冷后放入冰箱中备用。
（二）、培养基的制备1、单倍乳糖蛋白胨培养液-液体培养基用量筒量取1000mlUP水，加23g营养物质，沿烧饼边沿搅拌，使其完全溶解。
用移液管移取9ml培养液分装于试管中，用针管将小导管从底部注满营养液，斜扣入试管中，用胶塞塞紧，用牛皮纸每十个进行包扎。
2、三倍乳糖蛋白胨培养液：营养物质加入69g，用移液管移取5ml培养液分装于试管中，用针管将小导管从底部注满营养液，斜扣入试管中，用胶塞塞紧，用牛皮纸每十个进行包扎。
3、EC培养液（配制过程同乳糖蛋白胨培养液）(称取37g)-液体培养基4、无菌水，吸取9ml新鲜UP水于试管中，其余包扎过程同乳糖蛋白胨培养液。
5、上述培养基及无菌水准备好后高压蒸汽灭菌（121℃灭菌20min）。
灭菌后等室温再放入冰箱。
6、伊红美蓝培养基（EMB培养基）(固体培养基-平板)①称取42g营养物质，加入到1000mlUP水中，加热溶解，用三角瓶分装，盖上绵塞，至于高压蒸汽灭菌锅内，121℃灭菌20min。
水质粪大肠菌群的测定
检测报告B&C（2017）字054号标准名称水质粪大肠菌群的测定多管发酵法和滤膜法标准号HJ/T347-2007编制日期2017年9月5日编制人：校核人：审核人：签发人：一、检测依据及设备表1检测方法标准及设备一览表检测类别检测项目方法名称及编号仪器设备名称及型号仪器设备编号水质粪大肠菌群水质粪大肠菌群的测定多管发酵法和滤膜法HJ/T347-2007超净台（）恒温培养箱（）水浴锅（）/二、试剂和材料（1）检测试剂：同HJ/T347-2007中多管发酵法“试剂和材料”配制。
（2）检测样品：2009年9月1日取自遗爱湖1L水样。
三、检测步骤同HJ/T347-2007中多管发酵法“检测步骤”测定。
四、实验结果4.1样品测定根据不同接种量的发酵管所出现阳性结果数目，从表3中查得每升水样中的粪大肠菌群。
4.2实验结果表2多管发酵法测定粪大肠菌群的结果初发酵实验2017年9月1日至2017年9月2日将0.1mL、0.01mL和0.001mL水样分别接种到盛有乳糖蛋白胨培养液的5个10mL发酵管中。
在恒温培养箱中37℃±0.5℃下培养24h±2h。
产酸和产气的发酵管表明试验阳性。
如在倒管内产气不明显，可轻拍试管，有小气泡升起的为阳性。
接种量0.1mL 0.01mL 0.001mL阳性试管数量 4 3 3复发酵实验2017年9月2日至2017年9月3日轻微振荡初发酵试验阳性结果的发酵管，用3mm接种环或灭菌棒将培养物转接到EC培养液中。
在44.5℃±0.5℃温度下培养24h±2h（水浴锅的水面应高于试管中培养基液面）。
接种后所有发酵管必须在30min内放进水浴中。
培养后立即观察，发酵管产气则证实为粪大肠菌群阳性。
阳性试管数量 1 1 0实验结果根据不同接种量的发酵管所出现阳性结果的数目从表3中查得MPN值，由于接种量是0.1mL、0.01mL和0.001mL，所以MPN数应乘以100。
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项目四城镇污水监测
任务7 水中粪大肠菌群的测定（多管发酵法）
单元教学要求
一、教学目标
（粪）大肠菌群是我国环境质量标准和污染物排放标准的重要监测指标，水中粪大肠菌群的测定是环境监测工作中的一项污水监测的核心技能，所涉及的工作任务直接体现在各级环境监测站、城镇污水处理厂、工矿企业环境监测机构等工作岗位上。
目前，多管发酵法是传统的粪大肠菌群检测方法，具有不受浊度的影响、价格便宜等优点。
通过该项目实施使学习者学会水中粪大肠菌群测定的依据、培养基配制、灭菌步骤、培养过程、鉴别方法等，能根据测定结果判断出水是否符合相应排放要求，并能为污水处理工艺运行管理提出合理化建议。
1. 知识目标
（1）掌握粪大肠菌群的数量在卫生学上的重要性；
（2）掌握多管发酵法测定粪大肠菌群的原理及方法。
2. 技能目标
（1）熟练掌握多管发酵法测定粪大肠菌群的试验步骤；
（2）掌握实验室微生物无菌操作的步骤和注意事项。
3. 素质目标
（1）遵守实验室纪律；
（2）培养与组员配合协作的能力。
二、教学条件
（1）主讲教师：有相关专业的学历背景，有从事环境监测及微生物培养工作岗位的经历；并经过高职教育教学的培训，能胜任“教学练做”一体化的教学模式。
（2）教学材料：正式出版的高职类环境监测规划教材、国家环境保护行业标准测定方法及工学结合特色明显的案例。
（3）实验实训设备条件：学习场地、教学设施设备要适应“教、学、练、做”项目化的要求，配置一定的多媒体、仿真、实训场地。
三、教学安排
1.小组课下活动：学习小组查阅关于水中粪大肠菌群测定的资料、相关的标准、技术规范等。
2.课下准备：教师指导，学生实验小组根据国家环境保护行业中关于水中粪大肠菌群的标准测定方法，经讨论分析，确定测定项目。
3.多媒体课上：教师讲解水中粪大肠菌群测定的相关内容，包括测定依据、培养基配制方法、灭菌步骤、培养过程、鉴别方法等。
通过讲解和提问，使学生掌握知识，运用知识发现和解决问题。
4.总结评价：师生点评，学生课下完成作业，小组互相审查批阅，签字给出评语等级，按时上交，老师批阅后下发，师生总结评价。
四、考核评价
1. 教师依据学习者学习的熟练度、规范度、准确度及工作态度（50%）等，并结合汇报表现（20%）、理论考核成绩（25%）、小级评价（5%）等，对学生的水中粪大肠菌群测定的知识、技能进行全面评价。
2. 理论考核重点围绕本教学单元的知识点、技能点进行，融入与水中粪大肠菌群测定相关的国家标准、技术规范、行业职业标准等。
附可供参数理论测试题目及答案：
题目：
（1）粪大肠菌群测定步骤与总大肠菌群测定有什么异同之处？
（2）胆盐在EC培养基中的作用是什么？
（3）为什么在地表水质量标准中改用粪大肠菌群指标代替总大肠菌群？
答案：
（1）粪大肠菌群测定步骤与总大肠菌群测定有什么异同之处？
答案：相同之处：初发酵时，水样都稀释成三个浓度，接种乳糖蛋白胨培养基，在37℃培养24h，对产酸产气者定为初发酵阳性。
不同之处：对粪大肠菌群检测时做复发酵时，接种的培养基（EC培养基）、培养的温度（44.5℃）与大肠菌群检测（乳糖蛋白胨培养基，37℃）不同，但培养时间相同均为24h。
（2）胆盐在EC培养基中的作用是什么？
答案：胆盐是猪或牛的苦胆中提取的，在EC培养基中作用是杀灭粪大肠菌群以外其它杂菌，有利于粪大肠菌群的生长。
（3）为什么在地表水质量标准中改用粪大肠菌群指标代替总大肠菌群？
答案：为了有效控制生活污水对地表水质的影响。
因为已经证明用粪大肠菌群作为卫生学指标比总大肠菌群更有代表性，粪大肠菌群只存在于温血动物的肠道中，而总大肠菌群在某些水质条件下能在水中自行繁殖，不能真实地代表水体受粪便污染的程度。
目前，粪大肠菌群被认为是水体受粪便污染的最实用的指示菌。